科微学术
生物工程学报
ISSN 1000-3061
CN 11-1998/Q
主管单位： 中国科学院 创刊时间：1985年
主办单位： 中国科学院微生物研究所 出版刊期：月刊
中国微生物学会 邮发代号：82-13
主 编： 邓子新 院士 出版日期：每月25日
执行主编： 李寅
收录类型：北大中文核心期刊、中国科技核心期刊、CSCD核心期刊、中国知网、Medline/PubMed、Scopus、AJ、JST、CSA(NS)、IC、EMBASE
主要栏目：综述、动物及兽医生物技术、环境生物技术、工业生物技术、合成生物技术、农业生物技术、医药生物技术、组织工程与细胞培养、生物技术与方法、生物育种与工艺优化、高校生物学教学
- 2023年第39卷第8期
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2023,39(8):3075-3094, DOI: 10.13345/j.cjb.230132
摘要：
蓝细菌是唯一可进行放氧光合作用的原核微生物，基于光合蓝细菌构建“自养型细胞工厂”具有广阔前景。但以蓝细菌作为底盘进行生物燃料及化学品的合成仍存在细胞耐受能力差、产量低等问题，导致实现工业化生产的经济可行性还比较低，亟需通过合成生物学等技术手段构建新的藻株。近年来，实验室适应性进化(adaptive laboratory evolution,ALE)已被用于底盘工程中，实现了优化生长速度、增加耐受性、加强底物利用和提高产品产量等目标。ALE在提高蓝细菌鲁棒性方面取得了一定进展，已获得了耐受高光、重金属离子、高盐和高浓度有机溶剂胁迫的进化藻株。但是，蓝细菌中的ALE策略效率相对较低，耐受各胁迫的分子机制并未阐释完全。本文综述了ALE相关技术策略及其在蓝细菌底盘工程中的应用，讨论了如何借鉴其他微生物中ALE手段，构建更大ALE突变文库、增加菌株的突变频率、缩短进化时间、探索多重胁迫耐受工程菌构建原则及研究策略等，高效解析进化菌株的突变体库，构建高产量、鲁棒性强的工程菌株等，以期未来促进蓝细菌底盘的改造及其工程菌的规模化应用。
蓝细菌是唯一可进行放氧光合作用的原核微生物，基于光合蓝细菌构建“自养型细胞工厂”具有广阔前景。但以蓝细菌作为底盘进行生物燃料及化学品的合成仍存在细胞耐受能力差、产量低等问题，导致实现工业化生产的经济可行性还比较低，亟需通过合成生物学等技术手段构建新的藻株。近年来，实验室适应性进化(adaptive laboratory evolution,ALE)已被用于底盘工程中，实现了优化生长速度、增加耐受性、加强底物利用和提高产品产量等目标。ALE在提高蓝细菌鲁棒性方面取得了一定进展，已获得了耐受高光、重金属离子、高盐和高浓度有机溶剂胁迫的进化藻株。但是，蓝细菌中的ALE策略效率相对较低，耐受各胁迫的分子机制并未阐释完全。本文综述了ALE相关技术策略及其在蓝细菌底盘工程中的应用，讨论了如何借鉴其他微生物中ALE手段，构建更大ALE突变文库、增加菌株的突变频率、缩短进化时间、探索多重胁迫耐受工程菌构建原则及研究策略等，高效解析进化菌株的突变体库，构建高产量、鲁棒性强的工程菌株等，以期未来促进蓝细菌底盘的改造及其工程菌的规模化应用。
2023,39(8):3095-3110, DOI: 10.13345/j.cjb.220994
摘要：
他克莫司(FK506)是一种具有免疫抑制活性的23元大环内酯类化合物，临床上广泛用于防止器官移植术后的免疫排斥反应。生物合成法是他克莫司制备方法的研究热点，但他克莫司生物合成的研究还存在一定生产技术上的瓶颈。基于此，本文主要从他克莫司代谢途径改造和发酵过程控制等方面对他克莫司生物合成进展进行综述，以期为今后突破他克莫司生物合成的技术瓶颈提供参考，进而利用代谢工程、发酵工程等技术提升他克莫司的生物合成水平。
他克莫司(FK506)是一种具有免疫抑制活性的23元大环内酯类化合物，临床上广泛用于防止器官移植术后的免疫排斥反应。生物合成法是他克莫司制备方法的研究热点，但他克莫司生物合成的研究还存在一定生产技术上的瓶颈。基于此，本文主要从他克莫司代谢途径改造和发酵过程控制等方面对他克莫司生物合成进展进行综述，以期为今后突破他克莫司生物合成的技术瓶颈提供参考，进而利用代谢工程、发酵工程等技术提升他克莫司的生物合成水平。
2023,39(8):3111-3124, DOI: 10.13345/j.cjb.230052
摘要：
L-高苯丙氨酸(L-homophenylalanine,L-HPA)作为一种重要的非天然氨基酸，是合成治疗高血压的普利类药物等的关键中间体，具有广阔的市场前景。目前L-高苯丙氨酸的合成主要依赖于化学法，但化学合成L-高苯丙氨酸具有原料昂贵、步骤繁琐和污染严重等缺点，限制了广泛应用。因此，国内外研究者对L-高苯丙氨酸的酶法生产进行了深入的研究。本文就目前酶法合成L-高苯丙氨酸的工艺，包括脱氢酶法、转氨酶法、海因酶法和脱羧酶法的研究进展进行了综述，为酶法合成L-高苯丙氨酸提供一定的借鉴，为最终实现L-高苯丙氨酸的酶法工业化生产奠定基础。
L-高苯丙氨酸(L-homophenylalanine,L-HPA)作为一种重要的非天然氨基酸，是合成治疗高血压的普利类药物等的关键中间体，具有广阔的市场前景。目前L-高苯丙氨酸的合成主要依赖于化学法，但化学合成L-高苯丙氨酸具有原料昂贵、步骤繁琐和污染严重等缺点，限制了广泛应用。因此，国内外研究者对L-高苯丙氨酸的酶法生产进行了深入的研究。本文就目前酶法合成L-高苯丙氨酸的工艺，包括脱氢酶法、转氨酶法、海因酶法和脱羧酶法的研究进展进行了综述，为酶法合成L-高苯丙氨酸提供一定的借鉴，为最终实现L-高苯丙氨酸的酶法工业化生产奠定基础。
2023,39(8):3125-3142, DOI: 10.13345/j.cjb.220738
摘要：
一碳气体主要包括CO、CO2和CH4等，这些气体来源于陆地生物活动、工业废气以及气化合成气等，其中CO2与CH4是温室气体，对全球气候变化有着重要的影响。利用微生物进行一碳气体生物转化既可以解决废气排放的问题，又能生产燃料及多种化学品。近年来，运用CRISPR/Cas9等基因编辑技术对一碳气体利用微生物进行改造，是提高它们的产物得率、增加产物类型的重要途径。本文主要围绕甲烷营养菌、自养乙酸菌、一氧化碳营养菌等一碳气体利用微生物，综述了其生物学特性、好氧和厌氧代谢途径、代谢产物，以及常用的基因编辑技术(利用同源重组的基因中断技术、二类内含子ClosTron法、CRISPR/Cas基因编辑及以噬菌体重组酶介导的DNA大片段引入等)在它们中的应用，为后续相关研究提供参考。
一碳气体主要包括CO、CO2和CH4等，这些气体来源于陆地生物活动、工业废气以及气化合成气等，其中CO2与CH4是温室气体，对全球气候变化有着重要的影响。利用微生物进行一碳气体生物转化既可以解决废气排放的问题，又能生产燃料及多种化学品。近年来，运用CRISPR/Cas9等基因编辑技术对一碳气体利用微生物进行改造，是提高它们的产物得率、增加产物类型的重要途径。本文主要围绕甲烷营养菌、自养乙酸菌、一氧化碳营养菌等一碳气体利用微生物，综述了其生物学特性、好氧和厌氧代谢途径、代谢产物，以及常用的基因编辑技术(利用同源重组的基因中断技术、二类内含子ClosTron法、CRISPR/Cas基因编辑及以噬菌体重组酶介导的DNA大片段引入等)在它们中的应用，为后续相关研究提供参考。
2023,39(8):3143-3168, DOI: 10.13345/j.cjb.220990
摘要：
酶催化CO2还原制备高值化学品对缓解全球环境和能源危机具有重要意义，利用甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)或多酶级联还原CO2制备甲酸/甲醇具有选择性高、条件温和的优势，但关键酶活性低、稳定性差和重复利用率低的问题限制了其规模化应用，酶的固定化为这些问题提供了有效解决方案。本文总结了近年来利用膜、无机材料、金属有机框架和共价有机框架等载体对酶进行固定化的研究进展，阐释了不同固定材料和固定方式的特点和优势；进一步总结了固定化酶与电催化或光催化耦联反应体系对CO2还原的协同效果及应用，同时指出酶固定化技术和耦联反应体系目前存在的问题并对其发展前景进行了展望。
酶催化CO2还原制备高值化学品对缓解全球环境和能源危机具有重要意义，利用甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase,FDH)或多酶级联还原CO2制备甲酸/甲醇具有选择性高、条件温和的优势，但关键酶活性低、稳定性差和重复利用率低的问题限制了其规模化应用，酶的固定化为这些问题提供了有效解决方案。本文总结了近年来利用膜、无机材料、金属有机框架和共价有机框架等载体对酶进行固定化的研究进展，阐释了不同固定材料和固定方式的特点和优势；进一步总结了固定化酶与电催化或光催化耦联反应体系对CO2还原的协同效果及应用，同时指出酶固定化技术和耦联反应体系目前存在的问题并对其发展前景进行了展望。
2023,39(8):3169-3187, DOI: 10.13345/j.cjb.220908
摘要：
ω-转氨酶能够催化氨基在氨基酸、烷胺、芳香胺等多种氨基化合物和醛、酮、酮酸等羰基化合物之间的可逆转移。由于其底物范围广、立体选择性高、催化条件温和等特点，ω-转氨酶已在手性胺绿色生物合成中展现了巨大应用前景。开发高效、特异、环保且具有自主知识产权的手性胺合成应用技术，对我国医药、农药、材料产业的发展具有重要意义。本文从应用技术角度，对近10年来我国机构报道的ω-转氨酶相关中国专利进行了系统分析，重点从ω-转氨酶资源开发、酶性能的蛋白工程改造、在手性胺合成中的应用现状、催化转化技术工艺4个方面对我国ω-转氨酶在手性胺生物合成领域的研究进展进行阐述，以期为ω-转氨酶基础理论的深入研究和相关应用技术的推广提供参考。
ω-转氨酶能够催化氨基在氨基酸、烷胺、芳香胺等多种氨基化合物和醛、酮、酮酸等羰基化合物之间的可逆转移。由于其底物范围广、立体选择性高、催化条件温和等特点，ω-转氨酶已在手性胺绿色生物合成中展现了巨大应用前景。开发高效、特异、环保且具有自主知识产权的手性胺合成应用技术，对我国医药、农药、材料产业的发展具有重要意义。本文从应用技术角度，对近10年来我国机构报道的ω-转氨酶相关中国专利进行了系统分析，重点从ω-转氨酶资源开发、酶性能的蛋白工程改造、在手性胺合成中的应用现状、催化转化技术工艺4个方面对我国ω-转氨酶在手性胺生物合成领域的研究进展进行阐述，以期为ω-转氨酶基础理论的深入研究和相关应用技术的推广提供参考。
2023,39(8):3188-3203, DOI: 10.13345/j.cjb.220892
摘要：
群集运动(swarming motility)是细菌以群体方式协调性地依靠鞭毛和Ⅳ型菌毛(type Ⅳ pili,TFP)在半固体表面共同运动，是一种典型的协同运动。群集运动因其与生物被膜、子实体的形成、病原体的侵入和微生物的扩散及共生等过程都有着密切的关系而备受人们的关注，是当前微生物领域的一个研究热点。人们对细菌群集运动开展了大量的研究，包括群集运动中关键蛋白表达的变化、细胞间化学交流的变化以及机械性变化等。鞭毛蛋白的表达以及胞内环二鸟苷酸(cyclic diguanosine monophosphate,c-di-GMP)的水平等会对群集运动产生一定的影响，在菌落中复杂地调控着细菌集体行为；群集运动细胞独特的物理性质表现有益于菌落整体的扩张；细菌周围生长环境中的营养和水分含量等因素也在不同程度上影响细菌群集运动的能力。未来，在解析群集运动分子机制的基础上，如何构建一个统一的群集运动模型成为该领域研究面临的一个挑战。
群集运动(swarming motility)是细菌以群体方式协调性地依靠鞭毛和Ⅳ型菌毛(type Ⅳ pili,TFP)在半固体表面共同运动，是一种典型的协同运动。群集运动因其与生物被膜、子实体的形成、病原体的侵入和微生物的扩散及共生等过程都有着密切的关系而备受人们的关注，是当前微生物领域的一个研究热点。人们对细菌群集运动开展了大量的研究，包括群集运动中关键蛋白表达的变化、细胞间化学交流的变化以及机械性变化等。鞭毛蛋白的表达以及胞内环二鸟苷酸(cyclic diguanosine monophosphate,c-di-GMP)的水平等会对群集运动产生一定的影响，在菌落中复杂地调控着细菌集体行为；群集运动细胞独特的物理性质表现有益于菌落整体的扩张；细菌周围生长环境中的营养和水分含量等因素也在不同程度上影响细菌群集运动的能力。未来，在解析群集运动分子机制的基础上，如何构建一个统一的群集运动模型成为该领域研究面临的一个挑战。
2023,39(8):3204-3218, DOI: 10.13345/j.cjb.230042
摘要：
甾醇是一类广泛存在于生物体内的环戊烷骈多氢菲衍生物，其不仅是细胞膜的重要组成成分，还具有重要的生理和药理活性。随着合成生物学和代谢工程技术的发展，近些年来应用酵母细胞异源合成甾醇的研究不断深入。但由于甾醇是疏水性大分子，倾向于积累在酵母的膜结构中而引发细胞毒性，一定程度上限制了甾醇产量的进一步提升。因此，揭示酵母中甾醇转运机制，特别是与甾醇转运相关的转运蛋白的工作原理，有助于设计新的策略，解除酵母细胞工厂中的甾醇积累毒性、实现甾醇增产。酵母中甾醇转运主要通过蛋白质介导的非囊泡运输机制来完成，本文归纳了酵母中已报道的5类甾醇转运相关蛋白，即OSBP/ORPs家族蛋白、LAM家族蛋白、NPC样甾醇转运蛋白、ABC转运家族蛋白和CAP超家族蛋白，汇总了这些蛋白对细胞内甾醇梯度分布和稳态维持所起的重要作用。此外，本文还综述了甾醇转运蛋白在酵母细胞工厂中的应用现状。
甾醇是一类广泛存在于生物体内的环戊烷骈多氢菲衍生物，其不仅是细胞膜的重要组成成分，还具有重要的生理和药理活性。随着合成生物学和代谢工程技术的发展，近些年来应用酵母细胞异源合成甾醇的研究不断深入。但由于甾醇是疏水性大分子，倾向于积累在酵母的膜结构中而引发细胞毒性，一定程度上限制了甾醇产量的进一步提升。因此，揭示酵母中甾醇转运机制，特别是与甾醇转运相关的转运蛋白的工作原理，有助于设计新的策略，解除酵母细胞工厂中的甾醇积累毒性、实现甾醇增产。酵母中甾醇转运主要通过蛋白质介导的非囊泡运输机制来完成，本文归纳了酵母中已报道的5类甾醇转运相关蛋白，即OSBP/ORPs家族蛋白、LAM家族蛋白、NPC样甾醇转运蛋白、ABC转运家族蛋白和CAP超家族蛋白，汇总了这些蛋白对细胞内甾醇梯度分布和稳态维持所起的重要作用。此外，本文还综述了甾醇转运蛋白在酵母细胞工厂中的应用现状。
2023,39(8):3219-3235, DOI: 10.13345/j.cjb.230069
摘要：
聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)是应用最广泛的合成聚酯之一。由于PET不易降解，在环境中积累，对陆地、水生生态系统以及人类健康构成严重威胁。基于生物酶催化的生物降解策略为PET回收利用提供了一种绿色途径，在过去20年间，已发现了多种PET水解酶，并通过蛋白质工程等手段来改善这些酶的降解性能，但是目前仍未找到适合大规模工业应用的PET水解酶。利用传统的检测方法筛选PET水解酶是一个缓慢而复杂的过程。为了促进PET酶法回收的工业化应用，需要研发高效的检测方法。近年来，研究人员开发了多种表征PET水解酶的分析方法。本文总结了可用于筛选PET水解酶的检测方法，如高效液相色谱法、紫外吸光度法和荧光激活液滴分选法等，并对其在筛选PET水解酶的应用方面进行了展望。
聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate,PET)是应用最广泛的合成聚酯之一。由于PET不易降解，在环境中积累，对陆地、水生生态系统以及人类健康构成严重威胁。基于生物酶催化的生物降解策略为PET回收利用提供了一种绿色途径，在过去20年间，已发现了多种PET水解酶，并通过蛋白质工程等手段来改善这些酶的降解性能，但是目前仍未找到适合大规模工业应用的PET水解酶。利用传统的检测方法筛选PET水解酶是一个缓慢而复杂的过程。为了促进PET酶法回收的工业化应用，需要研发高效的检测方法。近年来，研究人员开发了多种表征PET水解酶的分析方法。本文总结了可用于筛选PET水解酶的检测方法，如高效液相色谱法、紫外吸光度法和荧光激活液滴分选法等，并对其在筛选PET水解酶的应用方面进行了展望。
2023,39(8):3236-3252, DOI: 10.13345/j.cjb.221020
摘要：
琥珀酸作为一种重要的C4平台化合物，广泛应用于食品、化学、医药等领域。利用大肠杆菌(Escherichia coli)发酵生产琥珀酸受胞内辅因子不平衡的影响，存在产率低、生产强度低、副产物多等问题。为此，对不同氧气条件下琥珀酸产量和化学计量学分析发现，微厌氧条件下E. coli FMME-N-26高效积累琥珀酸需要借助三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA)为还原性三羧酸途径(reductive tricarboxylic acid pathway,r-TCA)提供足够的ATP和NADH。通过减少ATP消耗、强化ATP合成、阻断NADH竞争途径和构建NADH回补路径等代谢工程策略，组合调控胞内ATP与NADH含量，获得工程菌株E. coli FW-17。通过发酵条件优化，菌株E. coli FW-17在5 L发酵罐能积累139.52 g/L琥珀酸，比出发菌株提高了17.81%，乙酸浓度为1.40 g/L，降低了67.59%。进一步在1 000 L发酵罐中进行放大实验，琥珀酸产量和乙酸浓度分别为140.2 g/L和1.38 g/L。
琥珀酸作为一种重要的C4平台化合物，广泛应用于食品、化学、医药等领域。利用大肠杆菌(Escherichia coli)发酵生产琥珀酸受胞内辅因子不平衡的影响，存在产率低、生产强度低、副产物多等问题。为此，对不同氧气条件下琥珀酸产量和化学计量学分析发现，微厌氧条件下E. coli FMME-N-26高效积累琥珀酸需要借助三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TCA)为还原性三羧酸途径(reductive tricarboxylic acid pathway,r-TCA)提供足够的ATP和NADH。通过减少ATP消耗、强化ATP合成、阻断NADH竞争途径和构建NADH回补路径等代谢工程策略，组合调控胞内ATP与NADH含量，获得工程菌株E. coli FW-17。通过发酵条件优化，菌株E. coli FW-17在5 L发酵罐能积累139.52 g/L琥珀酸，比出发菌株提高了17.81%，乙酸浓度为1.40 g/L，降低了67.59%。进一步在1 000 L发酵罐中进行放大实验，琥珀酸产量和乙酸浓度分别为140.2 g/L和1.38 g/L。
2023,39(8):3253-3272, DOI: 10.13345/j.cjb.220998
摘要：
L-缬氨酸作为一种支链氨基酸，广泛应用于医药和饲料等领域。本研究借助多种代谢工程策略相结合的方法，构建了生产L-缬氨酸的微生物细胞工厂，实现了L-缬氨酸的高效生产。首先，通过增强糖酵解途径、减弱副产物代谢途径相结合的方式，强化了L-缬氨酸合成前体丙酮酸的供给；其次，针对L-缬氨酸合成路径关键酶—乙酰羟酸合酶进行定点突变，提高了菌株的抗反馈抑制能力，并利用启动子工程策略，优化了路径关键酶的基因表达水平；最后，利用辅因子工程策略，改变了乙酰羟酸还原异构酶和支链氨基酸转氨酶的辅因子偏好性，由偏好NADPH转变为偏好NADH，从而提高了L-缬氨酸的合成能力。在5 L发酵罐中，最优谷氨酸棒杆菌工程菌株Corynebacterium glutamicum K020的L-缬氨酸产量、得率和生产强度分别达到了110 g/L、0.51 g/g和2.29 g/(L·h)。
L-缬氨酸作为一种支链氨基酸，广泛应用于医药和饲料等领域。本研究借助多种代谢工程策略相结合的方法，构建了生产L-缬氨酸的微生物细胞工厂，实现了L-缬氨酸的高效生产。首先，通过增强糖酵解途径、减弱副产物代谢途径相结合的方式，强化了L-缬氨酸合成前体丙酮酸的供给；其次，针对L-缬氨酸合成路径关键酶—乙酰羟酸合酶进行定点突变，提高了菌株的抗反馈抑制能力，并利用启动子工程策略，优化了路径关键酶的基因表达水平；最后，利用辅因子工程策略，改变了乙酰羟酸还原异构酶和支链氨基酸转氨酶的辅因子偏好性，由偏好NADPH转变为偏好NADH，从而提高了L-缬氨酸的合成能力。在5 L发酵罐中，最优谷氨酸棒杆菌工程菌株Corynebacterium glutamicum K020的L-缬氨酸产量、得率和生产强度分别达到了110 g/L、0.51 g/g和2.29 g/(L·h)。
2023,39(8):3273-3289, DOI: 10.13345/j.cjb.230018
摘要：
L-谷氨酸是世界上第一大宗氨基酸产品，广泛应用于食品医药及化工等行业。以谷氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) G01为出发菌株，首先通过敲除主要副产物丙氨酸合成相关基因-丙氨酸氨基转移酶编码基因(alaT)，降低了发酵副产物丙氨酸含量。其次，α-酮戊二酸节点碳流量对谷氨酸合成起重要作用，因此，采用核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)序列优化降低了α-酮戊二酸脱氢酶的活性，强化了谷氨酸合成代谢流。同时通过筛选不同来源的谷氨酸脱氢酶，加强了α-酮戊二酸内源转化为谷氨酸的能力。接着，对谷氨酸转运蛋白进行理性设计，提高了谷氨酸的外排能力。最后，对基于以上策略构建的整合菌株进行了5 L发酵罐发酵优化，通过梯度升温结合分批补料策略，谷氨酸产量为(136.33±4.68) g/L，较原始菌的产量(96.53±2.32) g/L提高了41.2%；糖酸转化率为55.8%，较原始菌的44.2%提高了11.6%；且降低了副产物丙氨酸的含量。以上策略一定程度上提高了谷氨酸的产量与糖酸转化率，可为谷氨酸生产菌株的代谢改造提供参考。
L-谷氨酸是世界上第一大宗氨基酸产品，广泛应用于食品医药及化工等行业。以谷氨酸高产菌谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) G01为出发菌株，首先通过敲除主要副产物丙氨酸合成相关基因-丙氨酸氨基转移酶编码基因(alaT)，降低了发酵副产物丙氨酸含量。其次，α-酮戊二酸节点碳流量对谷氨酸合成起重要作用，因此，采用核糖体结合位点(ribosome-binding site,RBS)序列优化降低了α-酮戊二酸脱氢酶的活性，强化了谷氨酸合成代谢流。同时通过筛选不同来源的谷氨酸脱氢酶，加强了α-酮戊二酸内源转化为谷氨酸的能力。接着，对谷氨酸转运蛋白进行理性设计，提高了谷氨酸的外排能力。最后，对基于以上策略构建的整合菌株进行了5 L发酵罐发酵优化，通过梯度升温结合分批补料策略，谷氨酸产量为(136.33±4.68) g/L，较原始菌的产量(96.53±2.32) g/L提高了41.2%；糖酸转化率为55.8%，较原始菌的44.2%提高了11.6%；且降低了副产物丙氨酸的含量。以上策略一定程度上提高了谷氨酸的产量与糖酸转化率，可为谷氨酸生产菌株的代谢改造提供参考。
2023,39(8):3290-3301, DOI: 10.13345/j.cjb.230264
摘要：
水杨酸葡萄糖苷(salicylate 2-O-β-d-glucoside,SAG)，是植物中水杨酸的一种存在形式。水杨酸葡萄糖苷也具有消炎止痛的作用，和水杨酸、阿司匹林对比，表现出更小的刺激性，是一种具有潜力的消炎护肤物质。通过生物法利用可再生资源进行水杨酸类物质的生产方式，与传统工业法生产相比对环境更加友好。本研究以大肠杆菌(Escherichia coli) Tyr002作为出发菌株，引入铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)异分支酸裂解酶基因pchB，首先构建了大肠杆菌水杨酸生产菌株。通过调控下游不同芳香族氨基酸代谢途径关键基因表达，菌株摇瓶发酵水杨酸产量达到1.05 g/L。之后，通过在水杨酸生产菌株中引入植物来源水杨酸糖基转移酶，对水杨酸进行糖苷化修饰。新构建的菌株摇瓶发酵水杨酸葡萄糖苷产量达到5.7 g/L。在5 L发酵罐分批补料发酵中，水杨酸葡萄糖苷的产量达到36.5 g/L，是目前报道的最高产量。本研究为水杨酸类化合物的微生物合成提供了重要参考。
水杨酸葡萄糖苷(salicylate 2-O-β-d-glucoside,SAG)，是植物中水杨酸的一种存在形式。水杨酸葡萄糖苷也具有消炎止痛的作用，和水杨酸、阿司匹林对比，表现出更小的刺激性，是一种具有潜力的消炎护肤物质。通过生物法利用可再生资源进行水杨酸类物质的生产方式，与传统工业法生产相比对环境更加友好。本研究以大肠杆菌(Escherichia coli) Tyr002作为出发菌株，引入铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)异分支酸裂解酶基因pchB，首先构建了大肠杆菌水杨酸生产菌株。通过调控下游不同芳香族氨基酸代谢途径关键基因表达，菌株摇瓶发酵水杨酸产量达到1.05 g/L。之后，通过在水杨酸生产菌株中引入植物来源水杨酸糖基转移酶，对水杨酸进行糖苷化修饰。新构建的菌株摇瓶发酵水杨酸葡萄糖苷产量达到5.7 g/L。在5 L发酵罐分批补料发酵中，水杨酸葡萄糖苷的产量达到36.5 g/L，是目前报道的最高产量。本研究为水杨酸类化合物的微生物合成提供了重要参考。
2023,39(8):3302-3317, DOI: 10.13345/j.cjb.230138
摘要：
L-甲硫氨酸又名L-蛋氨酸，是人体必需8种氨基酸之一，在饲料、医药、食品领域具有重要应用。以实验室前期构建的M2(Escherichia coli W3110∆IJAHFEBC/PAM)为出发菌株，以模块化代谢工程策略构建了一株L-甲硫氨酸高产菌株。首先通过过表达亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MetF)和筛选不同来源的丝氨酸羟甲基转移酶(hydroxymethyltransferase,GlyA)，增强了一碳模块甲基供体的生成，优化了一碳模块。随后针对一碳模块的前体供应，过表达了胱醚裂解酶(cysteamine lyase,MalY)和半胱氨酸内运基因(fliY)，有效地提高了L-高半胱氨酸和L-半胱氨酸的供应。最终摇瓶发酵L-甲硫氨酸的产量由2.8 g/L提高至4.05 g/L，5 L发酵罐中达到18.26 g/L。研究结果表明，一碳模块对L-甲硫氨酸的生物合成具有十分重要的影响，在细胞内通过优化一碳模块，可以实现L-甲硫氨酸的高效生物合成。本研究为进一步提高微生物发酵生产L-甲硫氨酸的水平奠定了基础。
L-甲硫氨酸又名L-蛋氨酸，是人体必需8种氨基酸之一，在饲料、医药、食品领域具有重要应用。以实验室前期构建的M2(Escherichia coli W3110∆IJAHFEBC/PAM)为出发菌株，以模块化代谢工程策略构建了一株L-甲硫氨酸高产菌株。首先通过过表达亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MetF)和筛选不同来源的丝氨酸羟甲基转移酶(hydroxymethyltransferase,GlyA)，增强了一碳模块甲基供体的生成，优化了一碳模块。随后针对一碳模块的前体供应，过表达了胱醚裂解酶(cysteamine lyase,MalY)和半胱氨酸内运基因(fliY)，有效地提高了L-高半胱氨酸和L-半胱氨酸的供应。最终摇瓶发酵L-甲硫氨酸的产量由2.8 g/L提高至4.05 g/L，5 L发酵罐中达到18.26 g/L。研究结果表明，一碳模块对L-甲硫氨酸的生物合成具有十分重要的影响，在细胞内通过优化一碳模块，可以实现L-甲硫氨酸的高效生物合成。本研究为进一步提高微生物发酵生产L-甲硫氨酸的水平奠定了基础。
2023,39(8):3318-3335, DOI: 10.13345/j.cjb.230016
摘要：
三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)是一种重要的辅助因子，参与许多需能的生物催化反应。多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinases,PPK)由于其底物聚磷酸盐廉价易得，可以为消耗ATP的反应提供能量。本研究选择哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)来源的ChPPK，进行了底物谱和耐受性分析，通过分子对接和定点突变，理性改造多聚磷酸盐激酶的双底物通道腔来提高PPK酶的催化活性。与野生型相比，筛选得到突变体ChPPKK81H-K103V的相对酶活提高了326.7%，同时，双突变扩大了ChPPK的底物利用范围与耐受性，提高了该酶的耐热性与耐碱性。基于该ATP再生系统，本研究偶联谷胱甘肽双功能酶GshAB和ChPPKK81H-K103V，破细胞后采用无细胞催化生产谷胱甘肽，加入5 mmol/L ATP后，该体系6 h可以生产(25.4±1.9) mmol/L的谷胱甘肽，比突变前的催化体系提高了41.9%。优化无细胞催化体系的缓冲液、裂解液菌体量、补料时间后，无细胞体系可产生(45.2±1.8) mmol/L谷胱甘肽，底物l-半胱氨酸的转化率达到90.4%。提高ChPPK生产ATP的能力，可有效增强底物的转化率，降低催化成本，实现了无细胞催化生产谷胱甘肽的高产量、高转化率与高经济价值的统一。本研究提供了一种绿色高效的ATP再生系统，可为消耗ATP的生物催化反应平台提供可持续动力。
三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)是一种重要的辅助因子，参与许多需能的生物催化反应。多聚磷酸盐激酶(polyphosphate kinases,PPK)由于其底物聚磷酸盐廉价易得，可以为消耗ATP的反应提供能量。本研究选择哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii)来源的ChPPK，进行了底物谱和耐受性分析，通过分子对接和定点突变，理性改造多聚磷酸盐激酶的双底物通道腔来提高PPK酶的催化活性。与野生型相比，筛选得到突变体ChPPKK81H-K103V的相对酶活提高了326.7%，同时，双突变扩大了ChPPK的底物利用范围与耐受性，提高了该酶的耐热性与耐碱性。基于该ATP再生系统，本研究偶联谷胱甘肽双功能酶GshAB和ChPPKK81H-K103V，破细胞后采用无细胞催化生产谷胱甘肽，加入5 mmol/L ATP后，该体系6 h可以生产(25.4±1.9) mmol/L的谷胱甘肽，比突变前的催化体系提高了41.9%。优化无细胞催化体系的缓冲液、裂解液菌体量、补料时间后，无细胞体系可产生(45.2±1.8) mmol/L谷胱甘肽，底物l-半胱氨酸的转化率达到90.4%。提高ChPPK生产ATP的能力，可有效增强底物的转化率，降低催化成本，实现了无细胞催化生产谷胱甘肽的高产量、高转化率与高经济价值的统一。本研究提供了一种绿色高效的ATP再生系统，可为消耗ATP的生物催化反应平台提供可持续动力。
2023,39(8):3336-3350, DOI: 10.13345/j.cjb.220858
摘要：
玉米赤霉烯酮是世界上污染最为广泛的一种镰刀菌(Fusarium)毒素，严重危害牲畜以及人类的健康。来源于粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)的玉米赤霉烯酮水解酶(zearalenone hydrolase,ZHD)能有效降解饲料中的玉米赤霉烯酮，然而饲料加工中的高温环境限制了该酶的应用。基于结构特征的理性设计可为酶的热稳定性改造提供指导。本研究首先基于蛋白质结构比对(multiple structure alignment,MSTA)筛选ZHD的结构灵活区，随后基于序列保守性打分以及构象自由能计算设计突变文库，得到基于136号和220号残基的9个单点突变设计。结果表明，9个突变体的热熔融温度(Tm)提高了0.4–5.6℃，其中S220R和S220W热稳定性表现最好，Tm分别提高了5.6℃和4.0℃，45℃下的热半失活时间分别延长了15.4倍和3.1倍，相对酶活分别为野生型的70.6%和57.3%。分子动力学模拟分析表明突变位点及附近区域的作用力得到了增强，突变体S220R和S220W的220-K130氢键成键概率分别增加了37.1%和19.3%、K130-D223盐桥成键概率分别增加了30.1%和12.5%，为ZHD热稳定性的提高作出了贡献。这项工作表明结合天然酶的结构比对、序列分析及自由能计算的热稳定性改造策略的可行性，并获得了热稳定性增强的ZHD变体，为ZHD在工业上的应用打下基础。
玉米赤霉烯酮是世界上污染最为广泛的一种镰刀菌(Fusarium)毒素，严重危害牲畜以及人类的健康。来源于粉红螺旋聚孢霉(Clonostachys rosea)的玉米赤霉烯酮水解酶(zearalenone hydrolase,ZHD)能有效降解饲料中的玉米赤霉烯酮，然而饲料加工中的高温环境限制了该酶的应用。基于结构特征的理性设计可为酶的热稳定性改造提供指导。本研究首先基于蛋白质结构比对(multiple structure alignment,MSTA)筛选ZHD的结构灵活区，随后基于序列保守性打分以及构象自由能计算设计突变文库，得到基于136号和220号残基的9个单点突变设计。结果表明，9个突变体的热熔融温度(Tm)提高了0.4–5.6℃，其中S220R和S220W热稳定性表现最好，Tm分别提高了5.6℃和4.0℃，45℃下的热半失活时间分别延长了15.4倍和3.1倍，相对酶活分别为野生型的70.6%和57.3%。分子动力学模拟分析表明突变位点及附近区域的作用力得到了增强，突变体S220R和S220W的220-K130氢键成键概率分别增加了37.1%和19.3%、K130-D223盐桥成键概率分别增加了30.1%和12.5%，为ZHD热稳定性的提高作出了贡献。这项工作表明结合天然酶的结构比对、序列分析及自由能计算的热稳定性改造策略的可行性，并获得了热稳定性增强的ZHD变体，为ZHD在工业上的应用打下基础。
2023,39(8):3351-3363, DOI: 10.13345/j.cjb.220996
摘要：
聚羟基脂肪酸酯解聚酶(polyhydroxyalkanoate depolymerase,PHAD)可用于聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate,PHA)的降解回收，为开发热稳定性好的PHAD，本研究在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中成功表达了来自短须嗜热单孢菌(Thermomonospora umbrina)的PHA解聚酶(TumPHAD)，并通过二硫键理性设计获得了热稳定性提升的突变体A190C/V240C，其最适温度为60℃，比野生型提高20℃，50℃半衰期为7 h，是野生型酶的21倍。将突变体A190C/V240C用于典型PHA之一的聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate,PHB)降解，在50℃条件下，PHB的2 h和12 h降解率较野生型分别提高了2.1倍和3.8倍。本研究获得的TumPHAD突变体A190C/V240C具有耐高温、热稳定性好和PHB降解能力强的特点，对PHB的降解回收具有重要意义。
聚羟基脂肪酸酯解聚酶(polyhydroxyalkanoate depolymerase,PHAD)可用于聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate,PHA)的降解回收，为开发热稳定性好的PHAD，本研究在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中成功表达了来自短须嗜热单孢菌(Thermomonospora umbrina)的PHA解聚酶(TumPHAD)，并通过二硫键理性设计获得了热稳定性提升的突变体A190C/V240C，其最适温度为60℃，比野生型提高20℃，50℃半衰期为7 h，是野生型酶的21倍。将突变体A190C/V240C用于典型PHA之一的聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate,PHB)降解，在50℃条件下，PHB的2 h和12 h降解率较野生型分别提高了2.1倍和3.8倍。本研究获得的TumPHAD突变体A190C/V240C具有耐高温、热稳定性好和PHB降解能力强的特点，对PHB的降解回收具有重要意义。
2023,39(8):3364-3378, DOI: 10.13345/j.cjb.230142
摘要：
由于各种疾病在全球范围内的肆虐，国际市场对重组腺病毒载体(adenoviral vector,Adv)疫苗的需求量急剧增加，而工艺研究是解决这一问题的有效手段之一。在细胞接毒前施加高渗胁迫可以提高分批培养模式下的Adv产量，新兴的灌流培养也可以显著提高Adv的产量。将高渗胁迫工艺与灌流培养相结合，有望进一步提升高细胞密度生产过程中的Adv产量。本研究利用摇瓶结合拟灌流培养作为生物反应器灌流培养的缩小模型，使用渗透压为300–405 mOsm的培养基研究了高渗胁迫对细胞生长和Adv生产的影响。结果显示，在细胞生长阶段使用370 mOsm的高渗透压培养基，在病毒生产阶段使用300 mOsm的等渗透压培养基的灌流培养工艺有效地提高了Adv的产量。进一步研究发现这可能归因于病毒复制后期HSP70蛋白的表达量增加。将这种工艺放大至生物反应器中，Adv的产量达到3.2×1010 IFU/mL，是传统灌流培养工艺的3倍。本研究首次将高渗胁迫工艺与灌流培养相结合的策略应用于HEK 293细胞生产Adv，同时揭示了高渗胁迫工艺增产Adv的可能原因，为HEK 293细胞生产其他类型Adv的工艺优化提供了借鉴。
由于各种疾病在全球范围内的肆虐，国际市场对重组腺病毒载体(adenoviral vector,Adv)疫苗的需求量急剧增加，而工艺研究是解决这一问题的有效手段之一。在细胞接毒前施加高渗胁迫可以提高分批培养模式下的Adv产量，新兴的灌流培养也可以显著提高Adv的产量。将高渗胁迫工艺与灌流培养相结合，有望进一步提升高细胞密度生产过程中的Adv产量。本研究利用摇瓶结合拟灌流培养作为生物反应器灌流培养的缩小模型，使用渗透压为300–405 mOsm的培养基研究了高渗胁迫对细胞生长和Adv生产的影响。结果显示，在细胞生长阶段使用370 mOsm的高渗透压培养基，在病毒生产阶段使用300 mOsm的等渗透压培养基的灌流培养工艺有效地提高了Adv的产量。进一步研究发现这可能归因于病毒复制后期HSP70蛋白的表达量增加。将这种工艺放大至生物反应器中，Adv的产量达到3.2×1010 IFU/mL，是传统灌流培养工艺的3倍。本研究首次将高渗胁迫工艺与灌流培养相结合的策略应用于HEK 293细胞生产Adv，同时揭示了高渗胁迫工艺增产Adv的可能原因，为HEK 293细胞生产其他类型Adv的工艺优化提供了借鉴。
2023,39(8):3379-3393, DOI: 10.13345/j.cjb.230136
摘要：
酪醇是一种多酚类天然产物，广泛应用于化工、医药和食品等领域。目前大肠杆菌(Escherichia coli)从头合成酪醇存在发酵菌体密度低和产量低等问题。为此，本研究将前期获得苯丙酮酸脱羧酶突变体ARO10F138L/D218G与不同来源的醇脱氢酶融合表达，最优组合ARO10F138L/D218G-L-YahK酪醇产量达到1.09 g/L。为进一步提高酪醇产量，敲除了4-羟基苯乙酸竞争途径关键基因feaB，使酪醇产量提高了21.15%，达到1.26 g/L。针对酪醇发酵菌体密度低的问题，通过群体感应系统动态调控酪醇合成途径，减轻酪醇对底盘细胞的毒性作用，缓解生长抑制，使其产量提高了33.82%，达到1.74 g/L。在2 L发酵罐中，群体感应动态调控工程菌TRFQ5的酪醇产量达到4.22 g/L，OD600值达到42.88，分别较静态诱导表达工程菌TRF5提高了38.58%和43.62%。本研究应用基因敲除技术，阻断了酪醇合成竞争途径；同时结合群体感应动态调控策略，减轻了酪醇毒性对底盘细胞的生长抑制，从而有效地提高了酪醇产量。本研究对其他高毒性化学品的生物合成具有良好的借鉴和应用价值。
酪醇是一种多酚类天然产物，广泛应用于化工、医药和食品等领域。目前大肠杆菌(Escherichia coli)从头合成酪醇存在发酵菌体密度低和产量低等问题。为此，本研究将前期获得苯丙酮酸脱羧酶突变体ARO10F138L/D218G与不同来源的醇脱氢酶融合表达，最优组合ARO10F138L/D218G-L-YahK酪醇产量达到1.09 g/L。为进一步提高酪醇产量，敲除了4-羟基苯乙酸竞争途径关键基因feaB，使酪醇产量提高了21.15%，达到1.26 g/L。针对酪醇发酵菌体密度低的问题，通过群体感应系统动态调控酪醇合成途径，减轻酪醇对底盘细胞的毒性作用，缓解生长抑制，使其产量提高了33.82%，达到1.74 g/L。在2 L发酵罐中，群体感应动态调控工程菌TRFQ5的酪醇产量达到4.22 g/L，OD600值达到42.88，分别较静态诱导表达工程菌TRF5提高了38.58%和43.62%。本研究应用基因敲除技术，阻断了酪醇合成竞争途径；同时结合群体感应动态调控策略，减轻了酪醇毒性对底盘细胞的生长抑制，从而有效地提高了酪醇产量。本研究对其他高毒性化学品的生物合成具有良好的借鉴和应用价值。
2023,39(8):3394-3405, DOI: 10.13345/j.cjb.220980
摘要：
光学纯乳酸作为可降解生物材料——聚乳酸(polylactic acid,PLA)的前体物质，正在受到广泛关注。乳酸发酵过程中酸性产物的积累会影响菌株的生长，提高菌株酸耐受性具有重要意义。本研究以乳酸生产菌株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans) DSM1为出发菌株，通过对凝结芽孢杆菌DSM1及其乳酸脱氢酶双敲除菌株(DldhL1DldhL2)进行比较转录分析，筛选酸耐受相关的转运蛋白基因。对关键基因RS16330、RS06895、RS16325、RS10595、RS00500、RS07275、RS10635及RS01930进行实时定量PCR分析，发现基因RS06895、RS10595、RS00500和RS10635在发酵12 h和24 h转录水平显著增强。过表达RS10595基因的菌株，在中性(pH 6.0)条件下生长状况和发酵性能均受到抑制，但在酸性条件下(pH 4.6)，其乳酸生成相比对照组显著提高。上述结果表明，RS10595基因与菌株DSM1的酸耐受性密切相关。本研究有助于进一步探究凝结芽孢杆菌酸耐受的机制，也为构建耐酸菌株提供了基础。
光学纯乳酸作为可降解生物材料——聚乳酸(polylactic acid,PLA)的前体物质，正在受到广泛关注。乳酸发酵过程中酸性产物的积累会影响菌株的生长，提高菌株酸耐受性具有重要意义。本研究以乳酸生产菌株凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans) DSM1为出发菌株，通过对凝结芽孢杆菌DSM1及其乳酸脱氢酶双敲除菌株(
2023,39(8):3406-3420, DOI: 10.13345/j.cjb.220906
摘要：
聚合度2–6的可溶性纤维寡糖是一种具有多种生物功能的低聚糖，它能够促进双歧杆菌(Bifidobacteria)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracei)等肠道益生菌的增殖，因此对人体肠道微生态具有调节作用。本研究通过在大肠杆菌中表达纤维寡糖磷酸化酶(cellodextrin phosphorylase,CDP)，构建Cc 01菌株，并与之前构建的COS 01菌株联合使用，建立了基于COS 01、Cc 01的三酶级联反应催化底物葡萄糖和蔗糖合成纤维寡糖反应体系。经过优化后，最终可溶性纤维寡糖的产量达到97 g/L，纯度约为97%，其中含有纤维二糖(16.8 wt%)、纤维三糖(49.8 wt%)、纤维四糖(16.4 wt%)、纤维五糖(11.5 wt%)和纤维六糖(5.5 wt%)。在纤维寡糖对益生菌株生长促进作用的测试中，以菊粉、低聚木糖、低聚果糖为基准，干酪乳杆菌(WSH 004)、副干酪乳杆菌(WSH 005)以及嗜酸乳杆菌(WSH 006)利用纤维寡糖(聚合度2–6)为碳源进行生长后，益生菌的生物量(OD600)相比对照增加约2倍。该研究证明了三酶级联反应能够高效合成纤维寡糖，并表明聚合度2–6的纤维寡糖是一类具有促进肠道微生物增殖的功能性碳水化合物。
聚合度2–6的可溶性纤维寡糖是一种具有多种生物功能的低聚糖，它能够促进双歧杆菌(Bifidobacteria)、副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracei)等肠道益生菌的增殖，因此对人体肠道微生态具有调节作用。本研究通过在大肠杆菌中表达纤维寡糖磷酸化酶(cellodextrin phosphorylase,CDP)，构建Cc 01菌株，并与之前构建的COS 01菌株联合使用，建立了基于COS 01、Cc 01的三酶级联反应催化底物葡萄糖和蔗糖合成纤维寡糖反应体系。经过优化后，最终可溶性纤维寡糖的产量达到97 g/L，纯度约为97%，其中含有纤维二糖(16.8 wt%)、纤维三糖(49.8 wt%)、纤维四糖(16.4 wt%)、纤维五糖(11.5 wt%)和纤维六糖(5.5 wt%)。在纤维寡糖对益生菌株生长促进作用的测试中，以菊粉、低聚木糖、低聚果糖为基准，干酪乳杆菌(WSH 004)、副干酪乳杆菌(WSH 005)以及嗜酸乳杆菌(WSH 006)利用纤维寡糖(聚合度2–6)为碳源进行生长后，益生菌的生物量(OD600)相比对照增加约2倍。该研究证明了三酶级联反应能够高效合成纤维寡糖，并表明聚合度2–6的纤维寡糖是一类具有促进肠道微生物增殖的功能性碳水化合物。
2023,39(8):3421-3435, DOI: 10.13345/j.cjb.220971
摘要：
普鲁兰酶是一种淀粉脱支酶，因其分子量较大，胞外分泌表达难度较高。需钠弧菌(Vibrio natriegens)是一种新型的蛋白表达宿主，拥有高效的蛋白合成效率。本研究使用基因组整合T7 RNA聚合酶表达框的V.natriegens VnDX为宿主，构建了产全长普鲁兰酶PulA及其截短突变体PulN2的重组需钠弧菌，分析了信号肽、发酵温度、诱导剂浓度、甘氨酸浓度及发酵时间等条件对产酶的影响，并且对比了2种普鲁兰酶在V.natriegens VnDX与大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的胞外产酶能力。研究结果显示，普鲁兰酶PulA和PulN2在V.natriegens VnDX中的胞外酶活为61.6 U/mL和64.3 U/mL，分别为E.coli BL21(DE3)最大酶活力的110%和62%。上述结果表明V.natriegens VnDX可以分泌表达大分子量的全长普鲁兰酶PulA，本研究可为其他大分子量蛋白在V.natriegens VnDX中的分泌表达提供参考和借鉴。
普鲁兰酶是一种淀粉脱支酶，因其分子量较大，胞外分泌表达难度较高。需钠弧菌(Vibrio natriegens)是一种新型的蛋白表达宿主，拥有高效的蛋白合成效率。本研究使用基因组整合T7 RNA聚合酶表达框的V.natriegens VnDX为宿主，构建了产全长普鲁兰酶PulA及其截短突变体PulN2的重组需钠弧菌，分析了信号肽、发酵温度、诱导剂浓度、甘氨酸浓度及发酵时间等条件对产酶的影响，并且对比了2种普鲁兰酶在V.natriegens VnDX与大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中的胞外产酶能力。研究结果显示，普鲁兰酶PulA和PulN2在V.natriegens VnDX中的胞外酶活为61.6 U/mL和64.3 U/mL，分别为E.coli BL21(DE3)最大酶活力的110%和62%。上述结果表明V.natriegens VnDX可以分泌表达大分子量的全长普鲁兰酶PulA，本研究可为其他大分子量蛋白在V.natriegens VnDX中的分泌表达提供参考和借鉴。
2023,39(8):3436-3450, DOI: 10.13345/j.cjb.220975
摘要：
偶氮染料广泛应用于纺织、造纸和包装等行业，因其具有三致性、结构稳定且难降解，已成为染料废水处理的研究热点之一。本研究以白腐真菌作为脱色菌株，考察了不同白腐真菌对偶氮类染料酸性橙7(acid orange 7,AO7)的脱色降解，探讨了AO7染料的浓度、pH、温度以及脱色时间对染料脱色率的影响，同时应用紫外-可见光谱吸收法、红外光谱吸收法、高效液相色谱法和气相色谱-质谱法对AO7的降解产物进行分析，并对其产物进行植物毒性实验，以推断AO7可能的降解途径及其降解产物的毒性。结果表明：在pH 4.5、28℃条件下，刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)和杂色云芝(Trametes versicolor)的混合菌丝脱色降解100 mg/L AO7，24 h脱色率可达93.46%。推测AO7可能的生物降解途径：AO7偶氮键断裂生成对氨基苯磺酸和1-氨基-2-萘酚；接着对氨基苯磺酸脱去磺酸基，生成对苯二酚；同时1-氨基-2-萘酚开环生成邻苯二甲酸和对羟基苯甲醛，之后进一步降解生成苯甲酸；最后对苯二酚和苯甲酸继续氧化成其他小分子中间体、H2O和CO2。植物毒性实验表明，P.eryngii和T.versicolor混合菌丝对AO7脱毒效果较好。以上研究为探究白腐真菌在工业废水中降解偶氮类染料的应用奠定基础。
偶氮染料广泛应用于纺织、造纸和包装等行业，因其具有三致性、结构稳定且难降解，已成为染料废水处理的研究热点之一。本研究以白腐真菌作为脱色菌株，考察了不同白腐真菌对偶氮类染料酸性橙7(acid orange 7,AO7)的脱色降解，探讨了AO7染料的浓度、pH、温度以及脱色时间对染料脱色率的影响，同时应用紫外-可见光谱吸收法、红外光谱吸收法、高效液相色谱法和气相色谱-质谱法对AO7的降解产物进行分析，并对其产物进行植物毒性实验，以推断AO7可能的降解途径及其降解产物的毒性。结果表明：在pH 4.5、28℃条件下，刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)和杂色云芝(Trametes versicolor)的混合菌丝脱色降解100 mg/L AO7，24 h脱色率可达93.46%。推测AO7可能的生物降解途径：AO7偶氮键断裂生成对氨基苯磺酸和1-氨基-2-萘酚；接着对氨基苯磺酸脱去磺酸基，生成对苯二酚；同时1-氨基-2-萘酚开环生成邻苯二甲酸和对羟基苯甲醛，之后进一步降解生成苯甲酸；最后对苯二酚和苯甲酸继续氧化成其他小分子中间体、H2O和CO2。植物毒性实验表明，P.eryngii和T.versicolor混合菌丝对AO7脱毒效果较好。以上研究为探究白腐真菌在工业废水中降解偶氮类染料的应用奠定基础。
2023,39(8):3451-3463, DOI: 10.13345/j.cjb.220790
摘要：
啤酒酵母的自溶会影响啤酒的风味和品质，对酵母自溶的调控是工业啤酒生产的迫切需求。前期在啤酒酵母自溶的研究中发现柠檬酸循环相关基因对酵母自溶有较大影响。为探究柠檬酸循环中异柠檬酸脱氢酶基因调控对自溶的影响，在典型拉格啤酒酵母(Saccharomyces pastorianus H.) Pilsner中对IDP1和IDP2基因进行了破坏和过表达。结果发现IDP1基因的破坏能提高酵母的抗自溶能力，自溶96 h抗自溶指数为8.40，比原始菌提高了1.5倍。IDP1基因的破坏提高还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)的供应，NADPH/NADP+的比值为1.94，发酵结束时胞内ATP水平比原始菌提高1.8倍，活性氧(reactive oxygen species,ROS)相比原始菌减少10%。IDP2基因的缺失造成酵母快速自溶和NADPH供应的减少，自溶96 h抗自溶指数为4.03，NADPH/NADP+的比值为0.89。发酵结束时胞内ATP水平相比原始菌减少8%，ROS是原始菌的1.3倍。本研究进一步阐释了柠檬酸循环相关基因对酵母自溶的调控机理，为选育自溶性能可控的优良酵母提供了理论基础。
啤酒酵母的自溶会影响啤酒的风味和品质，对酵母自溶的调控是工业啤酒生产的迫切需求。前期在啤酒酵母自溶的研究中发现柠檬酸循环相关基因对酵母自溶有较大影响。为探究柠檬酸循环中异柠檬酸脱氢酶基因调控对自溶的影响，在典型拉格啤酒酵母(Saccharomyces pastorianus H.) Pilsner中对IDP1和IDP2基因进行了破坏和过表达。结果发现IDP1基因的破坏能提高酵母的抗自溶能力，自溶96 h抗自溶指数为8.40，比原始菌提高了1.5倍。IDP1基因的破坏提高还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)的供应，NADPH/NADP+的比值为1.94，发酵结束时胞内ATP水平比原始菌提高1.8倍，活性氧(reactive oxygen species,ROS)相比原始菌减少10%。IDP2基因的缺失造成酵母快速自溶和NADPH供应的减少，自溶96 h抗自溶指数为4.03，NADPH/NADP+的比值为0.89。发酵结束时胞内ATP水平相比原始菌减少8%，ROS是原始菌的1.3倍。本研究进一步阐释了柠檬酸循环相关基因对酵母自溶的调控机理，为选育自溶性能可控的优良酵母提供了理论基础。
2023,39(8):3464-3480, DOI: 10.13345/j.cjb.220860
摘要：
线粒体自噬是指细胞通过自噬的机制选择性地清除线粒体的过程，对维持细胞内稳态具有重要作用。为探究线粒体自噬基因对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞抗氧化性能的影响，本研究分别构建了线粒体自噬相关基因ATG8、ATG11、ATG32的缺失和过表达菌株，发现在过氧化氢(H2O2)胁迫6 h后，过表达ATG8、ATG11基因显著降低了细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量，分别仅为初始状态的61.23%和46.35%，并显著提高了菌株线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine-triphosphate,ATP)含量，有助于提高菌株的抗氧化性能。另一方面，基因ATG8、ATG11、ATG32的缺失会导致线粒体损伤及细胞活力显著下降，同时造成胞内ROS失衡，H2O2胁迫6 h后，其胞内ROS含量显著升高至初始状态的174.27%、128.68%和200.92%。结果表明，ATG8、ATG11和ATG32可能是调控酵母抗氧化能力的潜在靶点。本研究为进一步研究通过调节线粒体自噬提高酵母抗氧化活性提供了新的线索。
线粒体自噬是指细胞通过自噬的机制选择性地清除线粒体的过程，对维持细胞内稳态具有重要作用。为探究线粒体自噬基因对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞抗氧化性能的影响，本研究分别构建了线粒体自噬相关基因ATG8、ATG11、ATG32的缺失和过表达菌株，发现在过氧化氢(H2O2)胁迫6 h后，过表达ATG8、ATG11基因显著降低了细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量，分别仅为初始状态的61.23%和46.35%，并显著提高了菌株线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine-triphosphate,ATP)含量，有助于提高菌株的抗氧化性能。另一方面，基因ATG8、ATG11、ATG32的缺失会导致线粒体损伤及细胞活力显著下降，同时造成胞内ROS失衡，H2O2胁迫6 h后，其胞内ROS含量显著升高至初始状态的174.27%、128.68%和200.92%。结果表明，ATG8、ATG11和ATG32可能是调控酵母抗氧化能力的潜在靶点。本研究为进一步研究通过调节线粒体自噬提高酵母抗氧化活性提供了新的线索。
2023,39(8):3481-3493, DOI: 10.13345/j.cjb.220997
摘要：
甘油二酯(diacylglycerol,DAG)是油脂代谢的中间产物，在人体中具有重要的生理功能，主要通过脂肪酶水解油脂制备。但对1,2-甘油二酯(1,2-diacylglycerol,1,2-DAG)、1,3-甘油二酯(1,3-diacylglycerol,1,3-DAG)的检测分离方法及脂肪酶的催化特异性的研究较少，限制了其广泛应用。基于以上问题，本研究首先通过超临界流体色谱与蒸发光散射检测器联用，优化检测分析参数，建立了1,2-DAG (0.025–0.200 g/L)和1,3-DAG (0.025–0.150 g/L)的高效定量检测方法。进一步基于疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)与三油酸甘油酯的分子对接，挑选了5个潜在底物结合位点并通过定点饱和突变构建了突变体库，利用超临界流体色谱方法对突变体催化特异性进行筛选。突变文库中I202V表现出最高的1,3-位置选择特异性，较野生型TLL提高了11.7%。本文基于半理性设计方法实现了对TLL位置催化特异性的改造，并建立了一种能够高效分离检测DAG位置异构体的方法，为脂肪酶催化特异性研究提供了参考。
甘油二酯(diacylglycerol,DAG)是油脂代谢的中间产物，在人体中具有重要的生理功能，主要通过脂肪酶水解油脂制备。但对1,2-甘油二酯(1,2-diacylglycerol,1,2-DAG)、1,3-甘油二酯(1,3-diacylglycerol,1,3-DAG)的检测分离方法及脂肪酶的催化特异性的研究较少，限制了其广泛应用。基于以上问题，本研究首先通过超临界流体色谱与蒸发光散射检测器联用，优化检测分析参数，建立了1,2-DAG (0.025–0.200 g/L)和1,3-DAG (0.025–0.150 g/L)的高效定量检测方法。进一步基于疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶(Thermomyces lanuginosus lipase,TLL)与三油酸甘油酯的分子对接，挑选了5个潜在底物结合位点并通过定点饱和突变构建了突变体库，利用超临界流体色谱方法对突变体催化特异性进行筛选。突变文库中I202V表现出最高的1,3-位置选择特异性，较野生型TLL提高了11.7%。本文基于半理性设计方法实现了对TLL位置催化特异性的改造，并建立了一种能够高效分离检测DAG位置异构体的方法，为脂肪酶催化特异性研究提供了参考。
2023,39(8):3494-3507, DOI: 10.13345/j.cjb.230296
摘要：
氨肽酶A (aminopeptidase A,Pep A)能特异性地水解N末端为谷氨酸(glutamic acid,Glu)或天冬氨酸(aspartic acid,Asp)的肽链，提高蛋白质的水溶性和食物的风味，在食品工业和肉类加工中具有一定的应用前景。本研究采用全基因合成的方式获得了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ssp.lactis) IL1403氨肽酶A (Lactococcus lactis-Pep A,Lc-Pep A)的编码基因，将该基因克隆并导入毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115(His4)，在毕赤酵母中实现了Lc-Pep A的高效分泌表达，表达产物经鉴定和纯化制备后，进行了生物学特性的分析。结果表明，Lc-Pep A具有较强的底物特异性，对2种底物谷氨酸对硝基苯胺(glutamic acid-p-nitroaniline,Glu-pNA)和天冬氨酸对硝基苯胺(aspartic acid-p-nitroaniline,Asp-pNA)具有相似的催化活力和酶动力学参数。Lc-Pep A是一种金属蛋白酶，最适反应温度为60℃，最适pH为8.0，具有较宽的热稳定性和酸碱稳定性。金属离子Co2+、Mn2+及Zn2+等对酶活力具有不同程度的激活作用，而Ni2+和Cu2+对酶活力具有强烈的抑制作用。Lc-Pep A对常规蛋白酶抑制剂不敏感，但能被金属蛋白酶抑制剂、EDTA及二硫键还原剂抑制。这些研究为Lc-Pep A的生产和指导该酶的应用打下了坚实的基础。
氨肽酶A (aminopeptidase A,Pep A)能特异性地水解N末端为谷氨酸(glutamic acid,Glu)或天冬氨酸(aspartic acid,Asp)的肽链，提高蛋白质的水溶性和食物的风味，在食品工业和肉类加工中具有一定的应用前景。本研究采用全基因合成的方式获得了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ssp.lactis) IL1403氨肽酶A (Lactococcus lactis-Pep A,Lc-Pep A)的编码基因，将该基因克隆并导入毕赤酵母(Pichia pastoris) GS115(His4)，在毕赤酵母中实现了Lc-Pep A的高效分泌表达，表达产物经鉴定和纯化制备后，进行了生物学特性的分析。结果表明，Lc-Pep A具有较强的底物特异性，对2种底物谷氨酸对硝基苯胺(glutamic acid-p-nitroaniline,Glu-pNA)和天冬氨酸对硝基苯胺(aspartic acid-p-nitroaniline,Asp-pNA)具有相似的催化活力和酶动力学参数。Lc-Pep A是一种金属蛋白酶，最适反应温度为60℃，最适pH为8.0，具有较宽的热稳定性和酸碱稳定性。金属离子Co2+、Mn2+及Zn2+等对酶活力具有不同程度的激活作用，而Ni2+和Cu2+对酶活力具有强烈的抑制作用。Lc-Pep A对常规蛋白酶抑制剂不敏感，但能被金属蛋白酶抑制剂、EDTA及二硫键还原剂抑制。这些研究为Lc-Pep A的生产和指导该酶的应用打下了坚实的基础。
2023,39(8):3508-3519, DOI: 10.13345/j.cjb.230015
摘要：
热葡糖苷酶地芽胞杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，因其高温生长速度快、不易染菌的特性，作为下一代工业生物技术的候选底盘，已被广泛用于生产生物燃料和高附加值的化学品。然而，相比于经典的模式菌株大肠杆菌(Escherichia coli)，热葡糖苷酶地芽胞杆菌因其转化效率低，限制了其作为底盘菌株的高效应用。本研究的目的是开发一种能够提高该菌株电转化效率的方法。本研究通过敲除该菌株中预测的限制性内切酶基因，添加细胞壁弱化剂和细胞膜抑制剂，优化目标菌株高效感受态细胞的制备，从而提高转化效率。热葡糖苷酶地芽胞杆菌的4个限制性内切酶基因的敲除可以使感受态细胞电转化效率提高至1.2×104 CFU/(μg DNA)；在敲除株的基础上，分别通过添加吐温80、dl-苏氨酸和甘氨酸进一步优化感受态细胞转化效率，其中吐温80的添加使感受态细胞电转化效率提高22.5倍左右，dl-苏氨酸的添加可以使感受态细胞电转化效率增加44倍，甘氨酸的添加可以使感受态细胞电转化效率进一步提高334倍左右，优化整合添加各类试剂后感受态细胞电转化效率在限制性内切酶缺失菌株的基础上提高至4.6×106 CFU/(μg DNA)，相对野生型菌株提高了3个数量级。这为热葡糖苷酶地芽胞杆菌的高效遗传操作和代谢工程奠定了基础。
热葡糖苷酶地芽胞杆菌(Geobacillus thermoglucosidasius)是一种革兰氏阳性兼性厌氧菌，因其高温生长速度快、不易染菌的特性，作为下一代工业生物技术的候选底盘，已被广泛用于生产生物燃料和高附加值的化学品。然而，相比于经典的模式菌株大肠杆菌(Escherichia coli)，热葡糖苷酶地芽胞杆菌因其转化效率低，限制了其作为底盘菌株的高效应用。本研究的目的是开发一种能够提高该菌株电转化效率的方法。本研究通过敲除该菌株中预测的限制性内切酶基因，添加细胞壁弱化剂和细胞膜抑制剂，优化目标菌株高效感受态细胞的制备，从而提高转化效率。热葡糖苷酶地芽胞杆菌的4个限制性内切酶基因的敲除可以使感受态细胞电转化效率提高至1.2×104 CFU/(μg DNA)；在敲除株的基础上，分别通过添加吐温80、dl-苏氨酸和甘氨酸进一步优化感受态细胞转化效率，其中吐温80的添加使感受态细胞电转化效率提高22.5倍左右，dl-苏氨酸的添加可以使感受态细胞电转化效率增加44倍，甘氨酸的添加可以使感受态细胞电转化效率进一步提高334倍左右，优化整合添加各类试剂后感受态细胞电转化效率在限制性内切酶缺失菌株的基础上提高至4.6×106 CFU/(μg DNA)，相对野生型菌株提高了3个数量级。这为热葡糖苷酶地芽胞杆菌的高效遗传操作和代谢工程奠定了基础。
2023,39(8):3520-3529, DOI: 10.13345/j.cjb.220943
摘要：
“生物化工大实验”是湖南科技学院生物工程专业集中实践教学环节的必修课程，是在“新工科”背景下为提高本专业学生综合素质而开设的实验课程。课程实验项目为综合性实验及设计性实验，其内容主要结合了永州市地方特色资源、研究平台和工科人才特征合理编制而成。授课过程中，综合运用符合课程特点的启发式教学、科研案例导入式教学和互动式教学等方法，提高学生学习的兴趣，激发学生的创新能力和实践应用能力。通过课程考察和课后调查发现，生物工程专业学生的知识迁移和应用能力明显提升，学科竞赛和项目立项成绩优异。因此，基于对本课程授课内容和方法的实践及不断完善，课程教学质量得到了全面提高，为培养生物工程专业高水平创新型、应用型工科人才夯实了基础。
“生物化工大实验”是湖南科技学院生物工程专业集中实践教学环节的必修课程，是在“新工科”背景下为提高本专业学生综合素质而开设的实验课程。课程实验项目为综合性实验及设计性实验，其内容主要结合了永州市地方特色资源、研究平台和工科人才特征合理编制而成。授课过程中，综合运用符合课程特点的启发式教学、科研案例导入式教学和互动式教学等方法，提高学生学习的兴趣，激发学生的创新能力和实践应用能力。通过课程考察和课后调查发现，生物工程专业学生的知识迁移和应用能力明显提升，学科竞赛和项目立项成绩优异。因此，基于对本课程授课内容和方法的实践及不断完善，课程教学质量得到了全面提高，为培养生物工程专业高水平创新型、应用型工科人才夯实了基础。
2023,39(8):3530-3539, DOI: 10.13345/j.cjb.230037
摘要：
食品酶学与酶工程是食品类专业的一门重要专业课程，内容涵盖酶学基础理论、酶工程技术以及酶在食品工业中的应用。针对当前教学内容与学科前沿存在知识差距，本课程精心挖掘学科前沿案例，不断调整优化课程内容，让学生所学能够与时俱进。以学科前沿案例的主题讨论为切入点，探索了成果导向教学(outcome-based education,OBE)理念下的问题导向学习(problem-based learning,PBL)教学模式，强化师生互动和生生互动，提高学生的积极性和参与度。构建多元化考核方式，侧重评价学生的学习过程中的表现。课程教学改革实现夯实基础知识和拓展学科前沿的双管齐下，培养了学生分析问题、设计解决方案、团队协作等方面能力，可为食品酶学与酶工程及相关课程的教学改革提供启发与思考。
食品酶学与酶工程是食品类专业的一门重要专业课程，内容涵盖酶学基础理论、酶工程技术以及酶在食品工业中的应用。针对当前教学内容与学科前沿存在知识差距，本课程精心挖掘学科前沿案例，不断调整优化课程内容，让学生所学能够与时俱进。以学科前沿案例的主题讨论为切入点，探索了成果导向教学(outcome-based education,OBE)理念下的问题导向学习(problem-based learning,PBL)教学模式，强化师生互动和生生互动，提高学生的积极性和参与度。构建多元化考核方式，侧重评价学生的学习过程中的表现。课程教学改革实现夯实基础知识和拓展学科前沿的双管齐下，培养了学生分析问题、设计解决方案、团队协作等方面能力，可为食品酶学与酶工程及相关课程的教学改革提供启发与思考。
2023,39(8):3540-3540, DOI: 10.13345/j.cjb.230557
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为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性，本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒 (VSV△G*G) 为指示病毒，分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素 (PoIFN-γ) 在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示：由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性为105 IU/mL，原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性为32 IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP) 所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致，表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品，使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。
为了提高干扰素抗病毒活性测定的生物安全性，本研究使用含有GFP的复制缺陷型水疱性口炎病毒 (VSV△G*G) 为指示病毒，分别对经原核表达系统和杆状病毒表达系统表达的重组猪γ干扰素 (PoIFN-γ) 在MDBK细胞上进行抗病毒活性测定。结果显示：由杆状病毒表达的重组PoIFN-γ具有高度抗病毒活性，其抗病毒活性为105 IU/mL，原核表达的重组PoIFN-γ纯化后经缓慢复性也会产生一定的抗病毒活性，其抗病毒活性为32 IU/mL。该方法与利用表达GFP的重组水疱性口炎病毒 (VSV*GFP) 所检测的干扰素抗病毒活性结果完全一致，表明复制缺陷型病毒VSV△G*G可作为复制型重组病毒的替代品，使得干扰素抗病毒活性检测更加安全、准确。
摘要：
从人肌肉素基因出发, 在dbEST数据库中进行同源性搜索, 找到七个有较高同源性的Expressed Sequence Tag(DY426490, CF787546, AJ660979, AJ664670, AJ663820, AJ680159, DN106254)。通过拼接和进一步RT-PCR实验验证, 获得猪肌肉素基因全长cDNA序列, 其全长651 bp, 开放阅读框为54~452 bp, 编码有132个氨基酸。同源性分析结果表明, 与人、小鼠和大鼠的肌肉素基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为87.2%、77.6%和77.9%。利用克隆出的猪肌肉素cDNA, 构建表达载体pGEX-4T-1-musclin, 并在BL21大肠杆菌中成功表达和纯化了分子量为38.59 kD的融合蛋白GST-Musclin, 并运用蛋白印迹技术进行鉴定。
从人肌肉素基因出发, 在dbEST数据库中进行同源性搜索, 找到七个有较高同源性的Expressed Sequence Tag(DY426490, CF787546, AJ660979, AJ664670, AJ663820, AJ680159, DN106254)。通过拼接和进一步RT-PCR实验验证, 获得猪肌肉素基因全长cDNA序列, 其全长651 bp, 开放阅读框为54~452 bp, 编码有132个氨基酸。同源性分析结果表明, 与人、小鼠和大鼠的肌肉素基因cDNA编码区(CDS)同源性分别为87.2%、77.6%和77.9%。利用克隆出的猪肌肉素cDNA, 构建表达载体pGEX-4T-1-musclin, 并在BL21大肠杆菌中成功表达和纯化了分子量为38.59 kD的融合蛋白GST-Musclin, 并运用蛋白印迹技术进行鉴定。
摘要：
自然界中微生物种类极为丰富，尺寸涵盖了纳米级与微米级。微生物细胞培养成本低廉，生长繁殖迅速，具有丰富的遗传表现型，因此微生物是可用于纳米、微米以及多层次跨尺度加工的天然“基本单元”和“底盘细胞”。“基于微生物”的生物制造目的是利用微生物的特异结构和多样功能进行仿生和调控，操纵微生物进行加工组装，从而获得新材料、新器件。同时，建立深入研究微生物行为模式的新技术与新方法，为揭示传统方法所未涉及的基本科学问题提供新的平台。以下将分别从纳米和微米两个尺度以及利用微生物的结构或功能两个角度来概述基于微生物的微纳米生物制造的前沿进展。
自然界中微生物种类极为丰富，尺寸涵盖了纳米级与微米级。微生物细胞培养成本低廉，生长繁殖迅速，具有丰富的遗传表现型，因此微生物是可用于纳米、微米以及多层次跨尺度加工的天然“基本单元”和“底盘细胞”。“基于微生物”的生物制造目的是利用微生物的特异结构和多样功能进行仿生和调控，操纵微生物进行加工组装，从而获得新材料、新器件。同时，建立深入研究微生物行为模式的新技术与新方法，为揭示传统方法所未涉及的基本科学问题提供新的平台。以下将分别从纳米和微米两个尺度以及利用微生物的结构或功能两个角度来概述基于微生物的微纳米生物制造的前沿进展。
摘要：
葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal (GenBank Accession No. EFS20452.1) 构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8.0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45 ℃。在45 ℃下孵育2 h对ShNAL的活力基本无影响，高于45 ℃时，活力迅速下降。该酶在pH 5.0~10.0的环境中比较稳定，4 ℃下放置24 h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺 (Man) 和丙酮酸 (Pyr) 的Km值分别是 (4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1) mmol/L和 (35.1±3.2) mmol/L，kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s) 和0.08 L/(mmol·s)。
葡萄球菌Staphylococcus hominis来源的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因shnal (GenBank Accession No. EFS20452.1) 构建至pET-28a质粒并在大肠杆菌中得到表达。通过目的蛋白的纯化和酶学性质研究发现，ShNAL是一个四聚体，裂解方向的最适反应pH为8.0；合成方向的最适反应pH为7.5，最适反应温度为45 ℃。在45 ℃下孵育2 h对ShNAL的活力基本无影响，高于45 ℃时，活力迅速下降。该酶在pH 5.0~10.0的环境中比较稳定，4 ℃下放置24 h酶的残余活力在70％以上。ShNAL对N-乙酰神经氨酸 (Neu5Ac)、N-乙酰甘露糖胺 (Man) 和丙酮酸 (Pyr) 的Km值分别是 (4.0±0.2) mmol/L、(131.7±12.1) mmol/L和 (35.1±3.2) mmol/L，kcat/Km值分别为1.9 L/(mmol·s)、0.08 L/(mmol·s) 和0.08 L/(mmol·s)。
摘要：
本研究通过单因素试验和响应面分析试验建立了能够选择性富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共增菌培养基SVV, 采用平板计数法及三重荧光PCR技术验证了SVV的增菌效果。结果表明: SVV能同时富集以不同浓度比例混合的3种目标菌, 37oC振荡培养18 h后, 菌体浓度达到105~108 CFU/mL; SVV强烈抑制大部分的非目标菌; 用荧光PCR方法检测经过37oC振荡培养18 h的10份人工接种样品和608份实际样品, 结果表明目标菌在SVV中增殖18 h后菌量达到检测限以上, SVV联合荧光PCR检测方法的检出率为4.06%, 比传统检测方法(3.78%)高, 无假阴性和假阳性。SVV可望应用于水产品中沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测前的增菌处理, 可简化检测过程, 有效克服漏检, 提高检出率。
本研究通过单因素试验和响应面分析试验建立了能够选择性富集沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌的共增菌培养基SVV, 采用平板计数法及三重荧光PCR技术验证了SVV的增菌效果。结果表明: SVV能同时富集以不同浓度比例混合的3种目标菌, 37oC振荡培养18 h后, 菌体浓度达到105~108 CFU/mL; SVV强烈抑制大部分的非目标菌; 用荧光PCR方法检测经过37oC振荡培养18 h的10份人工接种样品和608份实际样品, 结果表明目标菌在SVV中增殖18 h后菌量达到检测限以上, SVV联合荧光PCR检测方法的检出率为4.06%, 比传统检测方法(3.78%)高, 无假阴性和假阳性。SVV可望应用于水产品中沙门氏菌、副溶血弧菌和霍乱弧菌检测前的增菌处理, 可简化检测过程, 有效克服漏检, 提高检出率。
摘要：
BMP6是一种调节成骨细胞和成软骨细胞分化的骨诱导因子, 在修复各种骨缺损方面具有很好的应用潜力。有诱骨活性的BMP6是多二硫键的二聚体蛋白, 疏水性极强容易聚集沉淀。为了在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的重组人BMP6(rhBMP6), 构建了具有TRX、GST、MBP、CBD融合标签和His6标签的 rhBMP6成熟肽原核表达载体, 调节诱导温度和IPTG浓度, 比较不同融合标签和诱导条件对目的蛋白表达量和溶解性的影响。结果表明, MBP最能有效的增强rhBMP6的溶解性, 诱导条件对溶解性影响较小。大肠杆菌BL21 trxB(DE3)这种硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株为rhBMP6二硫键在胞质中形成提供了合适的氧化还原环境。MBP和BL21 trxB(DE3)相结合在细胞质中高效可溶表达出了BMP6融合蛋白二聚体。表达产物经亲和层析和凝胶排阻层析纯化后, 能诱导成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向 转化。
BMP6是一种调节成骨细胞和成软骨细胞分化的骨诱导因子, 在修复各种骨缺损方面具有很好的应用潜力。有诱骨活性的BMP6是多二硫键的二聚体蛋白, 疏水性极强容易聚集沉淀。为了在大肠杆菌中可溶表达具有生物活性的重组人BMP6(rhBMP6), 构建了具有TRX、GST、MBP、CBD融合标签和His6标签的 rhBMP6成熟肽原核表达载体, 调节诱导温度和IPTG浓度, 比较不同融合标签和诱导条件对目的蛋白表达量和溶解性的影响。结果表明, MBP最能有效的增强rhBMP6的溶解性, 诱导条件对溶解性影响较小。大肠杆菌BL21 trxB(DE3)这种硫氧还蛋白还原酶缺陷菌株为rhBMP6二硫键在胞质中形成提供了合适的氧化还原环境。MBP和BL21 trxB(DE3)相结合在细胞质中高效可溶表达出了BMP6融合蛋白二聚体。表达产物经亲和层析和凝胶排阻层析纯化后, 能诱导成肌细胞系C2C12向成骨细胞方向 转化。
摘要：
白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素, 还具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。以下对白藜芦醇的理化特性、合成、提取、纯化与检测方法进行了全面总结, 并在其作用的分子机制基础上, 对其生物学活性、基因工程研究及产业化情况进行了重点介绍。发现在传统育种的基础上, 借助于现代生物技术手段, 将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高具有广阔的前景。它的开发和利用, 必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。
白藜芦醇是一种含有芪类结构的非黄酮类多酚化合物。它不仅是植物遭受胁迫时产生的一种能提高植物抵抗病原性攻击和环境恶化的植物抗毒素, 还具有抗癌、抗氧化、调节血脂、影响寿命等多方面有益于人类健康的重要功能。以下对白藜芦醇的理化特性、合成、提取、纯化与检测方法进行了全面总结, 并在其作用的分子机制基础上, 对其生物学活性、基因工程研究及产业化情况进行了重点介绍。发现在传统育种的基础上, 借助于现代生物技术手段, 将白藜芦醇的天然活性保健作用应用于保健食品的开发、作物经济附加值的提高具有广阔的前景。它的开发和利用, 必将为食品及制药工业新产品的开发提供新的挑战与机遇。
摘要：
为了研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶 (BcAUR1基因) 的表达及酶活性，采用RT-PCR方法，利用含有FLAG标签以及BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的AUR1特异引物从灰葡萄孢菌中扩增得到BcAUR1基因。将BcAUR1基因与穿梭质粒pYES2重组，得到pYES2-BcAUR1质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中，Western blotting检测肌糖磷脂酰神经酰胺 (IPC) 合成酶表达，HPLC检测IPC合成酶活力。结果显示pYES2-BcAUR1在酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中获得表达，pYES2-BcAUR1转化子IPC合成酶活性显著增高，比空载转化子约提高1倍。低浓度的AbA能够抑制空载pYES2酵母转化子生长，但pYES2-BcAUR1酵母转化子能抵抗AbA对菌体生长的抑制。
为了研究灰葡萄孢菌肌糖磷脂酰神经酰胺合成酶 (BcAUR1基因) 的表达及酶活性，采用RT-PCR方法，利用含有FLAG标签以及BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的AUR1特异引物从灰葡萄孢菌中扩增得到BcAUR1基因。将BcAUR1基因与穿梭质粒pYES2重组，得到pYES2-BcAUR1质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中，Western blotting检测肌糖磷脂酰神经酰胺 (IPC) 合成酶表达，HPLC检测IPC合成酶活力。结果显示pYES2-BcAUR1在酿酒酵母尿嘧啶突变菌株Δyor1中获得表达，pYES2-BcAUR1转化子IPC合成酶活性显著增高，比空载转化子约提高1倍。低浓度的AbA能够抑制空载pYES2酵母转化子生长，但pYES2-BcAUR1酵母转化子能抵抗AbA对菌体生长的抑制。
摘要：
细菌启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。启动子的识别和应用研究，对于实现异源基因的可控表达、有效获得目的产物、促进生物催化和代谢工程研究具有重要的意义。以下对细菌启动子进行了简单的介绍，总结了细菌启动子的识别方法，并对细菌启动子的研究进展和具体应用进行了概述。
细菌启动子是细菌中基因表达的必需调控元件，决定了细菌基因表达的强度和时机。通过启动子的插入或缺失，可以改变细菌基因的表达，实现对菌体生长发育以及代谢调控的研究。启动子也是构建各种表达系统、实现异源基因表达的基础。启动子的识别和应用研究，对于实现异源基因的可控表达、有效获得目的产物、促进生物催化和代谢工程研究具有重要的意义。以下对细菌启动子进行了简单的介绍，总结了细菌启动子的识别方法，并对细菌启动子的研究进展和具体应用进行了概述。
摘要：
环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类。酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等。非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展。
环境胁迫使植物细胞中积累大量的活性氧，从而导致蛋白质、膜脂、DNA及其它细胞组分的严重损伤。植物体内有效清除活性氧的保护机制分为酶促和非酶促两类。酶促脱毒系统包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等。非酶类抗氧化剂包括抗坏血酸、谷胱甘肽、甘露醇和类黄酮。利用基因工程策略增加这些物质在植物体内的含量，从而获得耐逆转基因植物已取得一定的进展。
摘要：
通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。目前，iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用，建立了相应的iPS细胞系，并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处，但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究，对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。
通过外源转录调控因子的诱导，使成体细胞重编程为胚胎干细胞 (ES细胞) 样的多能细胞，这种细胞称为诱导多能干细胞 (iPS细胞)，这一方法被称为iPS技术。目前，iPS技术已先后在小鼠、人、猕猴、大鼠和猪中成功应用，建立了相应的iPS细胞系，并获得了iPS细胞嵌合小鼠和四倍体克隆小鼠。尽管iPS与ES细胞在形态和生长特性上有许多相同之处，但iPS细胞的建立需要较独特的诱导培养体系和鉴定方法。以下结合近年来iPS技术的发展和本实验室的相关研究，对iPS细胞的建立和培养体系的优化进行了深入探讨。
摘要：
在基因表达定位或启动子调控模式的研究中, 多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制, 使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题, 本实验将报道基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率, 通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。
在基因表达定位或启动子调控模式的研究中, 多以gusA作为报告基因。但由于部分组织中高内源GUS背景活性或转化手段的限制, 使判断基因表达定位或调控时存在很大误差。为了解决上述问题, 本实验将报道基因绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(RFP)融合构建双荧光标记瞬时表达载体pBI221-RFP/GFP。该载体以CaMV35S启动子驱动GFP确定转化效率, 通过鉴定阳性个体的红色荧光活性分析目的基因或启动子的表达模式。并通过番茄E8和西瓜AGPL1果实特异启动子验证了该载体在启动子调控模式研究中的应用可行性。结果表明pBI221-RFP/GFP是一个可以在基因和启动子功能验证中应用的高效瞬时表达载体。
摘要：
单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势,同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了更多利器。对单克隆抗体进行改造使之应用于临床治疗，不仅需要对抗体效应机制进行更细致深入的研究，同时还有赖于对人类免疫系统调控机制的全面精确认识。
单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床，经历了一段曲折的发展历程。其中人源化抗体是一个重要的里程碑，并伴随着一系列重大的技术革新，如PCR技术、抗体库技术、转基因动物等。人源化抗体的形式也从最初的嵌合抗体、改型抗体等逐步发展为今天的人抗体。抗体人源化已经成为治疗性抗体的发展趋势,同时各种抗体衍生物也不断涌现，它们从不同角度克服抗体本身的应用局限，也为治疗人类疾病提供了更多利器。对单克隆抗体进行改造使之应用于临床治疗，不仅需要对抗体效应机制进行更细致深入的研究，同时还有赖于对人类免疫系统调控机制的全面精确认识。
摘要：
Cre/loxP定位重组系统来源于噬菌体P1，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下，设定的DNA片段可以被切除，可以发生倒位，亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单，Cre/loxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用，在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。这里就Cre重组酶的结构、功能及该定位重组系统的应用等方面的研究进行了综述。
Cre/loxP定位重组系统来源于噬菌体P1，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。在Cre重组酶的介导下，设定的DNA片段可以被切除，可以发生倒位，亦可造成定点的整合。由于其作用方式高效简单，Cre/loxP定位重组系统已在特定基因的删除、基因功能的鉴定、外源基因的整合、基因捕获及染色体工程等方面得到了有效的利用，在转基因的酵母、植物、昆虫、哺乳动物的体内外DNA重组方面成为一个有力的工具。这里就Cre重组酶的结构、功能及该定位重组系统的应用等方面的研究进行了综述。
摘要：
通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的三聚氰胺抗原检测方法，对奶制品及饲料中的三聚氰胺残留水平监测提供参考。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金，标记纯化的三聚氰胺单克隆抗体，喷于试纸的金标垫。将MEL-OVA （三聚氰胺和卵清白蛋白的偶练物） 和纯化的羊抗鼠IgG 分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (质控线) 处，通过挑选试纸条材料和调试工艺参数，并最终组装成试纸条。结果显示，制备的试纸监测体系方法检出限为50 mg/L。试纸条对牛奶、奶粉和饲料中的三聚氰胺残留的检出限分别为100?mg/L、1
通过胶体金免疫层析技术建立一种特异、便捷、快速的三聚氰胺抗原检测方法，对奶制品及饲料中的三聚氰胺残留水平监测提供参考。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金，标记纯化的三聚氰胺单克隆抗体，喷于试纸的金标垫。将MEL-OVA （三聚氰胺和卵清白蛋白的偶练物） 和纯化的羊抗鼠IgG 分别喷于试纸的T (检测线) 处和C (质控线) 处，通过挑选试纸条材料和调试工艺参数，并最终组装成试纸条。结果显示，制备的试纸监测体系方法检出限为50 mg/L。试纸条对牛奶、奶粉和饲料中的三聚氰胺残留的检出限分别为100?mg/L、1
摘要：
随着DNA 重组技术的日趋成熟, 代谢工程的理论和应用已经得到了迅速发展。合成生物学是近年来蓬勃发展的一门新兴学科, 在许多领域都具有重要的应用。以下从改造细胞代谢的关键因子、代谢途径的调节和宿主细胞与代谢途径构建的关系等方面详细讨论了合成生物学的最新进展和合成生物学在代谢工程领域的应用。
随着DNA 重组技术的日趋成熟, 代谢工程的理论和应用已经得到了迅速发展。合成生物学是近年来蓬勃发展的一门新兴学科, 在许多领域都具有重要的应用。以下从改造细胞代谢的关键因子、代谢途径的调节和宿主细胞与代谢途径构建的关系等方面详细讨论了合成生物学的最新进展和合成生物学在代谢工程领域的应用。
摘要：
Lipase production by Candida rugosa was carried out in submerged fermentation. Plackett-Burman statistical experimental design was applied to evaluate the fermentation medium components. The effect of twelve medium components was studied in sixteen experimental trials. Glucose, olive oil, peptone and FeCl3?6H2O were found to have more significance on lipase production by Candida rugosa. Maximum lipase activity of 3.8 u mL-1 was obtained at 50 h of fermentation period. The fermentation was carried out at optimized temperature of 30oC, initial pH of 6.8 and shaking speed of 120 r/min. Unstructured kinetic models were used to simulate the experimental data. Logistic model, Luedeking-Piret model and modified Luedeking-Piret model were found suitable to efficiently predict the cell mass, lipase production and glucose consumption respectively with high determination coefficient(R2). From the estimated values of the Luedeking-Piret kinetic model parameters, α and β, it was found that the lipase production by Candida rugosa is growth associated.
Lipase production by Candida rugosa was carried out in submerged fermentation. Plackett-Burman statistical experimental design was applied to evaluate the fermentation medium components. The effect of twelve medium components was studied in sixteen experimental trials. Glucose, olive oil, peptone and FeCl3?6H2O were found to have more significance on lipase production by Candida rugosa. Maximum lipase activity of 3.8 u mL-1 was obtained at 50 h of fermentation period. The fermentation was carried out at optimized temperature of 30oC, initial pH of 6.8 and shaking speed of 120 r/min. Unstructured kinetic models were used to simulate the experimental data. Logistic model, Luedeking-Piret model and modified Luedeking-Piret model were found suitable to efficiently predict the cell mass, lipase production and glucose consumption respectively with high determination coefficient(R2). From the estimated values of the Luedeking-Piret kinetic model parameters, α and β, it was found that the lipase production by Candida rugosa is growth associated.
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- 2008年IBS2008专栏
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