为探究聚苯乙烯纳米塑料-植物蛋白冠的形成过程以及蛋白冠的形成对植物可能造成的影响,本研究选用3种平均粒径为200 nm不同表面修饰的聚苯乙烯纳米塑料微球和新几内亚凤仙(
To investigate the formation of polystyrene nanoplastic-plant protein corona and its potential impact on plants, three differently modified polystyrene nanoplastics with an average particle size of 200 nm were taken to interact with the leaf proteins of
据统计,全球生产的塑料约79%被填埋或遗弃在自然界中[
研究表明,纳米颗粒可以穿过细胞层结构进入生物体[
理论上,纳米塑料可以和植物蛋白形成蛋白冠。但迄今由于此类研究很少,导致纳米塑料与植物蛋白质结合能否形成蛋白冠、蛋白冠对植物蛋白质和纳米塑料的影响等一系列相关科学问题仍不清晰。这对于深入理解和分析纳米塑料的生态风险是非常不利的。因此,本研究选用环境中最常见的聚苯乙烯纳米塑料和新几内亚凤仙的叶蛋白作为塑料模型和蛋白模型,通过体外实验,明确不同表面修饰(无修饰、氨基修饰和羧基修饰)的纳米塑料与叶蛋白形成蛋白冠的可能性,探究蛋白冠的形成转化特征和性质,为深入探讨纳米塑料与植物体内蛋白的相互作用及其作用产物对纳米塑料的毒性影响提供理论依据。
植物材料:将长势一致且无病虫害的新几内亚凤仙成株置于恒温光照培养箱中培养。培养条件:光照-黑暗周期为12 h,光照时段的光照强度和温度为3 000 lx和23 ℃,黑暗时段的温度为18 ℃;空气湿度为85%。培养后用于叶蛋白质提取。
纳米塑料:3种标示粒径为200 nm (实际粒径以实验表征结果为准)、不同表面修饰的聚苯乙烯纳米塑料均购自天津大鹅科技有限公司。表面修饰分别为带正电的氨基聚苯乙烯微球、带负电的羧基聚苯乙烯微球和不带电的无表面修饰聚苯乙烯微球。
利用提取试剂盒(上海贝博生物科技有限公司)提取植物总蛋白。将500 mg洗净擦干后的鲜嫩叶组织置于研钵中,加入液氮充分研磨后加入500 μL提取液。将研磨后的液体转移至预冷的干净离心管中,在4 ℃条件下振荡30 min。振荡后的离心管放入离心机,在4 ℃、12 000×
采用考马斯亮蓝法测定蛋白提取液中叶蛋白浓度,使用超纯水将提取液中的叶蛋白浓度稀释至0.1 mg/mL。
使用超纯水将3种纳米塑料配制成浓度为1 mg/mL的分散液,分别与浓度为0.1 mg/mL的叶蛋白提取液等体积混匀。每次吸取2 mL分别于25 ℃、400 r/min摇床上培养2、4、8、16、24 h和36 h。培养结束后,在10 000×
将纳米塑料-蛋白复合物和纳米塑料样品置于不同离心管中,离心管口用纱布封闭固定后放入超低温冰箱(Sanyo公司,MDF-U53V)预冷2 h。取出后的离心管放入真空冷冻干燥机(Labconco公司,FreeZone 4.5 L)中冷冻干燥24 h。取少量样品,用离子溅射镀膜仪在样品表面镀膜,然后利用场发射电子扫描显微镜(Hitachi Limited公司,SU8010)测定各样品的形貌特征,获取照片。
将少量干燥样品置于制样片上,用原子力显微镜(Bruker公司,Multimode 8)观察样品的粒径和粗糙度。在每个样品结果图中随机选取10个样点,利用NanoScope Analysis 1.5软件测定纳米塑料及纳米塑料-蛋白复合物的粗糙度。
用超纯水将纳米塑料和纳米塑料-蛋白复合物配制成浓度为50 μg/mL的均匀溶液,利用纳米粒度仪和zeta电位分析仪(Malvern公司,Zetasizer Nano ZS90)测定各样品的水合粒径和zeta电位。
将反应36 h后各处理的纳米塑料-蛋白复合物样品分别加入300 mL的1×SDS上样缓冲液中,使用移液枪吹打摇匀。沸水浴中加热10 min后,12 000×
采用液相色谱-串联质谱(liquid chromatography- tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)分析纳米塑料-植物蛋白冠的表面蛋白组成。首先对溶液样本进行SDS-PAGE,切取相应胶条后脱色,取真空冷冻干燥后的粉末样本,与加载缓冲液(1×)混合,用移液器反复吹打,沸水浴加热10 min。10 000×
以上所有实验均进行3次平行实验,相关数据均利用Excel软件进行数据处理,利用SPSS 20.0软件进行统计学分析,数据采用平均值±标准误差(
3种不同表面修饰的纳米塑料表面均表现为表面平滑、大小均一、排列紧密但无粘连或团聚现象(
纳米塑料的扫描电镜成像
Scanning electron microscopy of nanoplastics. A: Amino-modified nanoplastics. B: Carboxyl-modified nanoplastics. C: Unmodified nanoplastics.
相互作用后的纳米塑料-叶蛋白复合物的扫描电镜成像
Scanning electron microscopy of nanoplastics-leaf protein complexes after interaction. Group 1 (A, B, and C), group 2 (D, E, and F), and group 3 (G, H, and I) represent amino-modified nanoplastics-leaf protein complexes, carboxyl-modified nanoplastics-leaf protein complexes, and unmodified nanoplastics-leaf protein complexes after 4 h, 8 h, and 36 h of reaction, respectively.
三种纳米塑料样品的粒径较为均一,粗糙度较小。但与植物叶蛋白混合反应后发现,随着反应时间的增加,纳米塑料的形貌变化更加明显并且粗糙度表现出增大特征。
原子力表征结果如
纳米塑料的原子力显微镜成像及表面粗糙度分布
Atomic force microscopy imaging and surface roughness distribution of nanoplastics. A: Amino-modified nanoplastics. B: Carboxyl-modified nanoplastics. C: Unmodified nanoplastics.
纳米塑料与叶蛋白反应4 h后,90%的氨基修饰纳米塑料-叶蛋白复合物粗糙度集中在20–30 nm之间;90%的羧基修饰纳米塑料-叶蛋白复合物粗糙度集中在20–30 nm之间,90%的无修饰纳米塑料-叶蛋白复合物粗糙度集中在20–30 nm之间。对比2.2.1结果发现,3种纳米塑料-叶蛋白复合物粗糙度均升高10–15 nm (
相互作用后纳米塑料-叶蛋白复合物的原子力显微镜成像及表面粗糙度分布
Atomic force microscopy imaging and surface roughness distribution of nanoplastics-leaf protein complex after interaction. Group 1 (A, B, and C), group 2 (D, E, and F), and group 3 (G, H, and I) represent amino-modified nanoplastics-leaf protein complexes, carboxyl-modified nanoplastics-leaf protein complexes, and unmodified nanoplastics-leaf protein complexes after 4 h, 8 h, and 36 h of reaction.
反应8 h后,60%的氨基修饰纳米塑料-叶蛋白复合物粗糙度集中在25–30 nm之间,80%的羧基修饰纳米塑料-叶蛋白复合物粗糙度集中在25–35 nm之间,90%的无修饰纳米塑料-叶蛋白复合物粗糙度分布范围在25–35 nm之间。与反应4 h后的结果比较发现,在反应4–8 h时间段内,3种纳米塑料-叶蛋白复合物的粗糙度有0–10 nm左右的升幅(
反应36 h后,80%的氨基修饰纳米塑料-叶蛋白复合物粗糙度集中在40–50 nm之间,90%的羧基修饰纳米塑料-叶蛋白复合物粗糙度集中在40–50 nm之间;90%的无修饰纳米塑料-叶蛋白复合物粗糙度集中在40–50 nm之间。在反应8–36 h时间内,3种纳米塑料-叶蛋白复合物的粗糙度进一步增加,升幅为10–15 nm (
氨基修饰纳米塑料、羧基修饰纳米塑料和无修饰纳米塑料的水合粒径分别为252.50、213.60和191.80 nm (
纳米塑料-植物叶蛋白复合物的水合粒径
Hydration particle size of nanoplastics-leaf protein complex. A: Amino-modified nanoplastics-leaf protein complexes. B: Carboxyl-modified nanoplastics-leaf protein complexes. C: Unmodified nanoplastics-leaf protein complexes. Using the significant difference letter notation method, the same letter indicates that there is no significant difference between the two (
3种纳米塑料zeta电位绝对值分别为:氨基修饰纳米塑料27.03 mV、羧基修饰纳米塑料24.23 mV和无修饰纳米塑料26.83 mV。Zeta电位和表面电荷间存在直接关系。纳米塑料-蛋白复合物的zeta电位绝对值大小可以反映其稳定性,zeta电位绝对值越大稳定性越强。纳米塑料-叶蛋白复合物的zeta电位绝对值结果如
纳米塑料-叶蛋白复合物的zeta电位绝对值
Zeta potential absolute of polystyrene nanoplastics-leaf protein complex. A: Amino-modified nanoplastics-leaf protein complexes. B: Carboxyl-modified nanoplastics-leaf protein complexes. C: Unmodified nanoplastics-leaf protein complexes. Using the significant difference letter notation method, the same letter indicates that there is no significant difference between the two (
LC-MS/MS从不同处理的纳米塑料-蛋白复合物中分别检测出数量不一的蛋白质。对Expasy数据库及NCBI数据库中各蛋白等电点的查询结果表明(
蛋白冠组分等电点分布图
Isoelectric point distribution map of protein corona composition.
根据质谱结果显示出的各个蛋白的理论分子量可以判断不同表面修饰纳米塑料对特定分子量范围蛋白质的吸附偏好。结果显示,在纳米塑料-叶蛋白的形成过程中,3种纳米塑料均偏好吸附蛋白分子量在0–60 kDa范围内的蛋白。在氨基修饰纳米塑料-叶蛋白冠中,分子量在20– 40 kDa范围内的蛋白占比24%;在羧基修饰纳米塑料-叶蛋白冠中,有26%的蛋白分子量在40–60 kDa范围内;在无修饰纳米塑料-叶蛋白冠中,有30%的蛋白分子量在20–40 kDa范围内(
蛋白冠组分分子量分布图
The histogram of molecular weight distribution of protein corona.
根据GO注释从生物学过程、细胞组分以及分子功能3个角度对蛋白冠组分进行分析,结果表明电荷会影响到蛋白冠的组成(
纳米塑料-叶蛋白冠蛋白组分的GO注释分析
GO annotation analysis of polystyrene nanoplastics-leaf protein corona components. A: Amino-modified nanoplastics-leaf protein complexes. B: Carboxyl-modified nanoplastics-leaf protein complexes. C. Unmodified nanoplastics-leaf protein complexes.
分析发现,氨基修饰纳米塑料-叶蛋白冠中有接近90%的蛋白都参与到细胞代谢过程,其次是参与到植物氧化还原作用和光合作用的蛋白数量。羧基修饰的纳米塑料-叶蛋白冠中参与氧化还原生物过程的蛋白种类最多,其次是参与前提代谢物的生成以及能量电子传递的蛋白数量。无修饰纳米塑料-叶蛋白冠中有将近40%的蛋白质参与到植物的光合作用,而参与植物前体代谢物的生成以及能量传递过程的蛋白数量仅次于参与光合作用的蛋白数量。
3种纳米塑料在与叶蛋白相互作用形成蛋白冠后,细胞组分高度相似。在3种蛋白冠组分中均含有大量与光合作用相关的细胞组分蛋白,如:叶绿体组分、光合膜组分、类囊体膜组分等。
3种纳米塑料与叶蛋白反应形成蛋白冠后,3种纳米塑料均吸附了影响电流载体活性的相关蛋白,且电流载体活性相关蛋白在3种蛋白冠中含量均超过其他分子功能蛋白。
由于独特的理化性质,当纳米颗粒进入生物体后很容易和生物体液中的大分子物质,如蛋白质,发生相互作用,在表面吸附一层或多层蛋白,形成纳米颗粒-蛋白质复合物,即蛋白冠[
有研究表明,蛋白冠的形成是一个由软蛋白冠逐渐转化成硬蛋白冠的动态过程[
还有研究证明,表面电荷会影响纳米颗粒对蛋白的吸附量[
Sakulkhu等[
Arora等[
本研究仅选用了与土壤中来源相关的聚苯乙烯纳米塑料与新几内亚凤仙叶蛋白进行实验,验证蛋白冠的形成及对纳米塑料和植物蛋白的影响。下一步研究工作可选择环境中常见的多种纳米塑料与更多有代表性的生物蛋白开展多元化的系统研究,还可结合分子模拟手段进行纳米塑料在体内形成蛋白冠的相关研究,从而为探索纳米塑料的环境影响提供更多理论与数据支持。此外,区别于纳米金和纳米银等金属纳米颗粒,属于非金属的纳米塑料在生物体内的定位及定量分析存在较大困难,检测手段有很多限制,今后可以尝试拓展新思路,通过鉴定蛋白冠的组成反推纳米塑料进入植物器官或细胞的过程。
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