近年来，猪腹泻病的流行越来越广，且疾病的复杂程度日益增加，给我国畜牧业造成了严重的经济损失。猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)和猪轮状病毒(Porcine rotavirus, PoRV)是引起猪腹泻的三种重要的病毒性病原^[1]。但近年来不断报道有新的腹泻病原出现，导致猪腹泻病原复杂化，疾病防控难度增加。兰道亮等^[2]报道华东地区猪群中猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus, PSV)平均阳性率达17.2%。蔡雨涵等^[3]报道湖北、湖南、河南省各大猪场中猪博卡病毒(Porcine bocavirus, PBoV)的阳性率达73.95%。刘玲玲等^[4]利用RT-PCR方法对江西省地区腹泻粪便检测，结果显示腹泻样本中猪丁型冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)的检出率为31.33%。Xiao等^[5]检测湖南猪场中猪星状病毒(Porcine astrovirus, PAstV)感染率达11.5%。猪嵴病毒(Porcine kobuvirus, PKV)也广泛存在于猪群中，其主要临床症状表现为胃肠炎，因此容易与TGEV相混淆，从而导致所谓的“疫苗使用效果不佳”^[6]。所以，开展猪病毒性腹泻病原调查十分必要，有助于对猪腹泻病的针对性治疗。

猪嵴病毒是小RNA病毒科嵴病毒属成员，该病毒于2007年首次在匈牙利健康猪腹泻粪便样品中发现。PKV主要危害3周龄以下的仔猪，可引起仔猪胃肠炎，出现严重腹泻，甚至死亡^[7]。PKV呈地方性流行，中国、泰国、韩国、日本、新西兰及巴西等^[8-13]均有PKV感染的相关报道。PKV与其他病毒混合感染现象也较普遍^[14]，不仅会促进仔猪腹泻疾病的发生，同时还会加重病情，其感染也不仅仅局限于肠道，还可以侵入血液并造成病毒血症。国内从2009年开始PKV阳性检出率呈逐年递增的趋势。很多学者推断PKV和目前的猪腹泻有着很大的关系，但也有报道指出PKV在无腹泻症状猪群中的阳性率比腹泻症状猪群还要高^[15]。因此，对猪群中PKV监测并进一步了解其致病特性和遗传规律具有重要意义。

本研究首先建立了针对7种报道较少的猪病毒性腹泻相关病原的多重RT-PCR检测方法，通过对临床样品的检测，明确了上海地区PKV的感染率及其混合感染情况；进一步测定了不同猪场来源的PKV毒株的全基因组序列，并分析其遗传进化规律，为后续深入研究PKV的致病性奠定基础。

PEDV、TGEV、猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、猪源牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)、猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)均由上海市农业科学院畜牧兽医研究所分离保存。

419份粪便样品采自上海及周边猪场中有腹泻症状的猪。

100 bp DNA ladder marker、pMD-18 T载体、rTaq DNA聚合酶、TRIzol、M-MLV (RNase H-)、dNTPs均购自TaKaRa公司；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Tiangen公司；DH5α菌株由本实验室保存，其他常规试剂均为国产分析纯级产品。

主要仪器包括梯度PCR仪(ABI)、低温台式高速离心机(Beckman)、涡旋振荡仪(Vision)、凝胶成像分析系统(Bio-Rad)、Q5000蛋白核酸测定仪等。

参照文献[2-6]，根据GenBank中已有PKV (EU787450、KT892971、JX401523、KM977675)、PAstV (JX556692、KU764486、JX556693、JX556691)、PSaV (KT922089、FJ387164、KT922087、KF204570)、PDCoV (KJ769231、KR265865、KT021234、KX022605)、PToV (GU196786、JQ740195、FJ555569)、PTV (AF231767、AF296096、GU446660、JQ664746、AJ516011)、PSV (HQ875059、KJ821020、KJ821021) 全基因组序列，通过比较其保守区域，利用Oligo7.37软件分别针对PTV 3D基因、PKV 3D基因、PDCoV M基因、PSV 5′UTR基因、PSaV ORF1基因、PAstV ORF2基因、PToV S基因设计7对特异性检测引物(表 1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

采集的粪便溶于适量PBS中，反复冻融2次，12 000 r/min离心2 min，吸取250 μL上层样品进行总RNA的提取，并反转录成cDNA。

以cDNA为模板，分别利用相对应的病原检测引物进行单一RT-PCR扩增，并克隆各目的片段，测序鉴定，制备阳性质粒模板。

进一步将7种分别含有特定病原基因片段的质粒的混合物作为模板，进行多重RT-PCR反应条件的优化，包括最佳退火温度、引物浓度、多重RT-PCR特异性和灵敏性等。

用建立的多重RT-PCR方法对临床419份腹泻样品进行检测。

参照文献[16]，合成8对PKV全基因组扩增引物，选取3例阳性样本分别进行基因组序列的测定，得到3株PKV全基因组。其中5′末端序列利用5′ RACE kit测定。每个片段送样3份，由生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

应用Lasergene分析软件对各测定片段进行拼接，获得PKV全基因组序列并进行分析，利用MEGA6.0软件制作进化树分析其亲缘性。

分别利用7种腹泻病原的检测引物，对临床采集样品进行检测，获得扩增出阳性目的片段的样品(图 1)。进一步回收各目的片段，利用pEASY-T1 Simple Cloning Kit进行“TA”连接，然后转化DH5α。通过菌液PCR方法鉴定，获得疑似阳性质粒pEASY-PTV/3D、pEASY-PKV/3D、pEASY-PDCoV/M、pEASY-PSV/5′UTR、pEASY-PSaV/ORF1、pEASY-PAstV/ ORF2、pEASY-PToV/S。测序证实，各片段均与相应的腹泻病原序列吻合，获得正确的阳性质粒。

图 1 猪7种病毒性腹泻病原的目的片段扩增 Figure 1 Specific fragments amplification of the seven porcine diarrhea-associated viruses. M: 100 bp DNA marker; 1: PTV 3D fragment; 2: PAstV ORF2 fragment; 3: PKV 3D fragment; 4: PSaV ORF1 fragment; 5: PToV S fragment; 6: PDCoV M fragment; 7: PSV 5′UTR fragment.

图选项

将7种阳性质粒模板逐渐增加，依次进行多重RT-PCR扩增，最终建立了7重RT-PCR方法(图 2)，7个目的片段大小依次为624 bp、504 bp、421 bp、340 bp、280 bp、249 bp和176 bp，大小正确，条带特异。进一步优化退火温度，如图 3所示，退火温度为52 ℃、55 ℃、58 ℃和61 ℃时，7重PCR均能扩增成功；其中，当退火温度为58 ℃时，PCR扩增条带最清晰。

图 2 多重RT-PCR的建立 Figure 2 Development of the multiplex RT-PCR. M: 100 bp DNA marker; 1: multiplex RT-PCR for PTV and PSV; 2: multiplex PCR for PTV, PDCoV and PSV; 3: multiplex RT-PCR for PTV, PToV, PDCoV and PSV; 4: multiplex RT-PCR for PTV, PSaV, PToV, PDCoV and PSV; 5: multiplex RT-PCR for PTV, PKV, PSaV, PToV, PDCoV and PSV; 6: multiplex RT-PCR for PTV, PAstV, PKV, PSaV, PToV, PDCoV and PSV; M: marker.

图选项

图 3 多重RT-PCR的退火温度筛选 Figure 3 Temperature screening of the multiplex RT-PCR. 1-4: Tm 52 ℃, 55 ℃, 58 ℃ and 61 ℃; M: marker.

图选项

用建立的多重RT-PCR方法检测PEDV、TGEV、CSFV、BVDV、SIV，结果如图 4所示，没有扩增出片段；而以含有PTV、PKV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV、PToV特异性目的片段的阳性质粒为模板进行多重RT-PCR，扩增出了7条特异的目的片段；证实该方法特异性较好(图 4)。

图 4 多重RT-PCR特异性和灵敏性鉴定 Figure 4 Specificity and sensitivity of the multiplex RT-PCR. M: 100 bp DNA ladder; 1: multiplex RT-PCR used PTV, PKV, PDCoV, PSV, PSaV, PAstV and PToV as the templates; 2: multiplex RT-PCR used PEDV as the template; 3: multiplex RT-PCR used TGEV as the template; 4: multiplex RT-PCR used BVDV as the template; 5: multiplex RT-PCR used CSFV as the template; 6: multiplex RT-PCR used SIV as the template; 7−12: sensitivity detection of the multiplex RT-PCR with the plasmids of 10−1−10−6.

图选项

分别以7个阳性质粒模板10倍倍比稀释后，进行多重PCR，检测其灵敏性。结果发现，当质粒稀释至10^-5倍时，多重PCR条带很浅。因此，我们判定该多重PCR方法可检测PTV、PKV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV和PToV的质粒最低检测限量分别为5.0×10⁴、5.5×10⁴、6.0×10⁴、6.0×10⁴、3.8×10⁴、6.1×10⁴和6.9×10⁴copies/μL，对应的最低核酸检测浓度分别为0.32、0.36、0.41、0.41、0.18、0.39和0.43 μg/L (图 4)。

应用多重RT-PCR对同一阳性模板进行检测，5次试验检测结果均一致，表明本方法的重复性较好。

利用建立的多重RT-PCR方法对上海地区采集的419份临床腹泻样品进行检测，结果见表 2，其中PKV的感染率最高，2015和2016年分别为26.98%和45.79%。2种以上病原混合感染率较高，其中PKV和其他病原的混合感染率达9.52% (2015年)、18.54% (2016年)。与用单一RT-PCR检测7种腹泻相关病原结果的符合率均为100%，表明该方法能够快速准确地筛检出这7种腹泻相关病原的混合感染病例。

选择来源于不同猪场的PKV阳性样品3例，进行PKV全基因组序列的测定，如图 5所示，共有11个目的片段，大小正确且特异。利用Lasergene和Cluster X软件拼接，获得3株PKV全基因组序列，分别编号为PD-PKV、JS-PKV和CM-PKV。PD-PKV、JS-PKV和CM-PKV全长分别为8 054 bp、8 053 bp和8 057 bp，均包含5′UTR、3′UTR和一个大的ORF。PD-PKV和JS-PKV编码一个2 459 aa的多聚蛋白，CM-PKV编码2 460 aa的多聚蛋白。

图 5 PKV全基因组PCR扩增 Figure 5 PCR amplification of the complete genomic sequence of PKV.

图选项

从GenBank中选取不同地区、年代、种属的嵴病毒全基因组序列，利用MEGA6.0软件构建全基因组进化树，具体参考毒株见表 3。结果发现(图 6)，JS-PKV、PD-PKV和JS-PKV均归属于猪嵴病毒，分别与中国北京株JS-2010a PDPKV、中国甘肃株K-4/2012/CH、中国江苏株JS-01-CHN/2013/China的亲缘性最近，与其他动物嵴病毒遗传距离较远。

图 6 PKV全基因组进化树分析 Figure 6 Phylogenetic tree based on the complete genomic sequences of PKV.

图选项

这3株PKV的全基因组序列同源性为88.1%−89.1% (图 7)，CM-PKV和中国株JS-02a-CHN/2013/China同源性最高(89.5%)，而JS-PKV和PD-PKV则与匈牙利株K-30-KUN/2008/HUN的同源性最高(89.6%)，说明近年来不同国家流行的猪嵴病毒之间存在着一定的相似性。

图 7 PKV全基因组序列的同源性比对 Figure 7 Identity analyzation of the complete genomic sequences of PKV.

图选项

VP1是PKV的主要结构蛋白，具有较大变异性。通过构建VP1基因的进化树(图 8)，我们发现虽然JS-PKV、PD-PKV和CM-PKV处于不同分支，但它们均与日本株的亲缘性最近；JS-PKV、CM-PKV分别与2007年日本报道的CMP03/07株、CMP17/07-THA株处于同一分支，而PD-PKV与2009年日本报道的T247/2009/JP株处于同一分支。说明本试验中的3株PKV很有可能是由日本株变异而来。

图 8 VP1基因的进化树分析 Figure 8 Phylogenetic tree based on the VP1 genes.

图选项

近年来，猪病毒性腹泻流行甚广，对引起腹泻病原的诊断、检测技术也有很多报道。特别是多病原检测方法研究较多。目前，关于PEDV、TGEV和PoRV等腹泻病原的多重RT-PCR方法较多^{[1, 17-21]}，且多是3重RT-PCR或4重RT-PCR。本研究首次建立了可同时检测7种猪病毒性腹泻病原的多重RT-PCR方法。该方法特异性较好，只可特异性扩增出PTV、PKV、PDCoV、PSV、PSaV、PAstV和PToV的条带，不会出现其他病毒性腹泻病原的交叉扩增现象；最低核酸检测浓度分别为0.32、0.36、0.41、0.18、0.39和0.43 μg/L，与已有多重RT-PCR方法^[22-26]相比，灵敏性较高。利用该方法对临床腹泻样品进行筛检，共检出PKV阳性样品180例、PTV和PDCoV阳性各25例、PToV阳性10例、PAstV阳性108例、PSV阳性75例；PKV和其他病原混合感染72例。测序证实PCR检测正确。说明本研究建立的7重RT-PCR方法可适用于临床大批量样品的筛查。

鉴于PKV的感染率较高，研究进一步选取了3个地区的PKV毒株进行全基因组序列测定。结果表明，JS-PKV、PD-PKV和CM-PKV的基因组构成符合PKV的基因组结构，依次分为5′ UTR、一个大的ORF和3′ UTR。除polyA尾巴外，它们的全基因组长度依次为8 053 bp、8 054 bp和8 057 bp；G+C百分含量依次为52.07%、52.04%和52.09%；A+T百分含量依次为47.93%、47.96%和47.91%。它们的全基因组同源性不高，仅达88.1%-89.1%，说明上海不同地区流行的PKV毒株之间存在着一定的变异。与参考毒株相比，JS-PKV和PD-PKV与匈牙利株K-30-KUN/2008/HUN的同源性最高，达89.6%；CM-PKV和中国株JS-02a-CHN/2013/China同源性最高，达89.5%。全基因组进化树表明，这3株PKV均与中国株的亲缘性最近；但VP1基因进化树表明，它们与日本株PKV的亲缘性最近。由此推测，近年来我国流行的PKV和日本株PKV之间有着一定的相似性，很有可能是从日本株变异而来。后续我们将开展这3株PKV的致病性及其在腹泻疾病中的作用研究。