2015, Vol. 31服务
文章信息
- 唐宇, 李丽莎, 林峻
- Tang Yu, Li Lisha, Lin Jun
- TALENs技术的研究进展及其应用前景
- Advances in transcription activator-like effectors-a review
- 生物工程学报, 2015, 31(7): 1024-1038
- Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1024-1038
- 10.13345/j.cjb.140597
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文章历史
- Received: December 3, 2014
- Accepted: January 19, 2015
2. 福州大学应用基因组学研究所，福建 福州 350108
2. Institute of Applied Genomics, Fuzhou University, Fuzhou 350108, Fujian, China
基因组的定点修饰，即针对性地对遗传信息进行改造，包括三种基本形式：敲除、插入和替换。实际上，“替换”过程也可以理解为先“敲除”内源序列，再于同一位点上“插入”外源序列。发展自上世纪80年代的经典基因打靶技术 (Gene targeting)，通过同源重组 (Homologous recombination) 解决了上述的“敲除”和 “插入”难题。经典基因打靶技术在过去的30年里为生物技术的发展作出了贡献，但也存在许多不足之处，包括：命中率低，随机插入时有发生，打靶精确度有待提高；阳性克隆筛选、验证工作量巨大、效率较低；打靶载体的设计和构建较为繁琐。
随着全基因组测序技术 (Whole-genome sequencing) 的发展以及个体化医疗需求的扩大，在获取海量基因信息的同时，如何分析并对这些信息加以利用，开始成为基因组研究中亟待解决的重要课题。无论是功能性基因组研究或是临床医学应用，基因组编辑技术都是极为重要的组成部分。理想的基因组编辑技术应当具有靶标特异性、高效且经济[1]。而过去常用的经典基因打靶技术效率低下且费用高昂[2, 3]。因此，人工核酸酶技术一经出现便得到迅速发展。其原理是将非特异性核酸酶与DNA识别结构域人工连接形成融合工具酶。锌指核酸酶 (Zinc-finger nucleases,ZFNs) 便是这样一类工程酶。它由两个不同结构域组成：锌指结构域 (Zinc finger)，能够识别DNA序列并与之结合；核酸内切酶FokⅠ酶切结构域，可以对DNA进行切割。ZFNs技术能显著提高基因组编辑效率，并成功应用于多种生物[4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12]，基于这一技术开发的HIV治疗药物已进入二期临床实验阶段[13]。2009年，随着重复可变双残基 (repeat variant di-residues，RVDs) 与单核苷酸对应关系的破解，转录激活因子样效应物核酸酶 (transcription activator-like effector nucleases，TALENs) 的研究应用进入高速发展阶段，并有望成为替代ZFNs成为新的主流基因组编辑工具。TALENs技术实现了单个蛋白质与单核苷酸的对应，使得模块化定制的转录激活因子样效应物 (transcription activator-like effector,TALE) 结构域可以同任意目标位点DNA序列识别结合，因此TALENs具有比ZFNs更易设计、组装以及拥有更高的打靶效率。目前，TALENs已在植物、斑马鱼、青蛙、蝙蝠、猪以及人类的体细胞和多能干细胞中得到成功应用。
近年来，基因组编辑技术得到了飞速发展，ZFNs、TALENs技术在不断完善成熟，与此同时也有新的技术出现，例如成簇规律间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein,CRISPR/Cas) 技术。在此篇综述中，我们将着重介绍TALENs技术，并就其与ZFNs、CRISPR/Cas之间的差异做简要介绍。
1 TALENs：特异性识别与切割TALEN是TALE结构域与FokⅠ核酸内切酶结构域组合而成的融合蛋白。因TALE有多种变体，所以也有多种TALEN。根据功能不同，TALENs的结构分为TALEs组成的DNA识别结合结构域，以及FokⅠ核酸内切酶功能域组成的酶促切割结构域。
1.1 TALENs的识别结合结构域TALEs是一类由植物病原菌黄单胞杆菌 Xanthomonas sp.产生的蛋白质，可以通过Ⅲ型分泌系统进入宿主细胞，因此也被称为Ⅲ型效应物[14]。一旦进入宿主细胞，一些TALEs就会进入细胞核，并与相对应的DNA序列结合，转录并激活其表达。由于遗传背景不同，一般情况下，激活某些基因会增加宿主对病原菌的增殖敏感度[15]，但某些情况下也会引起宿主的防御反应[16]。
从结构上来说，TALEs蛋白的N端一般含有Ⅲ型分泌信号肽，C端则包含有一个功能性核定位信号 (nuclear localization signal,NLS) 以及一个具有真核转录激活因子特征的高效转录激活结构域 (activation domain,AD)[17] (图1A)。两者之间则是决定TALENs特异性的DNA识别结合结构域，由若干 (13-29) 个重复氨基酸单元组成，每个重复氨基酸单元含有34个呈串联排列的氨基酸[18]。每个重复单元的氨基酸序列几乎一致，仅12、13号位点的氨基酸残基是高度可变的[19]，并且是特异性识别核苷酸的关键部件 (图1B)。因此，这两个变化的特殊氨基酸残基被合称为RVD。其中，第13位残基负责识别特定核苷酸，而12位残基则承担了稳定RVD结构，并与DNA蛋白质骨架结合的功 能[20]。相同的发现也在TALE-DNA结合模拟中被提及[21]。TALEs中串联排列的RVDs与靶标DNA序列的核苷酸近乎一一对应。2009年，这一对应关系被两个研究团队分别独立破解，并刊登在同一期Science杂志上。其中，Moscou和Bogdanove[22]通过计算机扫描比对RVDs与靶标的启动子序列并分析其频率，发现RVDs与它们靶标位点的核苷酸直接对应，且表现为一个RVD对应一个核苷酸。这些对应关系存在部分的简并性，但没有明显的上下游序列依赖 (context dependence) 现象。例如在统计了383个RVD-核苷酸的对应关系后，他们发现HD是出现最为频繁的RVD并且与C存在很强的对应关系。其次是识别T的NG和识别A的NI。再次则是识别G或是A的NN。另一个小组的Boch等[23]则通过实验分析TALEs与靶标DNA分子的对应关系进而得出了与Moscou等类似的结论。这些RVD-核苷酸的对应关系被人们归纳出来并用于设计能识别特定DNA序列的TALEs[18, 24, 25, 26]。
近年来，许多研究中应用了人工设计的核酸酶来进行基因组编辑[27]。这些编辑工具通常是由可定制的DNA识别结合域与非特异性的核酸内切酶融合而成[28] (如ZFNs，也如TALENs)。ZFNs与TALENs通常连接的是FokⅠ核酸内切酶。FokⅠ是最初分离于细菌海床黄杆菌Flavobacterium okeanokoites的一类ⅡS型核酸酶[29]。在有底物DNA存在时用胰蛋白酶水解可以得到41 kDa的N端DNA结合结构域与 25 kDa的C端DNA酶切结构域[30]。通常，Ⅱ型限制性内切酶的切割位点与其结合位点相同或邻近，ⅡS型核酸内切酶则在距离结合位点固定距离处切割DNA双链。对于FokⅠ核酸酶，其DNA结合结构域识别结合一段非回文序列5′-GGATG-3′/5′- CATCC-3′，然后酶切结构域在结合位点下游距离9个和13个核苷酸的位点非特异性地切割DNA双链[30, 31]。FokⅠ单体并不具有活性，只有当它与靶标DNA结合并且 形成二聚体，在二价金属离子辅助下才具有酶切活性[32]。根据此特性，人们设想通过使两分子FokⅠ分别在两个相邻识别位点结合，形成具有核酸酶功能的非同源二聚体，切割两位点之间的DNA双链[28, 33, 34]。
2 TALENs的设计与构建2010年6月，Christian等[24]首次报道了人工构建TALENs技术。他们将AvrBs3和PthXoI中天然存在的TALEs序列与Fok I融合形成融合蛋白后对目标DNA进行打靶，并对结合位点间距不同的TALEN打靶效率进行比较，分析TALEN二聚体最佳的打靶位点距离。实验结果显示，AvrBs3和PthXoI的最佳打靶位点间距分别是21 bp和24 bp，并且它们同时在15 bp处有相对较大的活性。TAL结构域和FokⅠ结构域之间的连接区 (Linkers) 序列长度对于TALEN的活性影响巨大，而两个TALEN结合位点的间隔区 (Spacers) 序列长度则与FokⅠ二聚体的形成效率息息相关。2011年，Li等用来自AvrXa7和PthX01中天然存在的TALE重复序列进行了类似的实验，并比较了将FokⅠ结构域连接到TALE结构域N端和C端构成的TALEN融合蛋白的活性，结果发现FokⅠ连接到TALE的C端时效率更高[18]。对于TALEs的活性影响，尽管不同TALEs对N端、C端的依赖程度不同，但对于绝大多数TALEs来说，N端对于TALE与DNA的相互作用会更为重要[35]。
植物中的天然TALEs的结合序列都是从一个T (与TALE的N端的0位重复单元相对应) 开始的[22]。尽管这个T碱基同RVD没有关联，但却能参与引起本氏烟草Nicotiana benthamiana中的hax3的激活反应[23]。虽然Sun等[36]使用以A、C或G起始的TALENs也能识别并敲除导致镰刀型贫血病的人类血红蛋白 (HBB) 基因。但这个T碱基一般情况下仍是TALE活性所必需的[37]。Scholze等[38]的研究显示至少有4个因素会影响重复单元与DNA的识别结合：启动基因表达的最小重复单元数量；重复单元与DNA错配引起的副作用；不同重复单元特异性不同；位点依赖和上下游序列依赖型错配。
而Jankele和Svoboda则从特殊重复单元类型和TALE-DNA结合模式中推测出来一些合理设计、组装TALE重复结构域的要求[39]：
1) 选择带有5′-T0碱基的中央重复结构域 (central repeat domain，CRD) 识别序列。在无法满足时，可以选用专一性较低的5′-N0来进行调整[40]。
2) 对待选的靶位点的唯一性进行验证 (例如，该序列没有因存在高度重复片段而产生的多态性)。
3) 尽管一般情况下重复单元的最适长度会因不同个体的同源序列变化而存在区别[20, 41, 42, 43]，但组装TALENs时最好不少于14个重复单元，而TALE转录激活因子则需要18-20个的重复单元。
4) 应该含有至少4个位置均衡的高效RVDs (例如，HD>C,NG>T 或者NN>G/A)，特别是在CRD的末端，高效的RVDs可以起到稳定TALE-DNA结合的作用[44, 45]。
5) 避免出现3个相同RVDs连续延伸的情况，特别是NG。研究显示即使只有3个NG连接成串也会导致TALE蛋白折叠畸形。
6) 如果需要区别对待A、G，则最好使用NH而非NN去识别G[46]。
7) 使用NI特异性识别A时需要搭配使用足够高效的RVDs[46]。
8) 使用含有整个N端区域 (N-terminal region，NTR) (约150个氨基酸) 以及C端到效应子距离合适并经过验证的TALE骨架。目前，在多种生物中使用最为频繁的骨架是Miller 等[25]建立的。当然，Mussolino等[35]和Zhang等[47]建立的骨架也是可靠并被广泛使用的。
9) 最后，可以通过越来越可靠的在线工具来进行TALEN设计与脱靶分析。
针对由于高度重复与高度特异性而导致的TALENs组装困难，研究者开发出多种方案用以克服这些困难，从而快速、高效地组装TALENs。Zhang等[47]发明了一种逐层连接策略。其原理是先组装3个四聚体然后再根据每个四聚体两端的独特粘性末端组装为线性串联复合物。Weber等[48]通过Golden Gate克隆技术来合成TALEs。这一克隆技术需要ⅡS型核酸酶并包含两个连续步骤：分别是基于BsaⅠ序列的重复单元预装配以及基于BpiⅠ序列的预装配模块的合成反应。而Cermak等[49]则通过设计了一种不依赖于PCR的策略使得TALEs的实用性和灵活性都得到了很大扩展。2012年，Li等[50]描述了一种通过Ⅱ型限制酶进行快速、高效地构建TALE转录激活因子 (TALE transcription factors,TALE-TFs) 和TALENs骨架的一步限制酶连续连接反应。而Sanjana等[51]改良了TALE-TFs用于人类基因的激活调控和TALENs用于调整基因的敲除或插入。还有一种固相高通量自动连接 (fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput,FLASH) 技术可以实现TALENs的大规模组装[52]。这一方法是通过液相操作装置操作载有预组装四聚体的磁珠进行连续连接来构建TALENs的。而Briggs等[53]设计了一种称为迭代帽组装 (ative capped assembly,ICA) 的方法，通过连续连接重复单体从而相当成功且快速地构建定制TALENs。这一方法与FLASH的不同之处在于它是基于固相支撑的，可以使最终产物达到21个单体的概率大大增加。近期，Schmid-Burgk等[54]设计了一种非连接酶依赖型克隆 (ligation-independent cloning,LIC) 技术。他们构建了一个五聚体TALE重复片段文库用以合成TALEs。这一方法使得TALENs的构建更加简单快速、高通量以及自动化。尽管脱靶的影响仍是制约TALENs技术广泛应用的主要问题[35, 55]，但随着技术的发展[45]，在可以预见的将来，减小因非特异性切割而带来的细胞毒性、减小上下游序列依赖现象[56]、增大TALEs的识别特异性将会使得TALENs的应用更为广泛和实用。
3 TALENs的应用随着TALENs组装技术的进步，TALENs技术已经成功应用于多个领域、多个物种。包括：线虫[57]、斑马鱼[58, 59, 60]、鼠[55, 61]、蚕[62]、哺乳动物[25]、蟋蟀[63]、果蝇[64]、人类[25, 36, 65, 66, 67]以及多能干细胞[68, 69]。2011年，Sander等[58]利用Miller等[25]发明的方法构建了TALENs，并获得了hey2和gria3a突变的斑马鱼体细胞，其突变效率为11%-33%。Huang等[70]则利用一种单元组装法构建的TALENs对tnikb和dip2a两个基因成功打靶并获得了可以稳定遗传的斑马鱼突变体。而到了2012年，Bedell等[71]借助于TALENs切割DNA后产生的双链断裂 (Double strand break,DSB)，把短的单链DNA (Single-stranded DNA，ssDNA，包含loxP序列) 精确地重组到斑马鱼的基因组中。这一突破性研究为条件基因打靶奠定了必要的技术基础。而Reyon等[52]使用FLASH系统组装了48个TALENs并通过基于增强型绿色荧光蛋白 (enhanced green fluorescent protein,eGFP) 的荧光结果去检测这些蛋白质的活性，为TALENs活性检测提供了直观方法。除了应用TALENs进行基础研究，TALENs也被用于治疗性应用，包括镰刀型贫血病的治疗[36]、慢性病毒感染[72]以及神经性家族遗传病[73]以及其他疾病的治疗、预防与矫正[74, 75, 76, 77, 78, 79]。此外，Kim等[80]使用TALENs技术成功获得了具有表面抗原H-2K (k) 和潮霉素抗性蛋白的突变体，然后分别使用磁分离和潮霉素抗性培养处理进行细胞分离。结果发现，TALENs技术可以有效地富集突变体。这也意味着TALEN技术可以更广泛地应用于生物医学研究，使核酸重组效率得到很大提高。
随着TALEs技术的研究深入与应用开展，许多研究者给出了适当的建议。Zhang等[1]认为无论是在TALEs的基础研究还是临床应用中，许多因素都应该审慎地进行考虑。这些因素包括但不限于：RVDs的特异性与效率、连接区 (Linkers) 和间隔区 (Spacers) 的长度。此外，TALEs的上下游序列依赖现象与细胞毒性也都需要进行细致的验证，特别需要注意的是对慢性病毒感染进行治疗时应考虑到可能会对宿主的基因组造成影响[72]。另外，由于天然TALEs仅在植物病原体中发现，因此临床治疗中很有可能发生免疫应答反应。
4 TALENs与ZFNs、CRISPR/Cas随着时间的推移、研究的深入，出现了多种各具特点的基因组编辑技术。
TALENs是以替代ZFNs为目标迅速发展起来的新基因组编辑技术，并且研究、应用中同ZFNs存在许多相似之处。锌指结构域是目前真核生物中最常见的DNA结合序列，也是人类基因组中最常使用的编码蛋白。单个锌指模块大约由30个氨基酸组成保守的ββα结构，其中α表面的几个氨基酸会与DNA大沟中的三个碱基对相连[81]。而不同的锌指模块对DNA的结合特异性也存在程度差异。因此，锌指模块使得DNA结合蛋白的定制化成为可能。其后，人工锌指蛋白的出现，使得锌指蛋白可以识别结合9-18个碱基对的DNA序列。而18个碱基对的识别能力则意味着能在680亿个碱基中形成特异性，是第一个能对人类基因组的特定序列进行特异性结合的技术[82, 83]。很多研究显示，在相同基因打靶时TALENs和ZFNs表现出了不相上下的打靶效率[52, 55, 58, 68]。而Mussolino等[35]比较了CCR5特异的TALENs与已经验证过的ZFNs之间的细胞毒性与特异性。其结果显示，TALENs引起了约1%的错误突变，而ZFNs的错误诱变比率则高达11%。此外，经过TALENs处理的细胞存活率是经过ZFNs处理细胞的两倍。
CRISPR序列最早于1987年由Ishino等[84]发现，Jansen等[85]将其正式命名。随后，在许多细菌和古细菌中发现了CRISPR序列和CRISPR相关 (CRISPR-associated,Cas) 基 因[86]。目前已发现的CRISPR/Cas系统可以根据Cas基因核心元件的不同分为3种类型，Ⅰ型、Ⅲ型系统需要多个Cas蛋白形成复合体才能切割DNA双链，而Ⅱ型系统则只需要一个Cas9蛋白即可[87]。CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌的一种免疫机制，目前基因组编辑中应用的多为Ⅱ型系统，通过Cas9蛋白俘获外源DNA片段并整合进宿主基因组转录产生前体CRISPR-RNA (pre-crRNA)、反式激活crRNA (trans-activating crRNA,tracrRNA) 并与形成的向导RNA (guide RNA,gRNA) 组合成Cas9核酸酶复合体[88]。在crRNA中的20 bp向导序列 (guide sequence) 以及与向导序列结合的靶向DNA 5′端的3个碱基 (protospacer-adjacent motif,PAM) [89, 90]介导下，Cas9核酸酶复合体可以对外源DNA引入DSBs使之降解，从而抵御噬菌体等外来侵入者，进行自我保护[91, 92]。CRISPR/Cas系统与TALENs、ZFNs不同之处在于，其识别特异性是由RNA而非蛋白质决定，因而设计、组装更为简便[88, 93]。一些研究显示CRISPR/Cas整体情况下的酶切活性比TALENs更为高效[88, 94]。此外，CRISPR/Cas系统可以同时对靶向基因组的多个位点进行切割或修 饰[95, 96, 97]，可以促进多位点突变疾病的治疗。
但是，基于研究时间尚短及其结构特性，CRISPR/Cas系统不可避免也存在许多不足：由于碱基识别个数的差异、PAM序列的不严格互补[88, 97, 98, 99]，CRISPR/Cas系统存在非特异性切割现象[98, 100, 101]，甚至产生较高的脱靶率[102, 103]，特异性远低于TALENs；而基于不同物种的遗传背景不同，可能需要针对性地构建Cas基因启动子及其表达载体[88, 96, 104, 105] ；CRISPR/Cas系统在对不同物种以及同一物种的不同基因进行定点编辑时，效率存在有较大的差异[106, 107]。
比较以上3种技术 (表1)，ZFNs技术积累最为丰富，但存在脱靶率高、细胞毒性大；TALENs技术与ZFNs有很大相似性，可以借鉴ZFNs的研究基础，但比ZFNs更有优势；CRISPR/Cas技术最为前沿、前景更为广阔，但受限于发展时间较短、微生物应用基础薄弱。
| Items | TALENs | ZFNs (C2H2) | CRISPR/Cas (Type Ⅱ) |
| Central domain | Tandem repeats of ~34 aa | Zinc-fingers of ~30 aa | Cas protein |
| Determining region | RVD of 12th and 13th | Alpha-1,3,6 amino acid | 20 nucleotides of crRNA and PAM squence |
| Secondary structure | Two helices connected by a short RVD-containing loop | Beta folding-beta folding- alpha helix (β-β-α) | An open bilobed architecture and nucleic acid binding clefts |
| DNA binding pattern | One repeat for one nucleotide | One zinc finger for one trinucleotide | One nucleotide for one nucleotide |
| Validity | Very little apparent context dependence | Context dependence | Depend on the PAM sequence |
| Specificity | Relatively high | Relatively low (off-target effect) | Relatively low (off-target effect) |
| Degeneracy | Existing same repeat for distinct nucleotides | Having the affinity for similar but not identical sequences their intended targets | - |
| Toxicity | No or little (if any) detectable cytotoxicity | Yes | Yes |
| Optimized dimers | 10−30 bp spacers with corresponding linkers | 18−24 bp DNA linkers with 4−7 bp spacers | - |
| Applicable sites | Arbitrary theoretically | Existing modules can’t target every possible sequence | Next to the PAM sequence |
| Design | More flexibility and repeats | Less flexibility and fingers | Simple and flexibility |
| Predictability | Qualified | Lack | Qualified |
| Intellectual property | Public cipher | Sangamo and Sigma- Aldrich | Public |
| Cost | Relatively low-cost and time-saving | Relatively costly and time- consuming | Very low-cost and time-saving |
在“国家自然科学基金”等项目的资助下，本实验室在丝状真菌的基因组编辑领域已经积累有一定的实践经验。
首先，在方法选择上，纵观ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas这三大技术，ZFNs由于前文所述的种种自身限制或缺陷，目前的研究一般不会优先考虑使用ZFNs。
而TALENs和CRISPR/Cas相比，CRISPR/Cas技术来势汹汹，从2013年第一篇应用报道刊登于Science杂志起，已有数百篇相关研究报道发表于国际顶级学术期刊，其特点和优势在于操作非常简单，只需表达Cas酶，依靠crRNA就可以靶向编辑目的DNA序列，不需要繁琐的元件拼接过程，省时省事。
因此，在研究的早期阶段，我们优先选择CRISPR/Cas开展丝状真菌的基因组编辑研究。但是，由于CRISPR/Cas的技术缺陷所造成的问题也接踵而来：
第一，CRISPR/Cas系统依赖gRNA来识别目的DNA，因此，对gRNA的序列有着严格的要求，在其他物种中，gRNA一般放置在已知的、背景非常清楚的启动子和终止子之间，例如，在人类细胞中，一般采用U6启动子和终止子，这样，才能保证gRNA在特定的碱基位置起始转录，并在特定的碱基位置终止转录。但是，丝状真菌种类繁多，对其遗传背景的研究资料较少，尤其是对启动子和终止子的研究很少，已知的启动子和终止子一般用于蛋白表达，虽然可以转录出mRNA，但是精确定位某个启动子起始转录位点或者某个终止子终止转录位点的报道几乎没有。这样，就很难获得具有准确5′及3′边界的gRNA，在无法保证gRNA序列准确的情况下，精确的基因组编辑无从谈起。而且，众所周知，丝状真菌常常产生大量的RNA酶，而gRNA容易受到真菌内源RNA酶的攻击，一旦gRNA序列有所缺失，即使只缺失1个碱基，也可能会彻底丧失功能。
第二，前文已述，CRISPR/Cas系统需要目标DNA分子上的PAM序列介导，例如，酿脓链球菌Streptococcus pyogenes来源的Cas9酶，其PAM序列是NGG；脑膜炎双球菌Neisseriameningitidis来源的Cas9酶，其PAM序列是NNNNGATT。这就意味着，CRISPR/Cas系统只能在有PAM的位置处进行DNA编辑，这就限制了其应用，如果我们想编辑的某个位点，没有PAM，那么就无法使用CRISPR/Cas系统，而这一情况在某些丝状真菌中较常遇到。
鉴于上述种种因素，我们在后期研究中，优先选择了TALENs系统。
TALENs系统只需要能够表达出TALEN酶蛋白分子即可，因此，丝状真菌中已知的启动子和终止子均可使用，另外，TALENs可以直接和目标DNA分子发生相互作用，不需要任何其他中介，不受序列特异性限制，因此靶向性更强。
其次，在实验样品的选择上，由于很多丝状真菌的菌体是多倍体，甚至有些菌体内有多个细胞核，造成了丝状真菌的遗传稳定性较差。如果基因打靶只作用于一条染色体上，或者只作用于其中一个细胞核上，那么，菌体增殖分裂的后代中，仍然会有野生型的细胞存在。这也是很多传统育种技术改造的菌株，在多次传代后出现菌株衰退的原因之一。在研究中我们发现，很多丝状真菌能产生单倍体的孢子，而这些通常被认为是休眠状态的孢子，也可以实现外源DNA的转化。若能在孢子中的单倍体上成功进行基因组编辑，那么，其子代就能有非常好的遗传稳定性，避免了后期繁琐的菌株筛选和复壮步骤。
6 TALENs 技术在工业微生物领域应用前景展望人类文明步入21世纪后，工业生物技术已经在世界范围内掀起了生物技术革命的第三次浪潮，为解决可持续发展中的重大问题，诸如能源危机、自然资源短缺、环境污染、医药产品与食品的生产等等做出了巨大贡献。在国家《“十二五”生物技术发展规划》中，工业生物技术亦被列为“前瞻性基础研究”的发展重点。选育和构建优良的工业微生物菌种，是工业生物技术产业化的前提条件，因此，“工业微生物育种技术”成为制约工业生物技术发展的关键技术。
丝状真菌 (也俗称霉菌)，广泛应用于发酵工业，在酶制剂、饲料、食品等领域有着重要用途，常见的有木霉、根霉、曲霉等等。丝状真菌与其他常见的工业微生物 (诸如酵母菌、细菌) 相比，丝状真菌的DNA转化非常困难，而且，在某些丝状真菌中，转化入细胞的外源DNA很容易随机整合到宿主的基因组上，此外，还有一些丝状真菌在同一个细胞中有多个细胞核，每个细胞核中的染色体又是多倍体，造成遗传稳定性极差等。上述原因，造成了丝状真菌基因工程的研究远远落后于其他物种。
相比于传统的基因打靶技术，TALENs 是革命性的，它集成了“精确”、“高效”、“简便”这三大优势，其发展与普及必是大势所趋，Nature杂志社更将其评为“Method of the Year 2011”。TALENs 可以根据任意的目标DNA 序列设计对应的结合结构域。TALENs在工业微生物中可以有如下的应用：1) 在需要高表达生物活性物质的菌株中，TALENs可以靶向到目标启动子或者调控区，提高目标产物的表达量；2) 在表达蛋白质的菌株中，TALENs可以敲除菌体内源蛋白酶的基因，降低表达产物被蛋白酶降解的风险；3) 在具有反馈抑制现象的菌株中，TALENs可以敲除导致抑制现象的基因，解除反馈抑制；4) 在抗生素生产菌株中，发酵产物中除了目标抗生素，常常还会有一些副产物，而这些副产物一般都具有毒性，且难以被纯化，TALENs技术的出现，可以快速敲除与副产物合成有关的基因，提高发酵产物中抗生素的纯度；5) TALENs技术还可以敲除一些菌体中冗余的、非必需的基因，这些基因常常会拖累菌体的生长速度，敲除后，可以有效地增加菌体生物量，加快发酵生产进度，节约发酵过程中所耗费的水电和人力资源等。
在工业微生物领域，制作出能够应用于人类生活的产品才是最终目的。很多丝状真菌的发酵产物，常常作为人类的食品或者药品，在日益重视食品安全和医药安全的今天，TALENs具有比传统技术方法和CRISPR/Cas系统都高的靶向精确性，用TALENs改造的基因重组菌株，无疑具有更高的生物安全性。
7 结语可定制的核酸酶使得研究人员能够快捷、有效地敲除、敲入目的基因。ZFNs技术使人们对于基因与功能的关系研究进入新的局面，而更为优秀的TALENs的出现，则为这一进程注入新的活力。TALENs的核心部件TALEs不仅可以同限制性核酸酶结合成为可定制的高特异性核酸酶，还能同转录激活结构域、表达结构域、染色质修饰结构域以及荧光蛋白结合，从而形成种类繁多，功能各异的融合蛋白。这些基于TALEs的新技术都具有极大的开发前景与实用价值，但是最吸引人的还是能够任意改造基因组的TALENs。此外，RVD与碱基的一一对应关系是目前基因组编辑领域最为简单的蛋白质-DNA互作机制，在保证准确性的前提下能极大地优化基因打靶的过程与效率。
虽然TALENs技术已经成功应用于多种生物与领域，但仍存在一些尚未明晰的疑问，比如天然TALEs的结合位点前总有一个T；TALEs的末尾RVD是半个；RVDs的特异性机理；TALEs的重复数与结合效率之间的关系；TALENs的活性影响因素；TALENs是否会引起免疫反应等。
值得注意的是，CRISPR/Cas技术面世后，得到了极大的关注。鉴于CRISPR/Cas的便利性，有一种主流观点认为，TALENs和ZFNs技术已经过时。但是该观点有待商榷，毕竟，在一些特殊的应用场合或领域，TALENs或ZFNs仍然有着独特的优势，例如前文所述的丝状真菌基因改造领域，就是一个比较典型的例子。因此，这就要求科技工作者具体问题具体分析，辩证地根据事物的客观属性，有针对性地选择合适的方法技术。
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