重组HIV-TATm-Survivin(T34A)蛋白制备及其促癌细胞凋亡活性研究

摘要:

从人乳腺癌细胞系B-Cap-37中克隆出Survivin 的cDNA，并对其中编码34位Thr的密码子定点突变为Ala的密码子后，经一系列基因操作方法将天然HIVTAT转导肽的突变体基因HIVTATm引入Survivin (T34A)基因的5′端，正确构建了表达载体pRSET-B-HIV-TATm-Survivin (T34A)，经转化E. coli BL21 (DE3)后诱导表达，目的蛋白质以包涵体形式表达，占菌体总蛋白的45%。经3.7L发酵罐分批发酵可收获650mg/L的包涵体，经阳离子交换、凝胶层析分离和柱上复性与透析，得到纯度达96%以上的可溶性目的蛋白HIV-TATmSurvivin (T34A)。目的蛋白对人乳腺癌细胞B-Cap37、人胰腺癌细胞SW1990和人肝癌细胞SSMC-7721作用4h后有在细胞形态上呈现出显著的凋亡特征，而对人宫颈癌细胞系Hela不敏感, 对正常的人内皮细胞系EVC304未见明显影响。作用24h时MTT法检测显示，120μg/mL目的蛋白对SW1990、BCap37、SSMC7721和Hela细胞的抑制率分别达到89%、63%、59.5%和39%，且具有剂量依赖性。对最为敏感的SW1990和BCap37以每孔60μg/mL终浓度的目的蛋白作用48h的流式细胞技术检测发现，凋亡率分别为25.6%和19.3%，与对照相比，实验组细胞出现明显的凋亡峰，细胞周期的分布发生明显的变化，65%以上的癌细胞被阻滞于G1期。体外实验结果显示重组目的蛋白具有较强的抑制癌细胞增殖和促进凋亡作用，预示着良好的抗癌前景。

Abstract: