出芽短梗霉Aureobasidium pullulans是一种具有工业应用价值的真菌，能发酵产生聚苹果酸、葡萄糖酸、普鲁兰多糖、酶制剂等多种代谢产物，其中聚苹果酸是一种新型聚酯型聚合物，具有良好的水溶性、生物安全性和易降解性，可用于新型药物载体、组织工程、食品包装材料等领域。本课题组前期分离得到一株聚苹果酸高产菌株A. pullulansCCTCC M2012223，建立了聚苹果酸酸水解制备苹果酸新工艺技 术^[1]，并对聚苹果酸发酵调控、聚合途径解析等方面开展研究^{[2, 3]}。

出芽短梗霉俗称“类酵母真菌”，由于遗传不稳定性，形成许多变种，其生活史中具有酵母样和真菌菌丝体两种形态，形态形成受到外界培养基、培养条件等各种因素影响，导致其遗传操作困难^[4]。本课题组尝试利用酵母成熟的遗传转化方法如电转化^[5]、PEG介导的LiAc转 化^[6]等，用于出芽短梗霉遗传转化，但未获成功，原因可能在于出芽短梗霉通常分泌多糖到细胞壁外形成粘性保护层^[7]；Cullen等^[8]最早报道了出芽短梗霉原生质体转化方法，但是该方法操作复杂，转化效率不高；本课题组也曾尝试该方法发现对原生质体的质量要求很高，转化操作苛刻，对同源重组的敲除株转化效率低。

根癌农杆菌介导的转化 (Agrobacterium tumefaciens-mediated transforation,ATMT) 作为一种高效的遗传转化方法，在真菌遗传转化中得到广泛应用^[9]，与原生质体转化相比，ATMT更高效、方便、省时。此外，大部分ATMT产生的转化子含有单个T-DNA (Transferred DNA) 拷贝^{[9, 10]}，通过ATMT方法将T-DNA随机插入至真菌基因组，构建突变体库，已成为根据突变体的表型筛选相关功能基因的有效方法^[11]。因此，为了深入探究聚苹果酸生物合成调控基因，本文尝试建立根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法，并利用ATMT构建出芽短梗霉随机T-DNA突变库，结合发酵液pH值与聚苹果酸产量的响应模型，微孔板高效筛选聚苹果酸高产突变株，获得一株T-DNA破坏磷酸甘油酸变位酶基因的突变株，聚苹果酸发酵产量提高了24.5%。

根癌农杆菌A. tumefaciens AGL-1.pk2-hyg包含带潮霉素B磷酸转移酶基因 (Hygromycin B phosphotransferase,hyg) 的双元载体pk2- hyg，根癌农杆菌A. tumefaciens AGL-1.pk2-bar包含的双元载体由编码草胺磷抗性基因草胺磷乙酰转移酶 (Phosphinothricin acetyltranferase,bar) 替换pk2-hyg上的hyg而来，由西南大学生物技术中心张永军研究员馈赠。质粒图谱见图1。出芽短梗霉Aureobasidium pullulans CCTCC M2012223由本实验室筛选保藏。

图1 双元载体 pk2-hyg Fig.1 Plasmid profile of binary vector pk2-hyg.

图选项

潮霉素B (Genview)、乙酰丁香酮 (Aldrich)、卡那霉素 (Japan)、羧苄青霉素 (Germany)、溴酚蓝 (Genview)、溶壁酶 (Sigma)、蛋白酶K (Sigma) 购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；草铵磷(除草剂Basta glufosinate-ammonium，phosphinothricin,ppt) 购自永农生物科学有限公司；头孢他啶 (注射液) 由深圳立键药业生产；DNA Walking SpeedUPTM Premix Kit (Seegene)、DNA聚合酶等分子生物学常规试剂购自TaKaRa。常规理化试剂均为国产分析纯。本研究所用引物见表1，由金斯瑞生物科技有限公司合成。

将根癌农杆菌A. tumefaciens AGL-1接种于YCK琼脂平板 (g/L): 酵母提取物10，蛋白胨5，蔗糖5，MgSO₄·7H₂O 0.5，琼脂20，卡那霉素50 mg/L，羧苄青霉素50 mg/L，28 ℃ 培养48 h，挑取单菌落接种于250 mL摇瓶培养24 h至OD₆₆₀达到0.6−0.8。

将出芽短梗霉A. pullulans CCTCC M2012223接种于PDA琼脂平板中，25 ℃培养48 h挑取单菌落培养种子，出芽短梗霉种子培养基 (g/L)：葡萄糖60，NH₄NO₃ 2，KH₂PO₄ 0.1，MgSO₄·7H₂O 0.1，ZnSO₄ 0.1，KCl 0.5，CaCO₃ 20，种子培养48 h，按10% (V/V) 接种量接种发酵培养基 (g/L)：葡萄糖90，NH₄NO₃ 2，KH₂PO₄ 0.1，MgSO₄·7H₂O 0.1，ZnSO₄ 0.1，KCl 0.5，CaCO₃ 30，摇床220 r/min培养4 d。

取出芽短梗霉培养液100 μL均匀涂布于含有不同浓度草铵磷或潮霉素B的M100琼脂平板上，25 ℃培养7 d,观察并记录生长情况。

将根癌农杆菌AGL-1培养OD₆₆₀至0.7−0.8,4 ℃离心收集菌体,冰上用IM液体培养基 (g/L):葡萄糖1.8,K₂HPO₄ 0.3,NaCl 0.3,MgSO₄·7H₂O 0.3，MES 7.8，200 μmol/L乙酰丁香酮，pH 5.3，清洗并重悬至OD₆₆₀约0.2，培养8 h后待用。收集对数期出芽短梗霉细胞，用无菌水稀释至10⁹−10¹² 个/L后，取100 μL细胞与培养待用的农杆菌AGL-1混匀后，均匀涂布于表面铺有水相微孔滤膜的IM琼脂平板上，22 ℃共培养60 h，将微孔滤膜转移至含有合适筛选压力 (0.5 g/L头孢他啶和30 mL/L草铵磷或100 mg/L潮霉素B) 的M100琼脂平板上^[10]，25 ℃培养3−6 d至出现转化子，将滤膜上的转化子挑至含有双倍筛选压力的M100液体培养基的96孔板中复筛。

以转化子基因组为模板，出芽短梗霉原始菌A. pullulans CCTCC M2012223基因组为对照，pk2-hyg和pk2-bar质粒为阳性对照，Bar.F/Bar.R、Hyg.F/Hyg.R、Gus.F/Gus.R为引物检测转化子基因组中是否存在标记基因序列。PCR条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性 30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min；10 ℃保持。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶上电泳检测。

将T-DNA插入突变株在不含筛选压力的PDA琼脂平板上连续接传5代，再接种于含有相应筛选压力的平板上观察生长情况，考察突变株的遗传稳定性，并接种发酵培养基，以出芽短梗霉A. pullulans CCTCC M2012223为对照菌株，摇瓶验证突变株的产聚苹果酸产量。聚苹果酸产物分析采用高效液相色谱法，取发酵液上清液1 mL，加入1 mL 2 mol/L H₂SO₄，90 ℃酸水解9 h，进行HPLC分析^[1]。

以发酵验证的高产聚苹果酸突变株H27基因组为模板，参考报道的方法扩增T-DNA标记基因侧翼序列^[12]。引物为标记基因启动子PtrpC靶序列特异结合的TSP1、TSP2、TSP3和DNA Walking SpeedUPTM Premix Kit试剂盒中的随机引物DW-ACP，以突变株H27基因组为模板经三轮巢式PCR扩增侧翼序列。PCR产物胶回收后，送华大基因测序，将所测序列与出芽短梗霉A. pullulans CCTCC M2012223基因组进行比对，以确定T-DNA插入位点。

为了筛选出芽短梗霉菌株敏感的选择压力和确定其工作浓度，以真菌培养常用的抑制剂草铵磷和潮霉素B为例，考察了出芽短梗霉菌株在不同抑制剂浓度条件下的生长情况，结果如表2所示，草铵磷浓度为30 mL/L时，在培养4 d内能有效抑制细胞生长，第7天出现极少量微小菌落；潮霉素浓度在100−300 mg/L时，可完全抑制菌株生长。因此确定草铵磷浓度 30 mL/L和潮霉素B浓度100 mg/L为抑制出芽短梗霉生长的最低抑制浓度。

以潮霉素B为筛选压力，进行根癌农杆菌遗传转化。如图2所示，M100琼脂平板中培养约6 d后微孔滤膜上长出可见菌落，随机挑选16株复筛得到的转化子进行菌落PCR验证标记基因是否插入出芽短梗霉基因组，其中14株检出标记基因hyg，占87.5%。对转化子进行菌落计数，结合几次转化效果表明，农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化效率为每10⁷个细胞可获得80−120个转化子。

图2 转化子的抗性筛选及菌落 PCR Fig.2 ATMT results of A. pullulans CCTCC M2012223 and the identification of hyg gene. (A) Screening of transfer membrance based on the the resistance of hygromycin B. (B) Colony PCR of hyg gene identification. M: DNA marker; PC: positive control.

图选项

各选取5株菌落PCR筛选出的抗草铵磷和抗潮霉素的转化子提取基因组，分别对标记基因hyg、bar进行扩增，转化子中均检测出与阳性对照相同的条带 (图3A)，表明标记基因已经整合到基因组中。以筛选出的含有bar标记基因的转化子为出发株，再次转化hyg标记基因，获得了同时整合多个标记基因的转化子 (图3B)，基于此可以实现对宿主的多次遗传改造。

图3 转化子的耐受筛选及标记基因分析 Fig.3 ATMT results of A. pullulans CCTCC M2012223 and the identification of hyg,bar and gus gene. (A) PCR identification of hyg,bar andgus gene. PC: positive control,NC: negative control; M: DNA marker,a: hyg gene identification,b: bar gene identification. (B) The resistance of transformant on the plate containing Hygromycin B and phosphinothricin confirmation results. Control: A. pullulans CCTCC M2012223; pk2-hyg: transformant containing hyg gene; pk2-bar: transformant containing bar gene.

图选项

农杆菌介导的遗传转化可以将T-DNA随机整合到宿主基因组中，从而获得一定数量的突变株，这些突变株在基因组水平上受到外源DNA的插入干扰可能会引起不同的性状改变。突变株在不含有潮霉素和草铵磷的培养基上连续传5代后依然能在含潮霉素和草铵磷的平板上生长，表明插入的T-DNA可以在出芽短梗霉基因组中稳定遗传。出芽短梗霉A. pullulans CCTCC M2012223是本课题组筛选获得的聚苹果酸高产菌株，由于聚苹果酸分子结构中带弱酸基团 (-COOH)，导致发酵液呈酸性变化。通过向微孔板中加入pH指示剂溴甲酚绿培养发现如图4A所示，突变株发酵液颜色由绿色向黄色不同程度变化，表明发酵液中pH值能一定程度上反映菌株产酸能力的强弱。本课题组前期研究发现，出芽短梗霉发酵产生酸性物质主要是聚苹果酸，其次有乳酸、乙酸、琥珀酸等杂酸，且总杂酸含量较低^[13]，因此，可建立发酵液pH值与氢离子浓度的响应模型：

图4 微孔板出芽短梗霉发酵液pH值与聚苹果酸浓度响应变化 Fig.4 Relationship of PMA concentration and pH value in the microwell plate. (A) The color change of fermentation broth in the microwell plate. (B) The response model of PMA concentration with the pH value. (C) pH assay in the microwell plate.

图选项

式中，x为氢离子浓度；y为pH；K₀为聚苹果酸电离常数；C₀为聚苹果酸浓度 (g/L)；K₁=10^-3.86为乳酸电离常数；C₁为乳酸酸浓度(mol/L)；K₂=10^-4.76为乙酸电离常数；C₂为乙酸酸浓度 (mol/L)；K₃=10^-4.21为琥珀酸电离常数；C₃为琥珀酸酸浓度 (mol/L)；K_w=10^-14为水电离常数；K为常数。将聚苹果酸发酵液上清按比例稀释，测定的多组C₀以及对应的y值，代入公式 (1) 和 (2)，通过遗传算法迭代处理，非线性拟和得到发酵液中聚苹果酸浓度与环境pH值的响应模型 (图4B)，表明随着聚苹果酸浓度增加，环境pH值呈下降趋势，因此，基于响应模型，可高效测定微孔板中培养物的pH值，作为聚苹果酸高产突变株的初筛依据 (图4C)。

根据微孔板初筛结果,随机挑选14株含hyg标记基因的转化子进行摇瓶发酵验证，结果如图5所示，与原始菌株相比，大多数T-DNA插入突变株聚苹果酸产量下降，而H27号菌株聚苹果酸发酵产量达到 (29.60±0.88) g/L，比出发菌提高了24.5%。表明采用T-DNA插入方式，导致多数转化子表现为负突变效应。

图5 T-DNA 插入突变对聚苹果酸发酵产量的影响 Fig.5 Effect of T-DNA insertion on the PMA production.

图选项

对T-DNA插入突变株H27进行基因组步移分析，如图6所示，T-DNA侧翼扩增得到 657 bp片段，与本课题组完成的A. pullulans CCTCC M2012223基因组测序数据比对，发现g3187.t1基因 (磷酸甘油酸变位酶,EC 5.4.2.4) 读码框被破坏。

图6 出芽短梗霉插入突变株T-DNA侧翼序列及破坏基因 Fig.6 The flanking sequence of disrupted gene in T-DNA mutant H27. (A) Disrupted gene mapping to KEGG pathway (red). (B) Flanking sequencing of disrupted gene g3187.t1.

图选项

g3187.t1基因编码区全长2 220 bp，编码739个氨基酸，在1 794 bp处插入T-DNA。磷酸甘油酸变位酶在糖酵解反应中，催化1,3-二磷酸甘油酸转变为2,3-二磷酸甘油酸^[14]。已有的研究表明，聚苹果酸主要通过TCA循环来源的苹果酸聚合而成^[15]，突变株H27磷酸甘油酸变位酶基因破坏可能会促进1,3-二磷酸甘油酸向3-磷酸甘油酸转化，导致糖酵解代谢通量增加，促进聚苹果酸合成。

本实验研究表明，通过根癌农杆菌介导能够将外源DNA片段整合到出芽短梗霉基因组中稳定遗传，其转化效率是已报道原生质体转化的50倍以上。Zhang等^[9]报道了农杆菌介导的蜡蚧轮枝菌Lecanicillium lecanii 遗传转化方法，并观察到了T-DNA插入突变株的不同表型变化。Tzima等^[16]利用潮霉素为筛选标记，以荧光蛋白为报告基因建立了农杆菌介导的根串珠霉 Thielaviopsis basicola 遗传转化方法。Lin等^[17]报道了以潮霉素、博来霉素、诺尔丝菌素为筛选标记实现了农杆菌介导的圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides遗传转化，每10⁵个细胞含400个转化子。本实验以潮霉素和草铵磷为筛选压力建立的根癌农杆菌介导的出芽短梗霉遗传转化方法，每10⁷个细胞含80−120个转化子，具有较高的转化效率，可实现对同一宿主的多次遗传改造。

目前从出芽短梗霉基因组水平进行遗传操作研究较少^[18]，主要原因在于出芽短梗霉代谢产物的生物合成网络不清晰，传统原生质体遗传转化效率低下。利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法构建T-DNA插入突变文库，为出芽短梗霉代谢产物的功能基因挖掘提供便利。如李中明等^[11]构建T-DNA插入突变库，快速筛隐球酵母葡萄糖去阻遏基因；罗志兵等^[19]利用环境胁迫来筛选对高温和高渗等逆境胁迫敏感的球孢白僵菌T-DNA随机插入突变体，并克隆相关基因。随着出芽短梗霉菌株的全基因组测序完成^[20]，本研究构建的出芽短梗霉T-DNA突变库及高效筛选方法，将为后续全基因组覆盖的突变株筛选、聚苹果酸合成的功能基因挖掘及调控机制解析提供基础。

致谢：本论文所用实验材料由西南大学生物技术中心张永军研究员馈赠，并参与实验指导和论文修改，在此一并表示感谢！