2017, Vol. 33中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 杨帆, 李寅
- Fan Yang, Yin Li
- 新一代基因组编辑系统CRISPR/Cpf1
- The new generation tool for CRISPR genome editing: CRISPR/Cpf1
- 生物工程学报, 2017, 33(3): 361-371
- Chin J Biotech, 2017, 33(3): 361-371
- 10.13345/j.cjb.170029
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文章历史
- Received: January 28, 2017
- Accepted: February 13, 2017
引用本文
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2 中国科学院大学，北京 100049
2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
CRISPR/Cas系统 (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein) 是细菌和古菌在抵御外来病毒和噬菌体入侵的过程中不断进化而来的一种获得性免疫防御机制。CRISPR的研究始于1987年，于2002年被正式命名，至2011年其获得性免疫防御机制基本研究清楚[1]。2012年，Jinek等证实了Cas9可以在体外条件下与DNA靶序列的特定位点结合并进行剪切，由此揭开了将CRISPR/Cas9改造为基因编辑工具的序幕[1-2]。
人类基因组计划使人们能够读取“生命代码”，CRISPR/Cas9及其衍生技术则是人类改写生命代码的“神笔”。近5年来，CRISPR/Cas9技术为生物领域带来了巨大的冲击，2013年被Science杂志评为十大科学突破之一，2015年更是荣登榜首。利用CRISPR/Cas9技术，科学家们能够高效、精确地对DNA序列进行修剪、替换或添加，可以快速地实现微生物基因组编辑、动植物的品种优化、动物模型构建，甚至推动疾病治疗的颠覆性革命[1, 3-4]。
然而，随着研究的不断深入，CRISPR/Cas9也暴露了它的缺陷和局限性，例如严重的脱靶效应[1, 5-6]。如何改造CRISPR/Cas9，降低其脱靶效应，提高基因编辑精确度，是目前科学家们关注和研究的重点[7]。
与此同时，科学家们也致力于寻找新的基因编辑系统。2015年，麻省理工学院 (Massachusetts Institute of Technology，MIT) 的张峰小组报道了一种新的2类Ⅴ型CRISPR效应蛋白Cpf1，是在单链向导RNA引导下与靶DNA特定位点结合并切割的核酸内切酶[8]。
与Cas9相比，Cpf1只需一段42-44个核苷酸组成的单链RNA即可识别和剪切DNA，从而简化了实验设计步骤，更有利于多基因编辑；Cpf1能够识别富含胸腺嘧啶 (T) 的PAM序列 (Protospacer adjacent motif)，可以扩展CRISPR的编辑范围；此外，Cpf1剪切会产生黏性末端，可促进目的基因通过非同源重组的方式插入靶定位点。CRISPR/Cpf1的开发有利于突破和克服CRISPR/Cas9应用中的一些限制[9]，因此被称为是新一代的CRISPR基因组编辑工具。
1 CRISPR系统的分类和作用机制CRISPR/Cas系统存在于几乎所有的古菌和大多数细菌中[10]。CRISPR/Cas基因簇由一系列Cas蛋白 (Cas1、Cas2、Cas4和效应蛋白如Cas9、Cpf1等) 的编码基因和一段CRISPR序列组成，后者由一段前导序列、许多重复序列和间隔序列顺序排列组成。
根据Cas基因的组成和效应蛋白的数量，CRISPR被分为了2类5型，共16种亚型[11-12]。1类为利用多个效应蛋白复合物干扰靶基因的CRISPR/Cas系统，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；2类为利用单一的效应蛋白干扰靶基因的CRISPR/Cas系统，包括Ⅱ型和Ⅴ型。目前研究得最为清楚的CRISPR/Cas9为2类Ⅱ型CRISPR系统，2015年张锋小组新发现的CRISPR/Cpf1属于2类Ⅴ型CRISPR系统。
无论哪一类型的CRISPR系统，其抵御外来遗传物质入侵的免疫防御过程都可分为3个阶段[13]：
第一为适应阶段，首次入侵的外源DNA的前间隔序列 (Protospacer) 被古菌或细菌中的Cas蛋白获取，并作为间隔序列 (Spacer) 插入CRISPR中的两段重复序列之间。
第二为表达阶段，外源DNA再次入侵时，细菌开始转录CRISPR，形成初级转录产物pre-crRNA，再由核糖核酸酶或Cas蛋白在重复序列位点内切割形成成熟的crRNA。
第三为干扰阶段，成熟的crRNA与特异的CRISPR效应蛋白形成核糖核蛋白复合体，识别并切割能与crRNA互补配对的外源DNA，造成双链断裂，激活细胞的非同源末端连接 (Non-homologous end joining，NHEJ) 或同源重组 (Homologous recombination，HR) 两种修复机制，从而实现基因的敲除、插入或修饰。
2 Cpf1与Cas9的比较Cpf1首先在新凶手弗朗西斯菌Francisella novicida和普雷沃菌Prevotella等微生物中被发现和Cas9同时存在，根据其基因组成及作用机制，CRISPR/Cpf1被确定为2类Ⅴ型CRISPR系统[8]。
然而，CRISPR/Cpf1的作用机制与同为2类的CRISPR/Cas9系统有很大的不同 (表 1)。
| Cpf1 | Cas9 | |
| 蛋白大小 | 含1 200至1 300个氨基酸[8]，分子量较小 | 含1 368个氨基酸[15]，分子量较大 |
| 蛋白结构 | 含有RuvC结构域和一个推定的核酸酶结构域，不含HNH结构域[18] | 含有RuvC结构域和HNH结构域[15] |
| 性质 | 同时具有DNA和RNA内切酶活性[8, 14] | 只具有DNA内切酶活性[1] |
| Pre-crRNA成熟的加工因子 | 不需要tracrRNA，由Cpf1加工成熟[8, 14] | crRNA和tracrRNA互补形成RNA二聚体，在Cas9蛋白存在的条件下，由Rnase Ⅲ加工成熟[13] |
| DNA剪切复合体 | Cpf1-crRNA核糖核蛋白复合体，crRNA长度为42-44 nt[8] | Cas9-crRNA-tracrRNA核糖核蛋白复合体 (或sgRNA-Cas9核糖核蛋白复合体，sgRNA长度一般大于100 nt) [27] |
| DNA识别位点 | 前间隔序列5′端的PAM序列[8] | 前间隔序列3′端的PAM序列[1, 8] |
| PAM序列 | T-rich序列, 5′-YTN-3′, 5′-TTTN-3′[8] | G-rich序列，5′-NGG-3′[1, 8] |
| 剪切位点 | PAM序列下游靶DNA链的第23位核苷酸和非靶DNA链的18位核苷酸处[8] | PAM序列上游第3位核苷酸外侧[4] |
| 形成末端 | 5个核苷酸突出的黏性末端[8] | 平末端[1] |
第一，Cpf1的分子量比Cas9小。目前广泛使用的Cas9来源于酿脓链球菌Streptococcus pyogenes (下文简写为spCas9)，含有1 368个氨基酸；而新凶手弗朗西斯菌Francisella novicida U112、氨基酸球菌Acidaminococcus sp. BV3L6和毛螺科菌Lachnospiraceae bacterium ND2006来源的Cpf1 (下文分别简写为FnCpf1、AsCpf1和LbCpf1) 分别含有1 300、1 307和1 228个氨基酸。
第二，Cas9和Cpf1均是单链RNA指导的核酸内切酶，但Cas9只具有DNA内切酶活性，而Cpf1同时具有DNA和RNA内切酶活性。
第三，CRISPR/Cas9初级转录产物pre-crRNA的成熟需要反式激活crRNA (Trans-activating crRNA，tracrRNA) 与crRNA互补配对，在Cas9存在的条件下，由RNase Ⅲ加工完成。而CRISPR/Cpf1的初级转录产物pre-crRNA由Cpf1自身加工，不需要tracrRNA的参与[8, 14]。
第四，Cas9与由crRNA和tracrRNA配对形成的RNA二聚体结合，形成Cas9-crRNA-tracrRNA核糖核蛋白复合体，识别和切割靶基因序列。将crRNA和tracrRNA融合成一条sgRNA (Single-guide RNA)，也可以引导Cas9切割DNA；sgRNA长度一般大于100 nt，靶定不同的基因需要设计不同的sgRNA。而Cpf1与成熟crRNA形成Cpf1-crRNA核糖核蛋白二元复合体，即可实现对靶基因的识别和剪切；Cpf1剪切DNA所需的crRNA长度仅为42-44 nt，只需要替换CRISPR中的间隔序列就可以靶定不同基因，实现多个基因的同时编辑，因此设计步骤可以显著简化，实验成本也可以显著降低，同时降低了将CRISPR/Cpf1系统递送至编辑对象的难度。
第五，Cas9识别位于靶序列的3′端的富含胞嘧啶 (G) 的PAM序列 (5′-NGG-3′)，而Cpf1识别位于靶序列5′端富含胸腺嘧啶 (T) 的PAM序列。另外，不同来源的Cpf1识别的PAM序列也有所不同：FnCpf1识别的PAM序列为5′-YTN-3′，AsCpf1和LbCpf1识别的PAM序列为5′-TTTN-3′。Cpf1识别的PAM序列与Cas9不同，极大地扩宽了CRISPR系统基因组编辑的靶点范围，尤其是富含AT的基因组。
第六，Cas9剪切位点离PAM序列很近，在其上游第3个核苷酸处进行切割，若发生NHEJ修复，造成的核苷酸插入或缺失会改变PAM临近序列，导致Cas9无法再次识别和切割靶位点，从而阻碍同源重组修复在靶位点引入正确的基因编辑；而Cpf1的剪切位点离PAM序列较远，在靶DNA链的PAM序列下游第23位核苷酸和非靶DNA链的第18位核苷酸处进行切割，NHEJ修复造成的核苷酸插入或缺失，不会改变PAM临近序列，Cpf1仍然可以识别和切割靶基因，同源重组修复依然可以在靶位点引入正确的基因编辑，从而提高了CRISPR系统的基因编辑效率，也便于对同一位点进行多轮的基因编辑。
第七，Cas9切割DNA形成一个平末端；而Cpf1切割DNA形成一个有5个核苷酸突出的黏性末端。利用CRISPR/Cas9进行基因插入时，需要在插入基因的两端添加较长的同源臂，通过同源重组的方式将其插入靶位点；而利用CRISPR/Cpf1进行基因插入时，若在插入基因的两端添加与靶位点对应的黏性末端，就可以使插入基因通过NHEJ修复以可控的方向插入靶位点，而不必依赖于同源重组。因此，对于同源重组发生概率较低的编辑对象，CRISPR/Cpf1是有利的基因编辑工具。
3 Cpf1的结构生物学研究2014年，张峰小组解析了Cas9-sgRNA-DNA三元复合体的晶体结构，揭示了Cas9识别和切割靶向DNA的分子机制，并为Cas9的改造和优化提供了充分的依据[15]。
Cpf1呈现与Cas9不同的剪切特性，如具有RNA内切酶活性、识别富含胸腺嘧啶 (T) 的PAM序列、切割产生黏性末端等。为了研究Cpf1识别和剪切RNA以及DNA的分子机制，研究人员对Cpf1核糖核蛋白的晶体结构进行了解析，并比较了Cpf1与Cas9识别和剪切目标基因机制的异同。
3.1 Cpf1-crRNA二元复合物的晶体结构解析2016年4月，哈尔滨工业大学的黄志伟教授课题组成功解析了LbCpf1-crRNA核糖核蛋白复合物的晶体结构，揭示了Cpf1识别crRNA和剪切pre-crRNA的分子机制[16]。
与Cas9相似，LbCpf1与crRNA结合形成的二元复合物也为二裂片结构，外观呈三角形，中心形成一个带正电荷的通道。LbCpf1在没有crRNA结合的状态下处于松散的构象，crRNA的结合并不诱导LbCpf1寡聚化，而是引发Cpf1发生显著的构象变化，转变为紧凑的三角形结构，使得crRNA可以和靶基因序列在蛋白中心的正电荷通道内形成异源双链核酸分子。另外，该晶体结构显示LbCpf1的RNA酶活性与其H843、K852以及K869的3个氨基酸有关。
然而，sgRNA与crRNA长度的差异，导致Cas9和sgRNA的结合方式与Cpf1和crRNA的结合方式有很大差别。除去与靶DNA互补配对的向导序列，sgRNA其余部分的长度是crRNA重复序列的3.5-4倍，并含有多个结构模块，sgRNA以伸展的构象与Cas9结合，扩大了sgRNA和Cas9的接触面积，增加了与Cas9之间的相互作用，以维持Cas9多个结构域的稳定结构。crRNA则呈一种高度扭曲的构象，被LbCpf1蛋白中部的寡聚核苷酸结合结构域 (Oligonucleotide binding domain，OBD) 识别。crRNA的长度较短，Cpf1的多个结构域不与crRNA相互作用，在结合目标DNA时依然可以发生空间位移。
因此，Cpf1-crRNA二元复合物结构的解析，也为研究crRNA如何诱导Cpf1识别和结合DNA底物提供了一定的依据。进一步对Cpf1-crRNA-DNA三元复合物结构的解析表明，Cpf1和crRNA、Cas9和sgRNA不同的结合方式也导致了两者DNA底物识别机制的差异。
3.2 Cpf1-crRNA-targeted DNA三元复合物的晶体结构解析为了阐述Cpf1如何识别和剪切DNA，MIT的张峰研究组和东京大学Osamu Nureki教授、中国科学院生物物理研究所的高璞研究组与纪念斯隆-凯特琳癌症中心的研究人员先后解析了AsCpf1-crRNA-DNA三元复合物晶体结构[17-18]。
Cpf1和Cas9的核糖核蛋白三元复合物具有相似的整体结构。AsCpf1与Cas9同样采用二裂片结构，外观呈蟹钳状，分为识别叶 (Recognition lobe，REC) 和核酸酶叶 (Nuclease lobe，NUC)。但不同的是，Cas9核酸酶叶包含RuvC和HNH两个核酸酶结构域，分别负责切割非靶向和靶向DNA链，产生平末端；而AsCpf1的NUC叶没有HNH结构域，由RuvC结构域和一个推定的新的核酸酶结构域 (Nuc) 组成，分别负责切割非靶向及靶向DNA链，产生黏性末端。RuvC剪切非靶向DNA链是Nuc剪切靶向DNA链的先决条件。
另外，Cpf1-crRNA二元复合物和Cpf1-crRNA-DNA三元复合物的结构的比较也揭示了Cpf1与Cas9不同的DNA识别机制。
首先，sgRNA和crRNA上靠近PAM序列的区域均存在一段“种子序列”，可与靶DNA序列互补配对，对于Cas9和Cpf1识别和切割DNA至关重要。由于sgRNA和crRNA在二元复合体中呈现不同的构象，“种子序列”在Cas9-sgRNA二元复合体中形成有序的A型结构，而在Cpf1-crRNA二元复合体中是无序的，在Cpf1-crRNA-DNA三元复合体中才转变为有序的A型结构。
其次，PAM互作裂缝在Cas9-sgRNA二元复合体中也已预先形成，是Cas9识别目标DNA的另一个关键结构，但在Cpf1-crRNA二元复合体中还未形成，目标DNA的结合诱导Cpf1内部结构重排，多个结构域发生空间位移，PAM互作裂口经历一个“从开到关”的构象改变，以容纳有序的A型种子序列和靶DNA在正电荷通道内形成异源双链核酸分子。
Cpf1识别目标DNA时种子序列“从无序到有序”和PAM互作裂缝“从开到关”的构象变化，可能有利于降低其基因编辑的脱靶效应。
4 CRISPR/ Cpf1的应用研究 4.1 CRISPR/Cpf1在微生物基因编辑中的应用CRISPR/Cas9在大肠杆菌[19-20]、酵母[21]等常用的微生物模式菌株中的应用已经趋于成熟，通过设计一段可与靶基因区域PAM序列上游20个核苷酸互补配对的向导序列 (N20)，就可以对宿主的任意基因进行编辑。蓝细菌是一种光合自养的原核生物，近年来越来越多地应用于光合固碳和高附加值化学品生物合成的研究[22-24]。然而，和大肠杆菌、酵母等微生物相比，蓝细菌的基因编辑工具单一，主要依靠其低概率的自发同源重组，且由于蓝细菌的基因组拷贝数较高，插入基因也难以稳定存在。
为了改变这一现状，研究学者开始尝试将CRISPR/Cas系统改造为蓝细菌适用的精确、高效的基因编辑工具。最近，CRISPR/Cas9被成功用于蓝细菌模式菌株细长聚球藻Synechococcus elongatus PCC 7942和UTEX 2973中[25-26]。然而，研究发现Cas9对S. elongatus PCC 7942和UTEX 2973均存在不同程度的细胞毒性，推测是由Cas9在非靶位点切割DNA导致双链断裂而引起的细胞死亡。
2016年12月，Pakrasi研究组利用CRISPR/Cpf1对蓝细菌进行基因编辑[27]。作者将FnCpf1蛋白及靶定目标基因的crRNA克隆在广谱宿主质粒RSF1010上，成功地对S. elongatus UTEX 2973、集胞藻Synechocystis sp. PCC 6803和鱼腥藻Anabaena 7120三种不同类型的蓝细菌基因组进行了基因的敲除、插入和点突变。作者发现，FnCpf1对蓝细菌的细胞毒性比Cas9低得多，因此对蓝细菌基因编辑而言，CRISPR/Cpf1的潜力更大。
4.2 CRISPR/Cpf1在植物基因编辑中的应用目前，CRISPR/Cas9在拟南芥、烟草、小麦和玉米等多种植物基因组编辑中都有广泛的应用[28-31]，也逐渐应用于植物基因表达调控、表观基因组学和遗传育种等领域。尽管构建的Cas9突变体能够识别5′-NGA-3′、5′-NGCG-3′等非典型的PAM序列，但是CRISPR/Cas9可编辑的植物基因靶点范围，依然局限于富含鸟嘌呤 (G) 的基因位点[32]。由于Cpf1识别的PAM序列与Cas9不同，CRISPR/Cpf1可以进一步地扩展对植物基因组的编辑能力。
2016年12月，3个研究组先后利用CRISPR/Cpf1完成了对植物基因组的编辑[33-35]。日本学者Toki等证明了FnCpf1可成功地在烟草和水稻基因组中引入可遗传的突变，且在水稻中引发的突变效率比在烟草中要高[35]。中国农业科学院的王克剑小组和安徽省农业科学院的杨建波小组研究发现LbCpf1能够对水稻基因组进行有效编辑，但突变效率与靶基因的核苷酸组成有一定的关系，而AsCpf1则不能完成对水稻基因组编辑[33-34]。与Cas9一般造成1到2个核苷酸的插入和缺失不同，Cpf1在所有靶位点均产生6到38个核苷酸片段的缺失，因此Cpf1可能更适用于植物基因组中长核苷酸片段的敲除。
有趣的是，Toki和杨建波小组的研究均发现，利用CRISPR/Cpf1得到的烟草和水稻突变株都存在杂合子或嵌合体，表明CRISPR/Cpf1诱导的基因突变可能只发生在1个等位基因上；或在胚胎细胞第一次分裂之后，只发生在部分体细胞中。在CRIPSR/Cas9对拟南芥进行基因编辑中也报道过类似的结果，研究者发现用组织特异性启动子表达Cas9可以减少嵌合体的产生。因此，利用诱导型或组织特异性启动子在时间和空间上控制Cpf1的表达，也许能够减少杂合子或嵌合体的产生。
另外，上述3项研究都对Cpf1在水稻中潜在的脱靶效应进行了评估。Toki等发现FnCpf1在烟草和水稻中都存在脱靶效应，但脱靶位点的基因突变频率为0-6.25%，比靶位点 (21.4%-23.3%) 低得多。然而，中国的两个研究组均没有检测到LbCpf1在水稻基因组的脱靶位点处产生的突变。这可能与LbCpf1识别的PAM序列 (5′-TTTN-3′) 比FnCpf1的PAM序列 (5′-TTN-3′) 更长有关。PAM序列越长，基因组上潜在的脱靶位点则更少，Cpf1识别靶基因的准确度也越高。
综上所述，CRISPR/Cpf1是除CPRISPR/Cas9以外可供选择的一种有效的植物基因组编辑工具，且脱靶效应低。尽管如此，CRISPR/Cpf1仍然存在突变效率较低、形成杂合子或嵌合体[35]等亟待解决的问题，还需要进一步地改良和优化，以提高CRISPR/Cpf1对植物基因组的编辑能力。
4.3 CRISPR/Cpf1在动物基因编辑中的应用CRISPR/Cas系统在动物研究中也有广泛的应用。目前，研究者们利用CRISPR/Cas9成功地在人体、小鼠、果蝇和羊等动物细胞中实现了基因编辑[36-39]和基因调控[40]，在动物品种改良方面具有极大的潜力。更令人惊喜的是，越来越多的研究成果揭示了CRISPR技术在生物医学领域的广阔应用前景和无限可能性。例如，成功地构建小鼠癌症模型[41]、重现肿瘤染色体易位[42]、实现了将艾滋病毒从人类基因组中完全剔除[37]等。
CRISPR系统在动物研究中的应用仍存在一定问题。首先，CRISPR/Cas9存在严重的脱靶效应[1, 6-7]，因为Cas9的特异性仅依赖于sgRNA上靠近PAM序列的10-12个核苷酸与靶基因的互补配对，而远离PAM序列的其余8-10个核苷酸发生碱基错配对靶位点的识别没有明显的影响。其次，Cas9的运送受限于病毒载体的容量大小，往往需要共转多个表达载体来实现对多个基因的编辑，增加了将Cas9导入编辑对象的难度[1, 43]。
2015年，张峰研究组在16种不同来源的Cpf1蛋白中发现AsCpf1和LbCpf1两种可在人体细胞中引入片段的插入和缺失[8]。这两种Cpf1蛋白一经发现，便被迅速地应用于动物基因编辑中[44-46]。
基因敲除小鼠模型是研究基因功能、疾病发生机理、寻找合适药物靶标的重要工具。2016年，韩国的两个研究组分别将Cpf1 mRNA及其相对应的crRNA[44]、预组装的Cpf1核糖核蛋白[45] (RNP) 通过显微注射法导入小鼠胚胎中，成功获得了基因突变的小鼠，突变效率与SpCas9相当，且均没有检测到脱靶效应。
Cpf1在动物中也存在产生嵌合体的现象。嵌合体动物必须通过远交才能产生纯合的、无嵌合性的突变个体，需要花费数月或更长的时间。与植物一样，动物的嵌合性也是由Cpf1诱导的细胞突变发生在胚胎细胞第一次分裂之后导致的，因此Cpf1在动植物中发挥功能可能需要较长的时间。利用CRISPR/Cas9直接编辑无性系的供体细胞，再通过体细胞核移植到无核卵母细胞中，产生的个体嵌合现象可大幅减少；或者利用CRISPR/Cas9直接在供体精子发生干细胞中进行基因编辑，也可避免胚胎发育的全能性和多能性状态，从而消除嵌合突变体后代的产生[47]。减少CRISPR/Cpf1产生的嵌合现象也可采用与CRISPR/Cas9类似的方法。
2016年，有两项研究先后评价了Cpf1在人体细胞中的脱靶效应，并与Cas9进行了比较[48-49]。首先，Cpf1对crRNA与靶DNA之间的碱基错配比Cas9更敏感。研究发现Cpf1对crRNA的间隔序列 (Spacer) 中靠近PAM序列的第1至18位核苷酸的碱基错配非常敏感，发生双碱基错配即可导致Cpf1完全失去剪切活性，对远离PAM序列的第19至23位核苷酸的碱基错配具有较高的容忍度；而Cas9与靶DNA识别的特异性依赖于靠近PAM序列的前10-12个核苷酸，而离PAM序列较远的其余8-10个核苷酸的碱基错配对靶位点的识别无显著影响。其次，Cpf1的脱靶效应比Cas9更低。研究人员利用Digenome-seq和GUIDE-seq两种方法分别在体外和体内条件下鉴定了LbCpf1和AsCpf1在人体基因组上的脱靶位点和突变频率，结果均表明LbCpf1和AsCpf1在人体基因组上的潜在脱靶位点比spCas9更少，且脱靶位点的基因突变频率也低于1%，远低于靶位点的突变频率。因此，Cpf1的脱靶效应比Cas9要小，对人类基因组的编辑具有更高的特异性。
如前所述，Cpf1在多基因编辑方面比Cas9更具优势。2016年，张峰研究组将CRISPR序列中的间隔序列分别替换成靶定不同目的基因的向导序列，与AsCpf1蛋白表达在同一个慢性病毒载体上，实现了对人体细胞中4个基因和小鼠原代皮层神经细胞中3个基因的同时编辑[43]。
综上，CRISPR/Cpf1是一种更有效的动物基因编辑工具，比CRISPR/Cas9更加适用于精确的基因组编辑。然而与CRISPR/Cas9一样，CRISPR/Cpf1在动物中也存在产生嵌合体的问题，需要进一步研究并加以解决。
5 展望由于Cpf1相对于Cas9的诸多优势，CRRISPR/Cpf1的应用正在不断扩展。CRISPR/Cpf1在水稻、小鼠和人体细胞基因编辑的应用中都基本没有脱靶效应，证明了CRRISPR-Cpf1基因编辑的高度特异性，比CRISPR/Cas9更适用于精确的基因组编辑，显示了CRRISPR/Cpf1在疾病模型建立、抗癌药物研制、干细胞治疗等生物和医学领域的应用潜力。
CRISPR/Cpf1依然存在诸多待解决的问题，例如，在植物和动物中会产生嵌合突变体，突变效率可能与靶基因序列的核苷酸组成有关等。如何提高CRISPR/Cpf1的基因编辑效率？如何扩大编辑对象和靶基因位点的范围？如何进一步提高基因编辑的精确度？如何在基因组水平上进行应用？如何将CRISPR/Cpf1技术应用于疾病治疗？以及由此引发的安全性和伦理问题，也都需要更加深入的研究和规则的制定加以解决。
CRISPR/Cpf1是生物学领域非常有价值的新工具，对它的研究也才刚刚开始，仍有许多发展、改造和利用的空间。相信在不久的将来，CRISPR/Cpf1及其衍生技术能够和CRISPR/Cas9一起，为科学研究和生命健康领域提供强大的和多样化的基因编辑工具。
致谢: 感谢赵同心斧正文章手稿。| [1] | Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell, 2014, 157(6): 1262–1278. DOI: 10.1016/j.cell.2014.05.010 |
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