口蹄疫 (Foot-and-mouth disease，FMD) 是由口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus，FMDV) 引起的一种烈性的动物传染病，中国农业部规定为一类动物疫病^[1]。FMDV属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属，有7种血清型，包括A、O、C、Asia 1和SAT 1、2和3，其中血清型之间没有交叉保护现象^[2]。FMDV基因组为单股正链RNA，病毒基因组由约8 500个碱基组成，RNA被衣壳蛋白包裹，其正二十面体衣壳由4种结构蛋白VP1-VP4各60份拷贝构成。FMDV翻译成1个多聚蛋白，该多聚蛋白被蛋白酶裂解成结构蛋白 (VP1、VP2、VP3和VP4)和非结构蛋白 (L、2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D)^{[3, 4, 5]}。

口蹄疫疫苗免疫是口蹄疫防控与净化的核心技术手段。在口蹄疫疫苗生产中，口蹄疫灭活疫苗主要是纯化FMDV的140S^[6]。FMDV经纯化后，病毒的非结构蛋白3A、3B和3C会被除去。因此，现在主要采用3ABC-ELISA来鉴别口蹄疫的感染与免疫。但无论是转瓶培养还是悬浮培养工艺制备的抗原都无法百分之百除去非结构蛋白，由于许多国家存在全国性的大规模免疫，加上有些动物存在多次免疫的现象，因此影响3ABC-ELISA的检测结果，所以开发新的口蹄疫标记疫苗及其检测方法是现在国内外都迫切需要的^{[7, 8]}。

FMDV的3D蛋白是病毒感染相关蛋白，在疫苗生产中会被部分保留^{[9, 10]}。3D蛋白表面存在B细胞表位，能诱导B细胞产生免疫应答^{[11, 12]}。Hohlich等^[13]已经对FMDV中的线性B细胞表位进行了鉴定，在这个基础上Yang等^[14]依照3D的蛋白序列分段合成了多条表位肽，利用中和抗体与合成肽反应对3D蛋白上的抗原抗体结合位点进行定位，结果表明3D蛋白上第20位氨基酸到第40位氨基酸区域是3D蛋白抗原与抗体的结合位点，又利用合成肽制备的单抗与表达3D蛋白进行Western blotting实验，结果显示二者反应良好，从而又进一步验证了其结论。Uddowla等在3D蛋白中第27位氨基酸和31位氨基酸发生突变后会将抗原表位消除，产生的新抗原表位完整地保留了原始表位的特性^[15]。

我们在疫苗种毒株上进行改造，突变表位，使改造的疫苗株能诱导新的抗体，再通过检验抗体的差异性达到与野毒株区分的目的^[16]。通过突变FMDV 3D蛋白中第27位和第31位氨基酸，改变原有的抗原表位，将突变后的抗原表位作为负标记，构建抗原表位标记重组病毒，拯救病毒并对其生物学特性进行分析，最后利用相应的合成肽对引入负标记的效果进行验证。本研究旨在构建一株FMDV表位突变病毒株作为候选标记疫苗株。

FMDV Asia 1型感染性克隆pAsia 1-FMDV，该感染性克隆含有Asia 1/HN/2006株的结构蛋白基因^[17]，其3D区域上下游分别带有酶切位点CalⅠ和SbfⅠ^[18]。转染用BHK-21细胞为本实验室保存。

限制性内切酶CalⅠ和SbfⅠ购自NEB公司。Primer START HS DNA聚合酶、pMD₂₀-T载体、DNA marker等购自TaKaRa公司。Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System购自Promega公司。AxyPrep Plasmid Miniprep Kit购自AxyGEN公司。培养细胞的MEM细胞培养基与胎牛血清购自Hyclone公司。细胞转染所用的Lipofectamine^TM2 000，Opti-MEM I Medium购自Invitrogen公司。Western blotting和间接免疫荧光试验中所用的一抗均由本实验室制备。亲本毒株感染牛获得的血清命名为Anti-Asia 1-pAb，重组毒株感染牛获得的血清命名Anti-rAsia 1-3DM-pAb。二抗为购自SANTA公司的山羊抗牛IgG-HRP。3D原始表位合成肽3D-P与3D突变表位合成肽3D-M由中农威特生物公司合成。

根据已构建的pAsia 1-FMDV全长序列，引物由南京金斯瑞生物技术公司合成引物 (表1)。亲本毒株3D原始表位多肽3D-P:N-MRKTKLA PTVAHGVFNPEFGC-C。重组病毒3D突变表位多肽3D-M:N-MRKTKLAPTVAYGVFRPEFGC-C。两条合成肽由中农威特生物公司合成。

以载体pAsia 1-FMDV为模板，使用引物3DF和3DR扩增3D的片段，将此片段连接到pMD₂₀-T载体中，得到p3D-T。

以p3D-T为模板，通过引物3DMF和3DMR对目的片段进行突变，将3D区域的第27位氨基酸由H突变成Y以及第31位的N突变成R。PCR反应体系：Primer START HS DNA聚合酶25 μL，模板质粒2 μL，上下游引物各1 μL，用水补至50 μL。PCR条件：94 ℃变性3 min；94 ℃变性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃继续延伸8 min。PCR产物转化，测序鉴定，引入突变的重组质粒标记为p3DM-T。

用CalⅠ和SbfⅠ酶切并回收带有3D抗原表位突变的质粒p3DM-T，用其替换pAsia 1-FMDV中相应的片段，得到prAsia 1-3DM，并通过酶切和测序验证。

将构建的重组质粒prAsia 1-3DM在Lipofectamine^TM 2000介导下转染生长至70%−80%单层BHK-21细胞，在37 ℃，5% CO₂培养箱中孵育4 h后，将转染培养基Opti-MEM用含10%胎牛血清的DMEM培养基替换，继续培养72 h，此期间观察细胞病变出现的情况，待细胞病变达90%时，收获病毒反复冻融3次，继续接种BHK-21细胞，直至得到能够稳定传代的重组病毒，将其命名为rAsia 1-3DM。

收集转染prAsia 1-3DM后发生病变的细胞上清用于传代，收集前5代的病毒使用RNeasy Mini Kit试剂盒提取各代次的RNA，然后利用RT-PCR扩增含有3D蛋白区域的基因，并将PCR纯化的产物回收后送南京金斯瑞生物技术公司测序，并对序列进行对比分析。

将收获的细胞毒接种至生长80%的BHK-21细胞的载玻片，病毒与细胞作用6 h，用PBS充分洗涤，用4%多聚甲醛固定30 min，用PBS充分洗涤，滴加Anti-rAsia 1-3DM-pAb，37 ℃湿盒孵育30 min，PBS漂洗后加入FITC标记的山羊抗牛IgG，置于湿盒内37 ℃避光孵育30 min，在Olympus倒置显微镜下观察，同时设正常BHK-21细胞为阴性对照。

将收获的第4代rAsia 1-3DM细胞适应毒皮下接种3日龄乳鼠8只，接种剂量为每只0.2 mL，对照组3只接种PBS缓冲液，观察小鼠的发病及死亡状况。

将适应稳定重组病毒rAsia 1-3DM及其亲本株Asia 1分别用MEM进行10倍系列稀释 (10^-3.0−10^-8.0)。将稀释后病毒液分别加入铺有单层BHK-21细胞的2 mL培养瓶中，每个稀释度4瓶，200 μL /瓶，同时设立空白对照一组，每瓶加200 μL MEM。放入37 ℃，5% CO₂培养箱中进行培养，观察3 d，用Reed-Muench氏法计算TCID₅₀^[19]。

将适应稳定的重组病毒rAsia 1-3DM及其亲本株分别用MEM进行10倍系列稀释 (10^-3.0−10^-8.0)，每个稀释度接种10只2−3日龄的乳鼠，10只乳鼠随机分为两组，每组5只，每只颈部皮下接种200 μL稀释好的病毒，同时设立空白对照组，仅注射MEM，观察3 d，用Reed-Muench氏法计算LD₅₀^[19]。

将Anti-rAsia 1-3DM-pAb和Anti-Asia 1-pAb用生理盐水按1∶1稀释，置56 ℃水浴锅中灭活30 min。在96孔板中，将已灭活处理的血清用无血清细胞培养液进行倍比稀释 (1∶16−1∶2 048)，每个稀释度选取4个孔，每孔加入50 μL稀释好的血清。每孔分别加入50 μL浓度为100 TCID₅₀ /50 μL的亲本病毒与重组病毒，同时设立阳性对照与阴性对照。将细胞板置于37 ℃，5% CO₂温箱中，使病毒与血清反应1 h。血清病毒反应1 h后取出，每孔加入50 μL细胞悬液，在 37 ℃，5% CO₂温箱中培养48 h后，在显微镜下观察细胞病变状况，并详细记录各孔细胞生长情况，计算Anti-rAsia 1-3DM-pAb与Anti-Asia 1-pAb的中和效价。

利用亲本病毒与重组病毒3D突变区域的表位合成肽进行Western blotting实验，用于鉴别两个毒株。配制用于分离1 kDa的小分子蛋白的Tricine-SDS-PAGE胶^[20]，每孔分别加30 μL处理好的合成肽样品3D-P和3D-M，电泳结束后，恒压15 V转膜15 min，用含5%脱脂奶粉的TBST室温封闭2 h，TBST清洗3次，每次10 min，然后加入1∶1 000倍稀释的一抗，在4 ℃条件下孵育2 h，用TBST清洗3次，每次10 min，之后加入1∶2 000稀释的二抗在室温孵育2 h，TBST清洗3次，每次10 min，压片，曝光。

PCR扩增含有3D蛋白序列的基因片段大小约为3 500 bp，1%的琼脂糖凝胶电泳结果显示目的条带在3 500 bp左右，条带大小与预期相符，成功地获得了目的片段。将目的片段进行PCR突变后，使用CalⅠ和SbfⅠ限制性内切酶对目的片段和载体进行酶切，将突变后的目的片段替换到pAsia 1-FMDV。将获得的阳性质粒使用CalⅠ和SbfⅠ双酶切鉴定，电泳结果显示：目的大小约为3 500 bp，载体约为8 000 bp，结果与预期相符。序列分析显示，3D蛋白上的第27位氨基酸H突变成Y，第31位的氨基酸N突变成 了 R (图1)，表明构建的重组质粒prAsia 1-3DM符合预期。

图1 重组质粒prAsia 1-3DM 3D基因突变区域的测序图 Fig.1 DNA sequence of the mutated region of the 3D gene in prAsia 1-3DM.

图选项

使用脂质体介导重组质粒转染BHK-21细胞，转染后的BHK-21细胞在48 h后出现了明显的致细胞病变效应 (Cytopathic effects，CPEs)。病变具体表现为细胞变圆，呈葡萄串状分布。收取转染细胞上清继续传代，细胞发生病变时间缩短，CPEs更加典型 (图2)。

图2 重组病毒感染细胞后引起的细胞病变效应 Fig.2 Cytopathic effects in BHK-21 cells infected with rAsia 1-3DM. (A) Before infection. (B) BHK-21 cells 48 h post-infection.

图选项

使用转染的细胞上清进行连续传代，收集第 5代的细胞适应毒，提取病毒的RNA进行RT-PCR，扩增3D基因片段。1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，目的基因约3 500 bp，序列分析结果表明，各代次的突变后的3D基因序列没有发生回复突变。

间接免疫荧光结果显示，重组病毒感染的细胞有荧光，对照组没有荧光产生。说明病毒开始在细胞内复制，并有病毒蛋白产生 (图3)。

图3 重组病毒在BHK-21细胞中间接免疫荧光检测 Fig.3 Indirect immunofluorescence analysis of BHK-21 cells infected with rAsia 1-3DM. (A) BHK-21 cells infected with rAsia 1-3DM. (B) Uninfected BHK-21 cells.

图选项

拯救的重组病毒rAsia 1-3DM前3代内均可使BHK-21细胞产生明显的CPE，在第8代后病变时间均能够稳定在9−10 h。经计算得出rAsia 1-3DM的TCID₅₀为10^-7.0/0.2 mL，亲本毒株的TCID₅₀为10^-7/0.2 mL，二者无明显差异(P>0.05)。

将拯救出的重组病毒rAsia 1-3DM经皮下接种3日龄乳鼠36 h后，乳鼠均表现不同程度的呼吸困难、后肢麻痹等症状，72 h后乳鼠全部死亡，而对照乳鼠正常，说明了拯救的重组病毒对乳鼠具有致病性。经计算，重组病毒rAsia 1-3DM的LD₅₀为10^-7.0/0.2 mL，亲本病毒Asia 1的LD₅₀为10^-7.125/0.2 mL，两者无明显差异 (P>0.05) (表2)。

病毒中和实验结果表明，抗重组病毒的血清能够与亲本病毒结合从而抑制细胞病变的产生。经过计算，Anti-rAsia 1-3DM-pAb的中和抗体水平为1∶1 024，Anti-Asia 1-pAb的中和抗体水平位为1∶1 024。实验结果表明，重组病毒能够诱导动物产生较高水平的中和抗体，Anti-rAsia 1-3DM-pAb对亲本毒株有中和效果，间接地反映出重组病毒有进一步开发成口蹄疫标记疫苗的潜在价值。

合成肽在蛋白电泳中的大小约为10 kDa，与理论大小不符，可能的解释是合成肽在实验过程中发生了聚合反应，形成了多聚体，从而分子量变大，有报道称FMDV的3D蛋白能够形成聚合物^[20]。Western blotting结果显示，Anti-rAsia 1-3DM-pAb与合成肽3D-M有明显的反应，与合成肽3D-P无反应；Anti-Asia 1-pAb能与合成肽3D-P反应，与3D-M不反应，结果与预期相符合 (图4)。结果表明，能够通过重组病毒rAsia 1-3DM中引入的负标记与亲本病毒相区别。

图4 用Western blotting鉴定合成肽3D-M和3D-P分别与rAsia 1-3DM和Asia 1抗血清的反应性 Fig.4 Western blotting analysis of the reactivity of the peptides 3D-M and 3D-P with antisera against rAsia 1-3DM and Asia 1.

图选项

我国发布了国家中长期疫病的防治规划 (2012−2020年)，其中口蹄疫是重大动物疫病中的优先防治的国内动物疫病之一。并在2015年到2020年中针对不同型的口蹄疫制定了明确的防治考核标准。由于疫苗生产中非结构蛋白纯化不完全和动物的多次免疫，使得3ABC-ELISA检测无法真实地反映出FMD的流行状况^{[21, 22]}。所以彻底解决自然感染与人工免疫的鉴别诊断问题，是实施防控和净化口蹄疫政策必要的技术支撑，也是保证畜牧业健康发展的急需技术。

本实验采用反向遗传的方法对FMDV中3D蛋白上的一个抗原表位进行突变，成功地拯救出抗原突变重组病毒rAsia 1-3DM。在病毒拯救的过程中，重组病毒感染BHK-21细胞后，细胞有一个稳定的病变时间，RT-PCR扩增的各代次细胞适应毒的3D区域经测序后，重组病毒没有发生回复突变，证明重组病毒的稳定性良好。反向遗传学操作容易造成病毒毒力下降，如：FMDV中的SAP突变，针对病毒基因组的3个点突变能够导致FMDV对猪不致病，L蛋白部分缺失会导致FMDV毒力下降^{[23, 24, 25]}。TCID₅₀和LD₅₀试验数据证明，针对病毒3D蛋白抗原表位的突变，并没有导致重组病毒毒力发生显著的变化。病毒中和实验结果表明，重组病毒能够诱导动物产生较高水平的中和抗体，且与亲本毒株反应性良好。表位合成肽的Western blotting结果表明，在3D蛋白引入抗原表位突变是成功的，突变产生的新表位与原始表位能够区分。

综上所述，本实验获得了一株口蹄疫抗原表位突变的重组病毒，为研发新的口蹄疫标记疫苗候选株提供了技术支持。