2017, Vol. 33中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 李红, 谢卡斌
- Li Hong, Xie Kabin
- 植物CRISPR基因组编辑技术的新进展
- Recent progresses in CRISPR genome editing in plants
- 生物工程学报, 2017, 33(10): 1700-1711
- Chinese Journal of Biotechnology, 2017, 33(10): 1700-1711
- 10.13345/j.cjb.170171
-
文章历史
- Received: April 24, 2017
- Accepted: June 12, 2017
引用本文
|
基因组包含了生物生长发育和生理功能的全部遗传信息，是开展生物学研究的出发点。近10年来，随着新一代DNA测序技术的发展，基因组测序的成本下降了近万倍(https://www.genome.gov/sequencingcostsdata)，越来越多的农作物完成了高质量的参考基因组的绘制。因此，“读懂”基因组序列的“含义”并将之用于农作物改良成为“后功能基因组学”时代植物学研究的主要任务。植物基因功能的解析和农作物的遗传改造需要进行各种遗传操作(Genetic modification)。在过去的20年中，物理化学诱变、T-DNA插入突变和基于RNAi、artificial microRNA的靶向基因抑制技术被广泛地用于拟南芥、水稻等模式生物的基因功能解析[1-2]。自2010年TALEN (Transcription activator like effector nuclease)技术和2013年CRISPR/Cas9 (Clustered, regularly interspaced, short palindromic repeat/CRISPR associated protein 9 system)技术用于基因组编辑以来，对不同农作物进行遗传操作的能力有了前所未有的提高。这些技术不仅推动了生物学基础研究的发展，而且在疾病治疗、农作物育种、生物能源等方面都展现出巨大的潜力和产业化价值[3]。
基因组编辑技术就是利用人工设计和改造的核酸酶对基因组进行精确的定点修饰，包括对基因组进行靶向基因敲入(Knock-in)、基因功能敲除(Knock-out)以及有目的的片段替换[4]。CRISPR/Cas9的发现为生物学的基础理论研究和转化应用提供了简单、强大的基因组编辑平台，因此迅速成为遗传操作的主流工具。同时，CRISPR/Cas9也一直以前所未有的速度发展和更新。本文旨在简要介绍CRISPR/Cas9相关技术的原理，重点介绍近两年出现的与植物相关的新技术，以及CRISPR/Cas9用于农作作物遗传改良的潜力及其面临的挑战，为CRISPR/Cas9在农作物中的应用提供有益的参考。
1 CRISPR/Cas9靶向基因编辑的原理 1.1 CRISPR/Cas9的工作原理CRISPR/Cas是细菌和古细菌中的一种适应性免疫系统，能特异地降解入侵噬菌体或外源质粒的DNA，其中CRISPR是“成簇和规律间隔的短回文序列”的简称，而Cas是指与CRISPR RNA结合的蛋白。在2012年，Jinek等解开了化脓链球菌Streptococcus pyogenes的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统作用机制，并证明Cas9核酸酶(本文专指Strepcococcus pyogenes的Cas9) 可以在一个人造的小RNA分子(称为gRNA，即Guide RNA)的引导下去靶向切割DNA双链[5]。利用Cas9/gRNA标靶特定的DNA位点只需满足2个条件(图 1A)：1) gRNA的5′端20 nt (Nucleotides)的引导序列(称为Spacer或Guide sequence)与靶DNA位点的序列(称为Protospacer)互补匹配；2) 靶位点必须存在PAM (Protospacer-adjacent motif)，其中使用最广的化脓链球菌Cas9的PAM序列为5′-NGG-3′。在使用CRISPR/Cas9进行基因组编辑时，一般用Pol Ⅱ (RNA polymeraseⅡ，Ⅱ型RNA聚合酶)启动子表达含核定位信号的Cas9，用Pol Ⅲ (RNA polymerase Ⅲ)启动子表达gRNA，Cas9/gRNA复合体识别靶DNA后在PAM前面的第3个和第4个脱氧核酸之间切割DNA双链，形成DSB (Double stranded DNA break，双链DNA断裂)。与早期的TALEN和锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease)两种靶向DNA技术相比[6]，Cas9/gRNA更容易操作和实现，成本也更低，因此迅速成为主流的基因组编辑工具。
|
| 图 1 CRISPR/Cas9系统在植物中的主要应用 Figure 1 The applications of CRISPR/Cas9 in plant. |
| |
CRISPR/Cas9靶向编辑基因组序列的原理是利用Cas9和靶位点特异的gRNA切割基因组，在设计的靶位点处形成DSB (Double strand break)，然后利用生物体内的DSB修复过程来对DNA序列进行修改(图 1A)。
1) 靶向基因敲除(Knock-out)。如图 1A所示，Cas9和gRNA在切割靶位点后，形成的DSB主要以NHEJ (Non-homologous end joining)的方式进行修复，而NHEJ是一种易出错的修复方式，会在DSB的位置引入小的核酸插入或缺失(Insertion and deletion，indel)。Indel的引入造成靶基因蛋白翻译产生移码，从而破坏基因功能。基于CRISPR/Cas9的靶向基因敲除技术最早在拟南芥、水稻、烟草、小麦、大麦、玉米、大豆、马铃薯、番茄等模式植物和重要农作物中建立[7-12]，随后在各种不同的植物中都得到了验证[13]。通过对CRISPR/Cas9编辑过的水稻和拟南芥材料进行多代观察和基因型检测，结果表明CRISPR/Cas9产生的突变可以稳定遗传到后代植株[14-16]。除了通过引入indel外来敲除基因功能外，CRISPR/Cas9还可以用来对染色体进行其他的遗传操作。比如，用Cas9和一对gRNA来精确地删除一段染色体DNA (图 1B)。在染色体上靶向切除特定片段对非编码RNA或启动子区(如microRNA或cis-element)的研究具有重要价值，因为这些区域很难通过小的indel来破坏其功能。此外，CRISPR/Cas9甚至能用来创建染色体异常(如大片段缺失、易位、倒位)的突变体。比如，Zhou等利用CRISPR/Cas9和一对gRNA从水稻染色体上删除了1个115–245 kb (Kilo base pairs)大片段，其中包含了2–3个不同的基因簇[17]。在过去的4年中，CRISPR/Cas9靶向基因敲除已迅速成为植物研究中最流行的反向遗传学研究工具。
2) 靶向基因敲入/替换(Knock-in)。在植物的染色体上定点插入或替换(Knock-in)一段序列一直是一个难以攻克的技术难题，而TALEN和CRISPR/Cas9技术极大地降低了这一技术的难度。Knock-in依赖的是DSB的同源重组修复(Homology-directed repair，HDR)修复途径(图 1A)：当Cas9/gRNA切割靶位点后，如果细胞中有与靶位点序列同源的DNA供体(DNA donor)片段时，位于供体DNA上的基因片段会通过HDR重组整合到DSB的位置[11, 18-21]。虽然植物原生质体中可以利用CRISPR/Cas9技术来实现Knock-in或靶向基因替换，但很难在稳定的植株获得成功。
目前，有两种比较通用的策略可用于提高植物knock-in的效率。一是利用小麦矮缩病毒WDV (Wheat dwarf virus)为DNA donor的载体，通过提高donor DNA的拷贝数，从而大幅度地提升Knock-in的效率[21]。这一策略在两种主要农作物水稻[22]和小麦[23]中得到了验证，特别是在水稻中Knock-in的效率最高可达19.4%。二是利用Cas9和一对gRNA从DNA donor上“剪切”一段序列后，再“粘贴”到植物基因组的靶位点上。这一策略利用的是主导DSB修复的NHEJ通路。在2016年，中国科学院遗传与发育生物学研究所的高彩霞和李家洋实验室合作，通过巧妙的靶位点设计，在水稻中利用CRISPR/Cas9实现了这一“剪切/粘贴”式的靶向基因敲入和替换[24]。在CRISPR/Cas9的基础上，这些新的策略为knock-in高效率地用于植物遗传改造提供了可能。
1.2.2 靶向基因转录调控除基因组编辑功能以外，CRISPR技术的高扩展性保证了这一技术可以与多种功能蛋白融合而行使其他遗传操作。这一技术的核心是借助gRNA靶向基因组上特定位点的能力，利用dCas9 (Dead Cas9，无DNA切割活性的Cas9) 和gRNA将不同功能的效应蛋白运输到染色体上的特定位置发挥功能(图 1C)。比如，将dCas9与转录激活结构域(Activation domain, AD)融合，利用gRNA将dCas9-AD引导到启动子区域后就可以实现靶基因的转录激活。在这一技术中，往往需要多个gRNA同时靶向目的基因的启动子才能有效提高靶基因的表达[25-28]。而另一个精妙设计的策略解决了这个问题：将gRNA scaffold作为招募转录调控组件的平台来调控靶基因的表达。例如，将MS2 (RNA配体)融合gRNA，而MS2的特异结合蛋白MCP融合AD片段，这样dCas9/gRNA-MS2/MCP-AD的复合体靶定在目的基因启动子上激活转录。这一技术的巧妙之处在于可以将多个MS2整合在gRNA scaffold序列中，从而使用单个gRNA就能招募多个MCP-AD来有效地激活靶基因表达[29-30]。与基于CRISPR/Cas9靶向基因转录激活类似，将不同的功能蛋白(转录抑制、表观遗传修饰的蛋白元件)用于dCas9/gRNA这一平台，就可以实现转录抑制或表观调控等不同的遗传操作[26, 30]。这些基因组编辑相关的衍生技术为生物学研究提供了更丰富、更便利的遗传学工具。
2 CRISPR/Cas9技术的优化 2.1 降低CRISPR/Cas9的脱靶脱靶一直是CRISPR/Cas9技术的主要困扰。CRISPR/Cas9基因组编辑技术诞生之际，即有报道Cas9/gRNA在动物细胞系中存在脱靶效应：一些与gRNA引导序列不完全匹配的DNA位点(脱靶位点)也会被Cas9脱靶编辑[31-32]，引入非预期的基因突变(Off-target effects)[33-35]。脱靶效应的存在便成为了CRISPR/Cas9最大的不足。为了解决这个问题，科学家们作出了很多积极的尝试。在早期的研究中，将Cas9点突变(D10A或者H804A)后修饰为切口酶(Cas9 nickase，Cas9n)或者将dCas9与FokⅠ融合为1个切口酶，这样需要设计1对gRNA靶定1个位点才能形成DSB，将脱靶的概率降低了几个数量级[36-38]。也有研究表明缩短gRNA的引导序列至17–18 nt可以降低脱靶风险[39]；或者将Cas9蛋白与其他DNA-binding结构域融合也可以有效地降低脱靶率[40]。这些策略虽然大大降低了脱靶效应，但是也将这项技术复杂化，而且并没有从本质上改进Cas9的特异性。随着Cas9/gRNA复合体的结构被解析，研究者们设计出具有高切割活性和高特异性的Cas9变异体，这些“高保真”版本的Cas9对DNA与gRNA间碱基错配是零容忍的，可用来实现精准的遗传操作[41-45]，基本上解决了对CRISPR/Cas9脱靶问题的困扰。
在植物CRISPR/Cas9基因编辑试验中，脱靶现象并没有动物中的严重，但也发现了个别脱靶编辑的现象，这可能是由于靶位点设计时未使用高特异性的gRNA引起的[46]。全基因组序列分析的结果表明，拟南芥、水稻等基因组小、序列重复性不高的物种中，完全可以设计出足够的高特异性gRNA来编辑90%的基因[47]。目前已有许多生物信息学工具可以用于脱靶分析、设计低脱靶概率的gRNA，如CRISPR-PLANT[47]、E-CRISP[48]、CRISPR-P[49]等。通过设计高特异性的gRNA或使用新型“高保真”版本的Cas9，可望有效地消除CRISPR/Cas9脱靶现象对植物基因组编辑的影响。
2.2 优化gRNA的表达CRISPR/Cas9简单、强大的多位点编辑能力是其显著优点之一。实现多位点编辑需要同时表达多个gRNA分子，目前主要有3种策略来利用1个载体同时表达多个gRNA。一是在质粒载体中克隆多个表达单元，每个单元含1个Pol Ⅲ启动子和gRNA[50-51]。第二种是利用Csy4核酸酶将含多个gRNA的转录本切割成单个的gRNA，其中gRNA之间用Csy4的RNA底物连接起来[52]。三是将生物体的内源转运RNA (Transfer RNA，tRNA)与gRNA融合，将多个tRNA-gRNA结构串联排列为1个多顺反子，利用生物体内的tRNA加工酶来将此多顺反子切割成成熟的gRNA，实现多位点编辑[53]。除此之外，具有自我切割功能的核酶(Self-cleavage ribozyme)也可以用于多个gRNA的表达[54-55]。这些不同方法为植物遗传操作提供了成熟的多位点CRISPR/Cas9基因组编辑技术。
2.3 降低PAM的限制DNA靶位点必须存在PAM是限制CRISPR/Cas9用于基因组编辑的主要因素。根据几种模式植物的参考基因组的序列分析，一般基因组上平均每100 bp有6−11个PAM (5′-NGG-3′)。这一出现频率虽然已基本能够满足常规基因功能研究的需要，但是极大地限制了CRISPR/Cas9的应用范围。
为了消除或减弱PAM依赖性对CRISPR/Cas9的限制，需要寻找或创建识别不同PAM序列的CRISPR/Cas9用于基因组编辑。在过去的3年，已有多个CRISPR/Cas9系统被发掘出来[56-57]，极大地扩展了CRISPR/Cas靶向基因编辑的空间。此外，研究人员通过对最常用的化脓链球菌的Cas9进行工程改造，修改Cas9蛋白中与PAM识别相关的氨基酸位点，得到了识别5′-NGAN-3′和5′-NGNG-3′等不同PAM序列的Cas9突变体[58]，并已经用于植物基因组编辑[59]。综合这些新进展，已有的CRISPR/Cas9工具基本具备了靶向全基因组的能力。
3 超越CRISPR/Cas9 3.1 靶向单碱基编辑在基因组编辑技术中，最常见的应用是通过CRISPR/Cas9在靶位点引入indel，从而破坏靶基因的功能。但在农作物遗传改良的实践中，很难通过完全破坏基因功能来获得有育种或应用价值的材料，更多的是需要定向修改单个或几个碱基来改变基因的功能，从而定向改良作物的农艺性状。因此，高效率定向转换基因组的序列是CRISPR/Cas9技术用于遗传改良实践的关键，而单碱基编辑技术正满足了这一需求。
基于CRISPR/Cas9靶向编辑单个碱基的原理如图 1D所示，将Cas9n (或dCas9) 与胞嘧啶脱氨酶(Cytidine deaminase)融合，当gRNA引导融合蛋白到靶位点时，靶位点附近的胞嘧啶C被脱氨酶转换为尿嘧啶U，而U与胸腺嘧啶T的具有相同的碱基配对规则，在DNA复制或修复时U会转换为T，从而完成C→T的碱基转换[60-63]。为了提高C→U→T的效率，在编辑工具中会加入相关元件来抑制U→C的回复修复。目前已有2个构建成功的单碱基编辑工具：一是美国麻省理工大学的David Liu实验室构建的BE (Base editor)系统——由dCas9或Cas9n与哺乳动物的脱氨酶APOBEC1融合而得到[60]；二是dCas9或Cas9n与AID (Activation-induced deaminase)融合得到的Target-AID[61]、CRISPR-X[62]和TAM[63]系统。这些不同的单碱基编辑工具在具体的设计上略有差别，能够编辑的靶碱基的窗口也稍有不同，但在动物细胞中都能实现高效率的C→T单碱基替换。
虽然利用Cas9介导的knock-in也可以实现单碱基的替换，但HDR的效率和实现的难易程度与BE、Target-AID/TAM/CRISPR-X等单碱基编辑工具无法比拟。在哺乳动物细胞系中同时编辑APOE4和p53两个基因上的单个碱基时，Cas9介导的HDR的碱基转换效率最高不超过0.3%，而BE3系统的效率达到了惊人的58%−75% (APOE4)和3%−8% (p53)[60]。最新的结果也表明，利用CRISPR/Cas9改造的单碱基编辑工具特异性非常高，没有检测到脱靶编辑[64]。这些CRISPR单碱基编辑工具，将基因编辑技术推向了一个新的高度，为CRISPR/Cas9技术用于临床治疗、基础研究及作物遗传改良奠定了重要基础。
由于单碱基编辑在作物遗传育种中有巨大的应用潜力，因此这些编辑技术被迅速地应用到农作物中[65-68]。比如将BE (Cas9n-APOBEC1) 用于水稻、小麦和玉米，可以在protospacer的3−9 bp的编辑窗口中实现C→T的精确替换，效率最高可达到43.48%[66]。而把Target-AID用在水稻中，通过对ALS (Acetolactate Synthase)基因进行单碱基替换，获得了耐除草剂的水稻材料[65]。这些成功的示例初步展示了CRISPR/Cas9单碱基编辑的巨大潜力。
3.2 基于CRISPR/Cpf1系统的基因组编辑技术来自化脓链球菌的CRISPR/Cas9用于基因组编辑的巨大成功促使研究人员寻找和改造其他的CRISPR/Cas9系统来扩充基因编辑工具箱，目前最具潜力的是CRISPR/Cpf1系统，被认为是新一代基因组编辑工具中的佼佼者。2015年美国麻省理工大学的Zhang Feng实验室首先发现了Ⅱ类CRISPR系统第5亚家族的成员Cpf1核酸内切酶，并证实了来自氨基酸球菌属Acidaminococcus、毛螺科菌属Lachnospiraceae和弗朗西斯氏菌属Franisella novicida的AsCpf1、LbCpf1和FnCpf1三个高度同源蛋白都具有RNA引导的DNA内切酶的活性，而且AsCpf1和LbCpf1用于动物的基因组编辑效率接近原来的CRISPR/Cas9系统[44]。
与Cas9比较，Cpf1在基因组编辑中具有以下几个优势：1) Cpf1的引导RNA更短，但引导序列(即DNA靶位点)更长(~24 nt)；2) Cpf1的特异性优于Cas9，在脱靶分析实验中没有检测到Cpf1的脱靶现象[69]；3) Cpf1可以将CRISPR RNA array切割成多个引导RNA，更容易实现多位点编辑[70-71]；4) Cpf1识别的PAM为5′-TTTN-3′ (AsCpf1和LbCpf1) 和5′-TTN-3′ (FnCpf1)，极大地扩充了基因组编辑的范围；5) Cpf1在远离PAM的protospacer区形成5个碱基突出(Overhang)的切口，形成的突变类型与Cas9不同，更易于引入indel，从而提高knock-out的效率。
Cpf1的这些特点使其在基因组编辑中更具优势。因此基于CRISPR/Cpf1的基因编辑系统迅速被用于水稻和拟南芥等模式生物的基因组编辑和靶向基因转录调控[72-78]。水稻中利用CRISPR/Cpf1系统靶向基因敲除的效率与原有CRISPR/Cas9技术没有显著差别。CRISPR/Cpf1系统简单易行的多基因编辑能力也在水稻中得到了验证[79]。此外，CRISPR/Cpf1也可以改造为靶向基因调控的工具，在拟南芥中实现了靶向基因表达抑制[73]。总的来说，CRISPR/Cpf1将是媲美甚至超越CRISPR/Cas9的植物基因组编辑平台。
4 基因组编辑用于农作物遗传改良虽然CRISPR/Cas9基因组编辑技术成为植物遗传操作首选工具的时间很短，但在农作物的遗传改良中已展现了巨大的应用价值[80]。比如在小麦中，利用基因组编辑技术精确地靶向突变MLO基因的3个拷贝，直接获得了对白粉病具有广谱抗性的小麦材料[81]；在水稻中，利用CRISPR/Cas9系统在温敏核雄性不育基因TMS5中引入了特异性突变，并开发了新的不育系材料[82]，有望加速温敏核雄性不育系在水稻杂交育种中的应用。CRISPR/Cas9也被植物学家们改造为抵抗病毒的新工具，在拟南芥、烟草中利用Cas9和靶向双生病毒的gRNA，实现了植物对靶病毒的免疫[83-85]。随着CRISPR/Cas9技术的快速扩张，越来越多基因编辑的农作物将进入实际应用阶段。
DNA-free基因组编辑技术的建立和成熟，将进一步推动CRISPR/Cas9技术用于农作物遗传改良的步伐。DNA-free基因组编辑是指将预先体外表达的Cas9蛋白(或Cpf1) 和合成的gRNA直接转入植物细胞完成对靶基因的编辑，然后将编辑的细胞再生出完整的植株。由于整个过程不涉及任何外源DNA，因此除了编辑的靶位点外，不会产生额外的遗传修饰。此技术最早在拟南芥、烟草、莴苣和水稻4种植物体原生质体中得到了验证[86]。随后，在玉米、小麦等关键粮食作物中建立了DNA-free的CRISPR/Cas9基因编辑技术[87-90]。DNA-free技术将有可能进一步消除公众对基因组编辑农作物的担忧，有望加速CRISPR/Cas9技术在作物遗传改良中的应用。
基因组编辑作物的出现也促使监管部门重新审视CRISPR/Cas9和TALEN等技术所改良的农作物品种，特别是它们与传统转基因作物间的不同。美国农业部明确表示基因组编辑改良的蘑菇和土豆品种，由于最后产品中无外源DNA，因此可等同于传统育种得到的农作物品种[80, 91]。在CRISPR/Cas9技术快速发展并被广泛用于不同作物的今天，如何管理基因组编辑技术改良的农作物新品种，将是一个重要的议题。
5 展望CRISPR/Cas9技术的出现提供了一个简单、廉价、精准的遗传操作平台，不仅能为基础研究提供强大支持，也将加速功能基因组学研究成果向产品的转化，为农作物遗传改良注入新的动力。
| [1] | McCourt P, Benning C. Arabidopsis: a rich harvest 10 years after completion of the genome sequence. Plant J, 2010, 61(6): 905–908. DOI: 10.1111/tpj.2010.61.issue-6 |
| [2] | Zhang QF, Li JY, Xue YB, et al. Rice 2020: a call for an international coordinated effort in rice functional genomics. Mol Plant, 2008, 1(5): 715–719. DOI: 10.1093/mp/ssn043 |
| [3] | Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell, 2014, 157(6): 1262–1278. DOI: 10.1016/j.cell.2014.05.010 |
| [4] | Voytas DF. Plant genome engineering with sequence-specific nucleases. Annu Rev Plant Biol, 2013, 64: 327–350. DOI: 10.1146/annurev-arplant-042811-105552 |
| [5] | Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 2012, 337(6096): 816–821. DOI: 10.1126/science.1225829 |
| [6] | van der Oost J. Molecular biology. New tool for genome surgery. Science, 2013, 339(6121): 768–770. DOI: 10.1126/science.1234726 |
| [7] | Miao J, Guo DS, Zhang JZ, et al. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cas system. Cell Res, 2013, 23(10): 1233–1236. DOI: 10.1038/cr.2013.123 |
| [8] | Feng ZY, Zhang BT, Ding WN, et al. Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system. Cell Res, 2013, 23(10): 1229–1232. DOI: 10.1038/cr.2013.114 |
| [9] | Xie KB, Yang YN. RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system. Mol Plant, 2013, 6(6): 1975–1983. DOI: 10.1093/mp/sst119 |
| [10] | Jiang W, Zhou H, Bi H, et al. Demonstration of CRISPR/Cas9/sgRNA-mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice. Nucleic Acids Res, 2013, 41(20): e188. DOI: 10.1093/nar/gkt780 |
| [11] | Li W, Teng F, Li T, et al. Simultaneous generation and germline transmission of multiple gene mutations in rat using CRISPR-Cas systems. Nat Biotechnol, 2013, 31(8): 684–686. DOI: 10.1038/nbt.2652 |
| [12] | Mao YF, Zhang H, Xu NF, et al. Application of the CRISPR-cas system for efficient genome engineering in plants. Mol Plant, 2013, 6(6): 2008–2011. DOI: 10.1093/mp/sst121 |
| [13] | Bortesi L, Fischer R. The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnol Adv, 2015, 33(1): 41–52. DOI: 10.1016/j.biotechadv.2014.12.006 |
| [14] | Feng ZY, Mao YF, Xu NF, et al. Multigeneration analysis reveals the inheritance, specificity, and patterns of CRISPR/Cas-induced gene modifications in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(12): 4632–4637. DOI: 10.1073/pnas.1400822111 |
| [15] | Minkenberg B, Xie KB, Yang YN. Discovery of rice essential genes by characterizing a CRISPR-edited mutation of closely related rice MAP kinase genes. Plant J, 2017, 89(3): 636–648. DOI: 10.1111/tpj.13399 |
| [16] | Zhang H, Zhang JS, Wei PL, et al. The CRISPR/Cas9 system produces specific and homozygous targeted gene editing in rice in one generation. Plant Biotechnol J, 2014, 12(6): 797–807. DOI: 10.1111/pbi.2014.12.issue-6 |
| [17] | Zhou HB, Liu B, Weeks DP, et al. Large chromosomal deletions and heritable small genetic changes induced by CRISPR/Cas9 in rice. Nucleic Acids Res, 2014, 42(17): 10903–10914. DOI: 10.1093/nar/gku806 |
| [18] | Wang BM, Li KY, Wang A, et al. Highly efficient CRISPR/HDR-mediated knock-in for mouse embryonic stem cells and zygotes. Biotechniques, 2015, 59(4): 201-202, 204, 206-208. |
| [19] | Sun YW, Zhang X, Wu CY, et al. Engineering herbicide-resistant rice plants through CRISPR/Cas9-mediated homologous recombination of acetolactate synthase. Molecular Plant, 2016, 9(4): 628–631. DOI: 10.1016/j.molp.2016.01.001 |
| [20] | Li JF, Norville JE, Aach J, et al. Multiplex and homologous recombination-mediated genome editing in Arabidopsis and Nicotiana benthamiana using guide RNA and Cas9. Nat Biotechnol, 2013, 31(8): 688–691. DOI: 10.1038/nbt.2654 |
| [21] | Baltes NJ, Gil-Humanes J, Cermak T, et al. DNA replicons for plant genome engineering. Plant Cell, 2014, 26(1): 151–163. DOI: 10.1105/tpc.113.119792 |
| [22] | Wang MG, Lu YM, Botella JR, et al. Gene targeting by homology-directed repair in rice using a geminivirus-based CRISPR/Cas9 system. Mol Plant, 2017. DOI: 10.1016/j.molp.2017.03.002 |
| [23] | Gil-Humanes J, Wang YP, Liang Z, et al. High-efficiency gene targeting in hexaploid wheat using DNA replicons and CRISPR/Cas9. Plant J, 2017, 89(6): 1251–1262. DOI: 10.1111/tpj.2017.89.issue-6 |
| [24] | Li J, Meng X, Zong Y, et al. Gene replacements and insertions in rice by intron targeting using CRISPR-Cas9. Nat Plants, 2016, 2: 16139. DOI: 10.1038/nplants.2016.139 |
| [25] | Cheng AW, Wang HY, Yang H, et al. Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system. Cell Res, 2013, 23(10): 1163–1171. DOI: 10.1038/cr.2013.122 |
| [26] | Gilbert LA, Larson MH, Morsut L, et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell, 2013, 154(2): 442–451. DOI: 10.1016/j.cell.2013.06.044 |
| [27] | Maeder ML, Linder SJ, Cascio VM, et al. CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nat Methods, 2013, 10(10): 977–979. DOI: 10.1038/nmeth.2598 |
| [28] | Perez-Pinera P, Kocak DD, Vockley CM, et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nat Methods, 2013, 10(10): 973–976. DOI: 10.1038/nmeth.2600 |
| [29] | Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature, 2015, 517(7536): 583–588. |
| [30] | Zalatan JG, Lee ME, Almeida R, et al. Engineering complex synthetic transcriptional programs with CRISPR RNA scaffolds. Cell, 2015, 160(1/2): 339–350. |
| [31] | Fu YF, Foden JA, Khayter C, et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol, 2013, 31(9): 822–826. DOI: 10.1038/nbt.2623 |
| [32] | Cradick TJ, Fine EJ, Antico CJ, et al. CRISPR/Cas9 systems targeting β-globin and CCR5 genes have substantial off-target activity. Nucleic Acids Res, 2013, 41(20): 9584–9592. DOI: 10.1093/nar/gkt714 |
| [33] | Hsu PD, Scott DA, Weinstein JA, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol, 2013, 31(9): 827–832. DOI: 10.1038/nbt.2647 |
| [34] | Mali P, Aach J, Stranges PB, et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol, 2013, 31(9): 833–838. DOI: 10.1038/nbt.2675 |
| [35] | Pattanayak V, Lin S, Guilinger JP, et al. High-throughput profiling of off-target DNA cleavage reveals RNA-programmed Cas9 nuclease specificity. Nat Biotechnol, 2013, 31(9): 839–843. DOI: 10.1038/nbt.2673 |
| [36] | Ran FA, Hsu PD, Lin CY, et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell, 2013, 154(6): 1380–1389. DOI: 10.1016/j.cell.2013.08.021 |
| [37] | Tsai SQ, Wyvekens N, Khayter C, et al. Dimeric CRISPR RNA-guided Fok Ⅰ nucleases for highly specific genome editing. Nat Biotechnol, 2014, 32(6): 569–576. DOI: 10.1038/nbt.2908 |
| [38] | Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to Fok Ⅰ nuclease improves the specificity of genome modification. Nat Biotechnol, 2014, 32(6): 577–582. DOI: 10.1038/nbt.2909 |
| [39] | Fu YF, Sander JD, Reyon D, et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol, 2014, 32(3): 279–284. DOI: 10.1038/nbt.2808 |
| [40] | Bolukbasi MF, Gupta A, Oikemus S, et al. DNA-binding-domain fusions enhance the targeting range and precision of Cas9. Nat Methods, 2015, 12(12): 1150–1156. DOI: 10.1038/nmeth.3624 |
| [41] | Davis KM, Pattanayak V, Thompson DB, et al. Small molecule-triggered Cas9 protein with improved genome-editing specificity. Nat Chem Biol, 2015, 11(5): 316–318. DOI: 10.1038/nchembio.1793 |
| [42] | Kleinstiver BP, Pattanayak V, Prew MS, et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature, 2016, 529(7587): 490–495. DOI: 10.1038/nature16526 |
| [43] | Slaymaker IM, Gao LY, Zetsche B, et al. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science, 2016, 351(6268): 84–88. DOI: 10.1126/science.aad5227 |
| [44] | Zetsche B, Gootenberg JS, Abudayyeh OO, et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell, 2015, 163(3): 759–771. DOI: 10.1016/j.cell.2015.09.038 |
| [45] | Hirano H, Gootenberg JS, Horii T, et al. Structure and engineering of Francisella novicida Cas9. Cell, 2016, 164(5): 950–961. DOI: 10.1016/j.cell.2016.01.039 |
| [46] | Wolt JD, Wang K, Sashital D, et al. Achieving plant CRISPR targeting that limits off-target effects. Plant Genome, 2016, 9(3). DOI: 10.3835/plantgenome2016.05.0047 |
| [47] | Xie KB, Zhang JW, Yang YN. Genome-wide prediction of highly specific guide RNA spacers for CRISPR-Cas9-mediated genome editing in model plants and major crops. Mol Plant, 2014, 7(5): 923–926. DOI: 10.1093/mp/ssu009 |
| [48] | Heigwer F, Kerr G, Boutros M. E-CRISP: fast CRISPR target site identification. Nat Methods, 2014, 11(2): 122–123. DOI: 10.1038/nmeth.2812 |
| [49] | Lei Y, Lu L, Liu HY, et al. CRISPR-P: a web tool for synthetic single-guide RNA design of CRISPR-system in plants. Mol Plant, 2014, 7(9): 1494–1496. DOI: 10.1093/mp/ssu044 |
| [50] | Ma XL, Zhang QY, Zhu QL, et al. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants. Mol Plant, 2015, 8(8): 1274–1284. DOI: 10.1016/j.molp.2015.04.007 |
| [51] | Lowder LG, Zhang DW, Baltes NJ, et al. A CRISPR/Cas9 toolbox for multiplexed plant genome editing and transcriptional regulation. Plant Physiol, 2015, 169(2): 971–985. DOI: 10.1104/pp.15.00636 |
| [52] | Nissim L, Perli SD, Fridkin A, et al. Multiplexed and programmable regulation of gene networks with an integrated RNA and CRISPR/Cas toolkit in human cells. Mol Cell, 2014, 54(4): 698–710. DOI: 10.1016/j.molcel.2014.04.022 |
| [53] | Xie KB, Minkenberg B, Yang YN. Boosting CRISPR/Cas9 multiplex editing capability with the endogenous tRNA-processing system. Proc Natl Acad Sci USA, 2015, 112(11): 3570–3575. DOI: 10.1073/pnas.1420294112 |
| [54] | Liang Y, Richardson S, Yan JW, et al. Endoribonuclease-based two-component repressor systems for tight gene expression control in plants. ACS Synth Biol, 2017, 6(5): 806–816. DOI: 10.1021/acssynbio.6b00295 |
| [55] | Gao YB, Zhao YD. Self-processing of ribozyme-flanked RNAs into guide RNAs in vitro and in vivo for CRISPR-mediated genome editing. J Integr Plant Biol, 2014, 56(4): 343–349. DOI: 10.1111/jipb.v56.4 |
| [56] | Leenay RT, Maksimchuk KR, Slotkowski RA, et al. Identifying and visualizing functional PAM diversity across CRISPR-cas systems. Mol Cell, 2016, 62(1): 137–147. DOI: 10.1016/j.molcel.2016.02.031 |
| [57] | Leenay RT, Beisel CL. Deciphering, communicating, and engineering the CRISPR PAM. J Mol Biol, 2017, 429(2): 177–191. DOI: 10.1016/j.jmb.2016.11.024 |
| [58] | Kleinstiver BP, Prew MS, Tsai SQ, et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities. Nature, 2015, 523(7561): 481–485. DOI: 10.1038/nature14592 |
| [59] | Hu XX, Wang C, Fu YP, et al. Expanding the range of CRISPR/Cas9 genome editing in rice. Mol Plant, 2016, 9(6): 943–945. DOI: 10.1016/j.molp.2016.03.003 |
| [60] | Komor AC, Kim YB, Packer MS, et al. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature, 2016, 533(7603): 420–424. DOI: 10.1038/nature17946 |
| [61] | Nishida K, Arazoe T, Yachie N, et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science, 2016, 353(6305): aaf8729. DOI: 10.1126/science.aaf8729 |
| [62] | Hess GT, Frésard L, Han K, et al. Directed evolution using dCas9-targeted somatic hypermutation in mammalian cells. Nat Methods, 2016, 13(12): 1036–1042. DOI: 10.1038/nmeth.4038 |
| [63] | Ma YQ, Zhang JY, Yin WJ, et al. Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enables efficient genomic diversification in mammalian cells. Nat Methods, 2016, 13(12): 1029–1035. DOI: 10.1038/nmeth.4027 |
| [64] | Kim D, Lim K, Kim ST, et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nat Biotechnol, 2017, 35(5): 475–480. DOI: 10.1038/nbt.3852 |
| [65] | Shimatani Z, Kashojiya S, Takayama M, et al. Targeted base editing in rice and tomato using a CRISPR-Cas9 cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol, 2017, 35(5): 441–443. DOI: 10.1038/nbt.3833 |
| [66] | Zong Y, Wang YP, Li C, et al. Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion. Nat Biotechnol, 2017, 35(5): 438–440. DOI: 10.1038/nbt.3811 |
| [67] | Lu YM, Zhu JK. Precise editing of a target base in the rice genome using a modified CRISPR/Cas9 system. Mol Plant, 2017, 10(3): 523–525. DOI: 10.1016/j.molp.2016.11.013 |
| [68] | Li JY, Sun YW, Du JL, et al. Generation of targeted point mutations in rice by a modified CRISPR/Cas9 system. Mol Plant, 2017, 10(3): 526–529. DOI: 10.1016/j.molp.2016.12.001 |
| [69] | Kim D, Kim J, Hur JK, et al. Genome-wide analysis reveals specificities of Cpf1 endonucleases in human cells. Nat Biotechnol, 2016, 34(8): 863–868. DOI: 10.1038/nbt.3609 |
| [70] | Fonfara I, Richter H, Bratovič M, et al. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature, 2016, 532(7600): 517–521. DOI: 10.1038/nature17945 |
| [71] | Zetsche B, Heidenreich M, Mohanraju P, et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array. Nat Biotechnol, 2017, 35(1): 31–34. |
| [72] | Xu RF, Qin RY, Li H, et al. Generation of targeted mutant rice using a CRISPR-Cpf1 system. Plant Biotechnol J, 2017, 15(6): 713–717. DOI: 10.1111/pbi.2017.15.issue-6 |
| [73] | Tang X, Lowder LG, Zhang T, et al. A CRISPR-Cpf1 system for efficient genome editing and transcriptional repression in plants. Nat Plants, 2017, 3: 17018. DOI: 10.1038/nplants.2017.18 |
| [74] | Yin XJ, Biswal AK, Dionora J, et al. CRISPR-Cas9 and CRISPR-Cpf1 mediated targeting of a stomatal developmental gene EPFL9 in rice. Plant Cell Reports, 2017, 36(5): 745–757. DOI: 10.1007/s00299-017-2118-z |
| [75] | Tóth E, Weinhardt N, Bencsura P, et al. Cpf1 nucleases demonstrate robust activity to induce DNA modification by exploiting homology directed repair pathways in mammalian cells. Biol Direct, 2016, 11: 46. DOI: 10.1186/s13062-016-0147-0 |
| [76] | Hu XX, Wang C, Liu Q, et al. Targeted mutagenesis in rice using CRISPR-Cpf1 system. J Genet Genomics, 2017, 44(1): 71–73. DOI: 10.1016/j.jgg.2016.12.001 |
| [77] | Ungerer J, Pakrasi HB. Cpf1 is a versatile tool for CRISPR genome editing across diverse species of cyanobacteria. Sci Rep, 2016, 6: 39681. DOI: 10.1038/srep39681 |
| [78] | Endo A, Masafumi M, Kaya H, et al. Efficient targeted mutagenesis of rice and tobacco genomes using Cpf1 from Francisella novicida. Sci Rep, 2016, 6: 38169. DOI: 10.1038/srep38169 |
| [79] | Wang MG, Mao YF, Lu YM, et al. Multiplex gene editing in rice using the CRISPR-Cpf1 system. Mol Plant, 2017. DOI: 10.1016/j.molp.2017.03.001 |
| [80] | Wolt JD, Wang K, Yang B. The regulatory status of genome-edited crops. Plant Biotechnol J, 2016, 14(2): 510–518. DOI: 10.1111/pbi.2016.14.issue-2 |
| [81] | Wang YP, Cheng X, Shan QW, et al. Simultaneous editing of three homoeoalleles in hexaploid bread wheat confers heritable resistance to powdery mildew. Nat Biotechnol, 2014, 32(9): 947–951. DOI: 10.1038/nbt.2969 |
| [82] | Zhou H, He M, Li J, et al. Development of commercial thermo-sensitive genic male sterile rice accelerates hybrid rice breeding using the CRISPR/Cas9-mediated TMS5 editing system. Sci Rep, 2016, 6: 37395. DOI: 10.1038/srep37395 |
| [83] | Ji X, Zhang H, Zhang Y, et al. Establishing a CRISPR-Cas-like immune system conferring DNA virus resistance in plants. Nat Plants, 2015, 1: 15144. DOI: 10.1038/nplants.2015.144 |
| [84] | Baltes NJ, Hummel AW, Konecna E, et al. Conferring resistance to geminiviruses with the CRISPR-Cas prokaryotic immune system. Nat Plants, 2015, 1(10): 15145. DOI: 10.1038/nplants.2015.145 |
| [85] | Ali Z, Abulfaraj A, Idris A, et al. CRISPR/Cas9-mediated viral interference in plants. Genome Biol, 2015, 16: 238. DOI: 10.1186/s13059-015-0799-6 |
| [86] | Woo JW, Kim J, Kwon SI, et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nat Biotechnol, 2015, 33(11): 1162–1164. DOI: 10.1038/nbt.3389 |
| [87] | Svitashev S, Schwartz C, Lenderts B, et al. Genome editing in maize directed by CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nat Commun, 2016, 7: 13274. DOI: 10.1038/ncomms13274 |
| [88] | Malnoy M, Viola R, Jung MH, et al. DNA-free genetically edited grapevine and apple protoplast using CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins. Front Plant Sci, 2016, 7: 1904. |
| [89] | Kim H, Kim ST, Ryu J, et al. CRISPR/Cpf1-mediated DNA-free plant genome editing. Nat Commun, 2017, 8: 14406. DOI: 10.1038/ncomms14406 |
| [90] | Zhang Y, Liang Z, Zong Y, et al. Efficient and transgene-free genome editing in wheat through transient expression of CRISPR/Cas9 DNA or RNA. Nat Commun, 2016, 7: 12617. DOI: 10.1038/ncomms12617 |
| [91] | Waltz E. Gene-edited CRISPR mushroom escapes US regulation. Nature, 2016, 532(7599): 293. DOI: 10.1038/nature.2016.19754 |