氨基酸脱氢酶是以氨基酸分子中-CH-NH₂为氢供体，以NAD(P)⁺为受体的一类氧化还原酶，有严格的手性选择性。野生型的氨基酸脱氢酶多为L-选择性^[1]，利用酶催化可逆反应的特点，这类酶被成功用于光学纯L-氨基酸的生物合成；目前已知的D-氨基酸脱氢酶多为膜蛋 白^{[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8]}，仅有内消旋-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶 (meso-2,6-D-diaminopimelate dehydrogenase) (DAPDH) (EC 1.4.1.16) 家族及它们的突变体酶可用来进行D-氨基酸的生物合成^{[9, 10, 11, 12]}。内消 旋-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶 (DAPDH) 存在于赖氨酸合成途径中，是一类NADP⁺-依赖型的氧化还原酶，它催化可逆的内消旋-二氨基庚二酸

(meso-diaminopimelate，meso-DAP) 的D-手性碳上的氨基氧化脱氨，生成L-2-氨基-6-酮基庚二酸，反应方程式如图1所示^[13]。我们从嗜热共生杆菌Symbiobacterium thermophilum中获得一个内消旋-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶 (StDAPDH)^[14],该酶可被直接用来还原氨化合成光学纯D-丙氨酸，我们对其进行改造扩展了底物谱范围^[15]，而且还获得了它的X-射线晶体结构^[16]，为对StDAPDH开展深入研究奠定了基础。

图1 内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶催化的反应[13] Fig.1 Reaction catalysed by meso-diaminopime dehydrogenase[13]

图选项

已报道的DAPDH家族野生型以及突变子酶均偏好于NADP(H)^{[9, 10, 11, 12]}，到目前为止尚无该家族酶辅酶偏好性改造的报道。辅酶NAD(H)和NADP(H) 相比而言，NAD(H) 有稳定性好、价格低廉及更广的辅酶循环再生方法等优 势^[17]，在实际生产应用上，多倾向于使用NAD(H) 依赖型的脱氢酶。对DAPDH进行辅酶专一性改造，可以为DAPDH潜在的工业化应用提供支撑。

辅酶NAD(H) 和NADP(H) 的主要区别在于2′位上的腺嘌呤上，NADP(H) 中该位置比NAD(H) 多连接了一个磷酸基团，而且该位置和辅酶在催化反应中提供质子的C₄的位置较远。在辅酶偏好性改造中，常常可以通过改造和辅酶磷酸基团结合的氨基酸残基如精氨酸 (R) 及赖氨酸 (K) 等来达到目的^{[18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30]} (表1)。

除了和磷酸基团相关的基团外，Crobu等^[31]以及Baroni等^[32]在改造铁氧化还原蛋白NADP⁺ 还原酶时发现，临近辅酶腺嘌呤的氨基酸残基 (H286及Y258) 对辅酶偏好性也有影响，而且他们获得的仅仅Y258位单突变就能使辅酶偏好性完全翻转过来。

通过结构分析比较发现，StDAPDH结构中和辅酶腺嘌呤接近并可能影响辅酶偏好性的氨基酸为Y76，与辅酶NADP⁺上磷酸基团有直接作用的基团为R35和R36。对于StDAPDH中Y76对辅酶偏好性是否有影响进行了突变摸索，此外，还对和与辅酶NADP⁺上磷酸基团有直接作用的R35/R36位也进行了突变尝试，并和Y76的部分突变子进行了组合突变测试。本文报道相关的研究结果。

实验中所用感受态细胞大肠杆菌Esherichia coli Top10以及E. coli BL21 (DE3) 均购自北京全式金生物技术有限公司；突变起始质粒pET_32a-stdapdh为本实验室保存。

实验中所用KOD DNA聚合酶、PCR相关KOD plus缓冲液、MgSO₄、dNTPs购自日本TOYOBO公司；Fast-Digest限制性内切酶购自Fermentas公司；辅酶NADP(H) 以及NAD(H) 均购自Codexis公司；文中所用底物以及其他试剂均购自Alfa Aesar公司。质粒提取试剂盒、核酸回收试剂盒均购自北京全式金生物技术有限公司。实验中所构建质粒均由金唯智生物科技有限公司进行序列测定。

文中所用培养基均为LB培养基，其中固体培养基中含1%琼脂粉。

酶标仪为MD公司Spectramax M2e；蛋白纯化仪为ÄKTA purifier 10；所用层析柱以及填料均购自GE公司；APV2000高压匀浆破碎仪购自APV公司；RC6⁺高速冷冻离心机购自Thermo公司；离心机为Eppendorf公司5430R；MJ Mini PCR仪；核酸、蛋白电泳系统以及Gel Doc^TM XR⁺凝胶成像系统均购自Bio-RAD公司；SS-325高压灭菌锅购自日本Tomy Kogyo公司。

根据Stdapdh^[14]基因序列和拟突变的位点设计相应突变引物 (表2)，所有突变都以含突变前基因的质粒为模板，按照QuickChange^TM试剂盒操作说明进行相应突变。PCR过程：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，68 ℃延伸7 min，其中第二步至第四步循环20次，之后于68 ℃延伸20 min。PCR产物进行电泳确证。对扩增出来的目的片段进行切胶回收后，使用DpnⅠ于30 ℃消化2 h，将消化产物转化至大肠杆菌Top10感受态细胞中，涂布至含氨苄青霉素的LB固体培养基上进行过夜培养，挑取单菌落接种至3 mL液体LB培养基中，菌体长出后离心取菌体提取质粒，并将质粒测序验证，将序列正确的质粒转化至大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态中，进行后续表达纯化工作。

突变酶的表达、纯化方法和野生型酶类 似^[14]，首先将含过夜培养的种子液以1%的比例接种至2 000 mL含100 μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，于37 ℃、200 r/min培养至OD₆₀₀约1.0后，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) 至终浓度为0.5 mmol/L，25 ℃、200 r/min继续诱导12 h，4 ℃、5 000 r/min离心30 min收集菌体，菌体用缓冲液A (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，5%甘油) 重悬，高压匀浆破碎，破碎液于4 ℃、14 000 r/min离心30 min，收集上清液作为粗酶液，经过 0.22 μm滤膜过滤后进行镍柱亲和层析。镍柱按照说明书进行再生处理并用缓冲液A进行平衡，上样后先用缓冲液A将A₂₈₀紫外吸收洗至基线，再用15%比例的缓冲液B (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，500 mmol/L NaCl，5%甘油，500 mmol/L咪唑) 洗脱杂蛋白，接着使用50%比例的缓冲液B洗脱目的蛋白,收集合并洗脱峰，使用Amicon Ultra-15 超滤管 (截留分子量：10 kDa) 进行超滤浓缩，置换缓冲液至缓冲液C (20 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol/L NaCl) 并进一步浓缩，浓缩后的酶用于SDS-PAGE以及酶学性质检测。蛋白质浓度使用BCA试剂盒检测，使用牛血清白蛋白BSA作为标准蛋白。

酶活测定方法参见文献^[14]，以StDAPDH的天然底物内消旋-二氨基庚二酸 (meso-DAP) 为底物，以NAD(P)⁺为辅酶，通过检测A₃₄₀下辅酶NAD(P)H生成时吸光值的变化来表征突变体的活性，辅酶的摩尔吸光系数为 6.22 mmol/(L·cm)。酶活测定体系为:10 mmol/L meso-DAP，0.5 mmol/L NAD(P)⁺，200 mmol/L Na₂CO₃/NaHCO₃，pH 10.0，总体积为200 μL。酶活单位 (U) 定义为30 ℃下每分钟生成 1 μmol NAD(P)H所需要的酶量。

对辅酶动力学参数的测定，具体条件如下：100 mmol/L Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液 (pH 10)，10 mmol/L meso-DAP，NADP⁺终浓度在 0.031−16 mmol/L 之间变动，NAD⁺终浓度在0.031−32 mmol/L之间变动。每个NADP⁺浓度做3−4次平行反应取平均值，利用GraphPad Prism软件，根据Michaelis-Menten方程式计算野生型酶和各突变体酶对NADP⁺以及NAD⁺的表观K_m和V_max值。

从StDAPDH结合辅酶的结构^[16]可知，和磷酸基团有直接作用的残基为R35和R36，Y76的位置类似于铁氧化还原蛋白NADP⁺还原酶中靠近Y258的位置^{[31, 32]}，StDAPDH结构中这3个位置的氨基酸残基和辅酶的位置关系见图2。与NADP⁺的腺嘌呤环相临近的76位酪氨酸，其空间位阻较大，且有极性的羟基；为了探索其对辅酶专一性是否有影响，以及是空间位阻还是极性对辅酶专一性产生影响，进行了突变改造，将其突变为和其有类似大位阻的色氨酸 (W)、苯丙氨酸 (F) 和略小位阻的疏水性氨基酸缬氨酸 (V)、甲硫氨酸 (M) 以及异亮氨酸 (I) 以探索空间位阻的影响，突变为亲水氨基酸如碱性的精氨酸 (R)、酸性的谷氨酸 (E) 及组氨酸 (H) 以探索极性的影响。Lerchner等改造醇脱氢酶RasADH的辅酶偏好性从NADP⁺至NAD⁺的工作中^[25]，起始酶与辅酶NADP⁺上磷酸基团相互作用的氨基酸残基也是两个精氨酸 (R38及R39)，通过将它们突变为R38V/R39S后成功将辅酶偏好性改为NAD⁺依赖型。通过结构比较可以发现，StDAPDH中的R35及R36分别对应RasADH中的R39和R38。对StDAPDH设计了R35S/R36V双突变，探索该双突变是否和RasADH中一样能使辅酶偏好性发生翻转。突变引物序列见表2。

图2 StDAPDH中和辅酶偏好性可能相关的位点 Fig.2 The residues that might affect the co-enzyme specificity of StDAPDH

图选项

我们首先对构建的Y76单突变进行了表达纯化，利用纯酶对两种辅酶的活力进行了测定及比较，单突变的纯酶结果见图3，其与野生型对两种辅酶的比活力比较见图4。

图3 StDAPDH Y76单突变纯酶的SDS-PAGE结果 Fig.3 SDS-PAGE of purified Y76 single mutants. M: protein molecular weight marker; 1: wild-type StDAPDH; 2: Y76W; 3: Y76F; 4: Y76E; 5: Y76H; 6: Y76R; 7: Y76M; 8: Y76V; 9: Y76I

图选项

图4 野生型和Y76单突变酶的比活力 Fig.4 Specific activity of wild-type and Y76 single mutants. The specific activity for NAD+ are in light gray,the specific activity for NADP+ are in dark gray. The value above bar diagram represents the ratio of NAD+ to NADP+

图选项

通过对Y76位的不同单突变对两种辅酶比活力的比较 (图4)，我们可以看出，除Y76W外的所有突变子对NAD⁺的比活力均有所提高，而且所有Y76位突变子对NADP⁺的比活力均有所下降。在这些突变子中，位阻最大的Y76W对两种辅酶的比活力为Y76位单突变中最低的，可能是因为其较大的位阻影响了NAD(P)⁺上腺嘌呤的结合，因而影响它们的活力。突变后位阻比酪氨酸略小的疏水氨基酸Y76F对辅酶活力变化趋势和野生型酶影响趋势最为接近，其对NAD⁺的比活力相比较野生型酶有所提高，其对NADP⁺的比活力是所有突变子中最高的；酸性氨基酸Y76E对NAD⁺的活力比Y76F有进一步提高，碱性氨基酸Y76H比Y76E对NAD⁺的活力更高，但对NADP⁺的活力略低；同为碱性的氨基酸Y76R比Y76H对NAD⁺的活力则更高一些，对NADP⁺的活力也相对更高；位阻更小的疏水性的Y76M、Y76V以及Y76I对NAD⁺的活力逐步增高，对NADP⁺的活力也相应逐步降低，表明它们的辅酶偏好性偏转能力也逐步提高；在我们测试的这些Y76突变子中，Y76V及Y76I对NAD⁺的比活力最高。在所有Y76的突变子中，虽然Y76E有最高的NAD⁺/NADP⁺比值 (0.73)，但其对NAD⁺的活力并不是最高；而Y76I突变子，虽然NAD⁺/NADP⁺比值为0.69，但其对NAD⁺活力是Y76突变子中最高的。

为考察R35/R36为对辅酶偏好性的影响，我们借鉴别人的结果，进行了R35S/R36V双突变；为考察Y76位的突变和R35、R36位突变是否有相互作用，我们选取了Y76单突变中对NADP⁺活力最高的Y76F，对NAD⁺活力最高的Y76V和Y76I，分别与R35S/R36V进行了组合突变，并进行了表达、纯化及活力测定。纯化结果见图5。

图5 R35S/R36V以及三突变纯酶的SDS-PAGE 结果 Fig.5 SDS-PAGE of purified R35S/R36V and triple mutants. M: protein molecular weight marker; 1: wild-type StDAPDH; 2: R35S/R36V,3: R35S/R36V/ Y76F,4: R35S/R36V/Y76I,5: R35S/R36V/Y76V

图选项

R35S/R36V双突变对StDAPDH辅酶偏好性影响和Y76W单突变类似，对两个辅酶的活力都有明显降低，而且对NAD⁺的比活力仍然低于对NADP⁺的比活力 (图6)。对R35、R36两个位点的突变结果表明，尝试改造的R35S/R36V虽然确实对酶的偏好性有影响，其NAD⁺/NADP⁺比值 (1.25) 比所有Y76单突变 (最高值为0.73) 都高，但是对NAD⁺活力提高不明显。R35S/R36V双突变和Y76F组合后的R35S/R36V/Y76F对辅酶NAD⁺的比活力相比 Y76F单突变没有明显变化，但NAD⁺/NADP⁺比值却从0.39提高到1.25，而且该突变对NAD⁺的比活力高于对NADP⁺的比活力；R35S/R36V和Y76I及Y76V组合后的突变子对NAD⁺的比活力也均高于它们对NADP⁺的比活力，而且它们的NAD⁺/NADP⁺比值也均有明显提高，分别从0.69到1.39，以及0.53到1.36；在单突变中Y76I比Y76V对NAD⁺的比活力稍高，但在组合的三突变中，R35S/R36V/Y76V却比R35S/R36V/Y76I对NAD⁺的比活力更高。这些结果表明，R35/R36位和Y76位组合后，可以获得比单独进行单突变或双突变更好的结果，但其所起的作用并不是简单的叠加。后续若想获得更好结果，可能需要先筛选出R35/R36位较好的结果，并将较好的双突变结果和76位进行进一步组合突变并进行筛选。

图6 野生型和突变体酶的比活力 Fig.6 Specific activity of wild-type and mutants. The specific activity for NAD+ of mutants is in light gray,the specific activity for NADP+ of mutants are in black. The values above bar diagram represent the ratio of NAD+ to NADP+

图选项

本研究中涉及的突变子动力学参数测定结果见表3。从表中可以看出，所有Y76突变对NAD⁺的K_m都降低了，而且除了Y76E外所有突变对NADP⁺的K_m也降低了，其中对NADP⁺的 K_m值最小的是Y76F，这说明Y76F对NADP⁺ 的亲和力最好；Y76E对NADP⁺的k_cat最高，但同时其K_m也最高，这说明Y76E在提高了其催化效率的同时也降低了对NADP⁺的亲和力；对NAD⁺的K_m值最小的是空间位阻较小的Y76M、Y76I和Y76V，Y76V对NAD⁺的k_cat和k_cat/K_m是所有突变中最大的，这说明在对NAD⁺的亲和力和催化效率中，空间位阻起到了重要的作用。

从表3中还可以看出，R35S/R36V对NADP⁺和NAD⁺的K_m、k_cat以及k_cat/K_m都降低了，这说明与磷酸基团有相互作用的R35、R36对辅酶亲和力和催化效率有非常重要的作用。同时，还可以看出Y76对R35S/R36V的作用与Y76的单突变的效果一致，当Y76的空间位阻依次变小 (F、I、V) 时，其对NAD⁺的K_m也变小；通过比较单突变Y76V，Y76I和三突变R35S/R36V/Y76V和R35S/R36V/Y76I对NAD⁺的k_cat/K_m时可以发现，它们之间存在协同作用：Y76V的k_cat/K_m比Y76I大，但R35S/R36V/Y76V的k_cat/K_m却比R35S/R36V/Y76I的数值小，这可能是因为Y76V和R35S/R36V都突变为位阻较小的氨基酸残基，表3中K_m (NAD⁺)/K_m (NADP⁺) 值显示，Y76突变对NAD⁺和NADP⁺亲和力差异的贡献各不相同，与野生型相比，空间位阻相对较小的M、V和I对辅酶的亲和力更偏好于NAD⁺，其中Y76I的K_m (NAD⁺)/K_m (NADP⁺) 值比野生型的低了6倍多，显示其对NAD⁺的亲和力有明显的提高。双突变R35S/R36V与野生酶相比，K_m (NAD⁺)/K_m (NADP⁺) 值相差23倍，在此基础上，增加额外的一个突变 (无论是Y76I，F或者V) 都导致此效果的进一步提升。表3中k_cat (NAD⁺)/k_cat (NADP⁺) 的结果显示，与野生酶相比，大部分突变都导致了酶对NAD+和NADP⁺的k_cat差异的变化，其中以Y76R和Y76V导致酶选择NAD⁺作为辅因子最有效，3个突变中，R35S/R36V/Y76I最高。

以上结果分析可知，R35、R36对NAD⁺和NADP⁺偏好性的选择具有关键的作用，这可能是其直接与磷酸基团相互作用的结果。不仅如此，Y76对NAD⁺和NADP⁺的偏好性选择也有重要的作用，可能通过对嘌呤环的作用，改变了NAD⁺在酶结构中的构象，使NAD⁺更好地与酶结合，导致催化效率的提高。

从上述结果中可以发现，虽然Y76单突变对NAD⁺的比活仍低于对NADP⁺的比活，但该位点的突变对辅酶偏好性确有影响，动力学数据结果表明，Y76位的突变是通过改变酶和辅酶NADP⁺和NAD⁺的亲和力来影响其辅酶专一性的。对与NADP⁺磷酸基团有直接作用的R35/R36设计的R35S/R36V突变，虽然改变了辅酶偏好性，但对NAD⁺的比活力没有明显提升；而测试的Y76突变和R35S/R36V突变组合，对辅酶偏好性有影响的同时，对NAD⁺的比活力均已大于对NADP⁺的比活力。这些结果表明，距离腺嘌呤较近的Y76对StDAPDH的辅酶偏好性确有影响，而且该位置和与NADP⁺上磷酸有直接作用的R35及R36对辅酶偏好性有协同作用。

在本文进行的改造尝试基础上，对StDAPDH的R35、R36及Y76进行组合饱和突变，也许能获得对NAD⁺活力更高的突变酶，相关研究工作正在进行中。