中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 李焕, 于童, 马洋洋, 王华岩
- Li Huan, Yu Tong, Ma Yangyang, Wang Huayan
- 层粘连蛋白基因家族在猪多能干细胞中的表达谱分析
- Expression of Laminin gene family in porcine pluripotent stem cells
- 生物工程学报, 2017, 33(8): 1304-1314
- Chinese Journal of Biotechnology, 2017, 33(8): 1304-1314
- 10.13345/j.cjb.170101
-
文章历史
- Received: March 12, 2017
- Accepted: June 12, 2017
诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells,iPSCs,iPS细胞)可以分化为体内各种成体细胞,进而形成机体各种组织和器官[1]。因此,iPS细胞的研究不仅具有重要的理论意义,而且在组织再生、修复和疾病治疗方面具有广泛的价值。细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)是由细胞合成和分泌的生物大分子,具有支持和连接组织结构、调节组织的发生和细胞的生理活动等功能[2-3]。有研究表明,特定ECM形成的微环境可以支持iPS细胞的生长,培养体系中添加这类ECM对iPS细胞的生长和多能性维持具有关键作用[4]。此外,采用无饲养层培养体系,可以避免饲养层细胞带来的外源因素的干扰[2, 5]。目前,商品化的ECM包括Matrigel、层粘连蛋白、纤粘连蛋白、胶原等已经广泛应用到无饲养层培养体系中[6],部分已被验证有利于人和小鼠iPS细胞的获取和培养[7-8]。猪和人在生理和代谢上具有极高的相似性,是理想的可应用于疾病和再生医学研究的模式动物[9],因此,获得真正的猪iPS细胞将具有十分重要的意义。猪iPS细胞的获取和培养多参考人和小鼠相关体系,但获得的猪iPS细胞无法达到原始态(Naïve state)。因此,探索并发现适宜的培养体系对于获得完全重编程的猪iPSCs有重要意义。
层粘连蛋白家族(Laminin,LN)是一类参与形成组织细胞基底膜的重要大分子非胶原性糖蛋白,是ECM的重要组成部分[10]。完整的LN蛋白由3种肽链(α、β、γ)形成十字架样结构的异源三聚体,其中α链有5种亚型,β链有4种亚型,γ链有3种亚型,分别由不同的基因编码,发挥不同的功能。目前,通过对小鼠和人层粘连蛋白的研究已确定存在18种不同的LN组合[11-12]。LN蛋白可以改变细胞的表型,引导细胞向不同的方向分化[13],对于早期胚胎发生、各种组织的形成和功能的完善发挥重要作用[14-15]。其中,LAMA5作为在小鼠和人各组织中广泛表达的基因,与其他亚基的特定组合,如Laminin-511 (由LAMA5、LAMB1和LAMC1组成),可以作为支持人iPS细胞生长的关键基质[16-17],并且维持其不分化状态[18-19]。因此我们推测,恰当的LN组合也可以对猪iPS细胞的分离和建系发挥作用。然而,猪LAMA5的研究仍未见报道,甚至在NCBI和UCSC相关基因组数据库中也没有相关序列的注释。
为明确猪iPS细胞中LN的表达情况,我们对猪组织、细胞和建系iPS细胞中的LN表达进行了检测,展示了LN的时空表达情况。通过生物信息学分析和同源序列比对,确认了猪LAMA5基因的存在,克隆了猪LAMA5基因部分序列,并进行了测序鉴定。此外,我们还发现猪iPS特异表达的LAMB1基因存在可变剪接体(LAMB1-a)。本文初步揭示了猪LN基因表达特性,为优化猪iPS细胞培养体系和鉴定方法提供了新的依据。
1 材料与方法 1.1 菌种、载体和组织样品大肠杆菌Stellar感受态细胞由陕西省干细胞工程技术研究中心保存。pGEM-T Easy载体购自Promega公司。猪各组织样品采自动物试验站饲养的八眉黑猪30日龄保育猪。
1.2 试剂和耗材限制性内切酶、反转录试剂盒、T4 DNA连接酶、2×Taq MasterMix (Dye)购自CWBIO公司;总RNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA marker购自天根公司(北京);细胞培养基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium,DMEM)、非必需氨基酸、谷氨酰胺购自Invitrogen (美国);胎牛血清(FBS)购自Hyclone;PCR引物(表 1)由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。
Gene name | Primer name | Primer sequence (5′-3′) | Size (bp) | Reference sequences |
Laminin A1 | pc-LAMA1 | F-AGAACCTGTCACACGCTCAG R-CCAGACTCACGGTCACAGTC | 633 | XM_005658563.1 |
Laminin A2 | pc-LAMA2 | F-GCACTGCAGCACACAACTAC ATGCCTCACAAGACAAGCCA | 580 | XM_005659200.1 |
Laminin A3 | pc-LAMA3 | F-GGCCAGTTGGTCAGTTGTGA R-CCAAAGCCCTCTCGTTGTCT | 814 | XM_003482046.2 |
Laminin A4 | pc-LAMA4 | F-CGCTCTCTGTTTCCTGTCGT R-GCCTTCTGTACCAGCCCATT | 458 | XM_003121371.4 |
Laminin A5-1 | pc-LAMA5-1 | F-GTGCACTGCGAAGTGTGTGA R-TTGCGGCTGTTGAGTTCCT | 731 | KY622023 |
Laminin A5-2 | pc-LAMA5-2 | GGATGCACTGGAACAGCAAAC CTGGATGAAGCGATCCTGGTT | 839 | KY622023 |
Laminin B1 | pc-LAMB1 | F-AAAGGCGCCTCCCTAGGTT R-GCGGTTTGGAGCAAATGTGG | 505 | XM_005667736.1 |
Laminin B2 | pc-LAMB2 | F-TCTGCCAGGCTGTTTCAGAG R-TGTGTAGCCGTGTCAGGTTC | 647 | XM_005669535.1 |
Laminin B3 | pc-LAMB3 | F-CGAGCCTGTGACTGTGACTT R-CCCCCACAGAGCTTGTTGAT | 776 | XM_005656759.1 |
Laminin B4 | pc-LAMA1 | F-AGCCATGACACGTCACTCTG R-AACCTTTCGGGCTCCATCTG | 619 | XM_003482701.2 |
Laminin C1 | pc-LAMC1 | F-CCCTCCAGTGCAAAGACGAT R-CTCAGCCAAGTTTCCGGTCT | 422 | ENSSSCT00000016945 |
Laminin C2 | pc-LAMC2 | F-ATGCCCTTAGCAGCTGAACT R-ACACATCTTGATGGCGCTGT | 959 | XM_003130365.3 |
Laminin C3 | pc-LAMC3 | F-GTCCTGCGACCGATGTCA R-GACTCCAGAGAAGCGCGTAG | 746 | XM_003353687.3 |
beta-Actin | pc-ACTB | F-GTGCGGGACATCAAGGAGAA R-GTCACCTTCACCGTTCCAGT | 688 | XM_003124280.3 |
引物设计利用Primer Blast在线软件进行,以已知猪Laminin的RNA参考序列为模板(表 1),进行全转录组比对后得到的目标基因特异性引物序列。为方便扩增,引物的设计尽量使Tm值在60 ℃左右,引物序列长度设定为20 bp,最终通过试验筛选确认各基因引物。从成年猪睾丸、脑、肝、胃、心、肺组织、卵巢颗粒细胞,以及原代分离的脂肪细胞、肝脏细胞、成纤维细胞、猪iPS细胞和不同培养条件下的DOX-iPS细胞中提取总RNA,并反转录为cDNA,采用RT-PCR方法(94 ℃ 30 s;58 ℃ 30 s;72 ℃ 1 min;35个循环)检测LN的表达情况。
1.4 数据库搜索和生物信息学分析猪iPS细胞系piPS-g和猪胎儿成纤维细胞PEF的转录组数据均来自本实验室[20],猪早期胚胎转录组数据来自韩建永课题组之前发表的文章[21]。数据使用RPKM+1,并利用Excel制作柱状图呈现。为了确定猪LAMA5基因,选取人、牛和羊的已知LAMA5基因组序列作为预测模板,通过分析LAMA5上下游基因的排列顺序,将猪LAMA5基因定位于RPS21与CABLES2之间的序列区域。最终,通过GeneWise基因在线预测工具(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/genewise/)利用已知的人和牛的蛋白序列与猪RPS21和CABLES2基因之间的DNA序列进行逆向比对,从而对猪RPS21和CABLES2之间是否存在LAMA5基因进行预测。
1.5 猪LAMA5和LAMB1基因的克隆和鉴定根据预测到的两种猪LAMA5蛋白序列进行差异比对,跨差异区域进行猪LAMA5基因的引物设计,并分别命名为pc-LAMA5-1和pc-LAMA5-2 (表 1)。随后,以猪iPS细胞总RNA制备的cDNA为模板,利用引物pc-LAMA5-1、pc-LAMA5-2和pc-LAMB1进行RT-PCR扩增。将获得的目的片段克隆到pGME-T Easy载体并经酶切鉴定,确认酶切产物片段大小符合预期后,将质粒送往西安擎科生物技术有限公司测序。
1.6 细胞的获取和培养猪成纤维细胞(PEF)来源于新生仔猪耳部组织,用高糖DMEM培养基添加15% FBS进行培养;猪脂肪细胞来源于仔猪皮下脂肪组织,用DME/F12培养基添加10% FBS培养;猪肝脏细胞来源于仔猪肝脏组织,用高糖DMEM培养基添加10% FBS培养。猪iPS细胞系DOX-iPS细胞由本室诱导获得[22],使用高糖DMEM添加15% FBS培养,培养基中添加10 ng/mL bFGF、10 ng/mL LIF、10 ng/mL BMP4、3 μmol的CHIR99021、2 μmol的SB431542、0.1 mmol/L NEAA、2 mmol/L谷氨酰胺、0.1 mmol/L β-巯基乙醇,每天换液后以4 μg/mL添加新鲜配制的Doxycycline,3−4 d后进行胰酶消化传代。DOX-iPS分化细胞和二代DOX-iPS细胞的获得见之前研究[22]。猪多能干细胞系piPS (PS11) 由本实验室诱导获得[23],使用KnockOut-DMEM添加20% FBS、10 ng/mL bFGF、10 ng/mL LIF、0.1 mmol/L NEAA、2 mmol/L谷氨酰胺、0.1 mmol/L β-巯基乙醇,每天换液,每隔2−3 d胰酶消化传代。
2 结果与分析 2.1 LN基因在猪iPS细胞和早期胚胎中的转录情况通过分析猪iPS和PEF细胞的转录组数据[1],我们发现测序结果中缺少LAMA5和LAMC1的信息(图 1A)。对猪早期胚胎转录组数据的分析也发现,数据中缺少LAMA1、LAMA5和LAMB4的信息(图 1B),其原因是猪LN基因家族的注释尚不完全。对细胞转录组数据进行分析发现,成纤维细胞中转录较为活跃的LAMA4基因,在细胞重编程完成后有所下调;LAMB1和LAMB2在猪iPS细胞中也有所下调,但LAMB1在猪iPS细胞中仍占有主要地位,与人多能干细胞中LAMB1高表达的情况类似(图 1A)。对胚胎转录组数据进行分析发现,猪LN的表达在桑葚胚期前后存在明显的界限。在卵母细胞至8细胞时期,LAMB1、LAMC1和LAMC3呈现高表达,且随着发育过程逐渐减少,表明这3个基因可能为母源基因,在猪胚胎阻滞期之前发挥重要的发育调控作用。在桑葚胚时期,所有LN均呈现低表达情况,说明阻滞期过后,母源RNA利用殆尽。之后的囊胚期,LAMB1、LAMB3、LAMC1和LAMC3重新上调,预示这些基因作为早期合子激活基因,对胚胎进一步分化和发育发挥重要调控作用(图 1B)。
2.2 猪LAMA5基因序列的预测、鉴定和同源分析LAMA5基因在大多数物种中都有报道或注释,但是,UCSC和NCBI序列数据库中没有猪LAMA5相关序列和注释。以人(NM_005560.4)、牛(XM_019972687.1)、羊(XM_018057585.1) 的LAMA5基因RNA区段序列为模板,利用BLAST和BLAT对猪基因组整合序列(Sscrofa10.2) 进行比对,也未找到相似的序列(图 2A)。我们推测,猪LAMA5基因序列无法查找可能有两个原因:1) 猪基因组数据库(Sscrofa10.2) 的内容不够完整,而LAMA5的信息恰好位于缺失的序列当中;2) 猪在进化中发生了LAMA5基因的丢失。因此,我们选择牛第13号染色体上LAMA5基因组上游的SS18L1/LSM14B和下游的RPS21/CANLES2两对基因为位置参照,与猪基因组序列进行了比对。结果表明,猪17号染色体上有上述基因的相邻分布,且在SS18L1和RPS21之间有一段80 kb的序列中存在序列缺口(Gap)。
2016年12月6日,最新的猪基因组数据库(Sscrofa11.1) 更新并上传至NCBI网站的Assembly数据库。在猪17号染色体SS18L1和RPS21之间的序列增加至168 kb,且新序列中不再有序列缺口(图 2A)。利用GeneWise在线预测软件,将人LAMA5蛋白序列(XP_006723859.1) 与186 kb猪基因组序列进行逆向比对(GeneWise软件提供的逆翻译算法,可将蛋白序列逆翻译为可变RNA序列,并与提供的基因组DNA序列进行比对),预测到一段11 363 bp的同源mRNA序列,并将之命名为P1;与牛LAMA5蛋白序列(XP_014333141.1) 比对预测到一段11 750 bp的同源mRNA序列,将之命名为P2。将P1和P2序列进行同源性比对,两者之间存在3个差异区段。将跨P1、P2间最大的差异区段进行引物设计(图 2B),经RT-PCR扩增并进行电泳检测,获得了731 bp的F-1和839 bp的F-2条带(图 2C)。克隆F-1片段进行DNA测序,与预测序列P2相符。据此,将获得的LAMA5基因序列提交GenBank数据库(Accession No. KY622023)。
2.3 猪LN在组织和细胞中表达情况分析采用RT-PCR检测LN在猪各种组织(图 3A)中的表达情况发现,LN在不同组织细胞中具有不同的表达水平,其中LAMA5和LAMC1在各组织中广泛表达,LAMA1在脑、卵巢和睾丸中高表达;LAMA2在肝组织中未见表达;LAMA3在肺、脑中高表达。LAMA4在卵巢颗粒细胞组织未见表达。LAMB1在心脏未见表达。LAMC2仅在脑和卵巢颗粒细胞有表达。LAMC3在脑和睾丸中有表达。RT-PCR检测细胞中LN的表达和细胞(图 3B-C)。相较于组织,细胞LN的表达更加特异,在肝细胞中只有LAMA5、LAMB3和LAMC1表达。脂肪细胞和PEF中LAMA4、LAMA5、LAMB1、LAMB2和LAMC1高表达。检测中还发现LAMB1只在多能细胞猪iPS中出现两条特异性条带。
2.4 LAMB1-a的克隆和在多能干细胞中特异性表达在对LAMB1的检测中,使用引物pc-LAMB1在除心、胃组织外均检测到符合预期的单一条带(图 3A)。然而在猪iPS细胞中,则检测到两个条带(图 3C)。分别回收两个条带,并经克隆测序和同源比对验证,505 bp条带与GenBank数据库中的LAMB1-X1 (XM_003130269.4) 序列只有1个碱基差异。新条带为639 bp,但与GenBank数据库中的LAMB1-X1和LAMB1-X2 (XM_005667736.2) 均不相同但具备较高的同源性,因此确认639 bp的产物为LAMB1一个新的可变剪切体,并将其命名为LAMB1-a (图 4A)。为进一步验证LAMB1-a表达的特异性,对猪PEF、DOX-iPS细胞,以及分化3 d (-DOX/3D)、5 d (-DOX/5D)和二代DOX-iPS(2nd+DOX)等细胞进行了检测(图 4B)。结果表明,PEF细胞中只表达LAMB1,而对猪iPS细胞中LAMB1的扩增则能同时检测到LAMB1和LAMB1-a (图 4C)。在对分化过程中的DOX-iPS细胞进行LAMB1表达检测中,我们还发现,随着猪iPS的分化,克隆形态逐渐消失,LAMB1-a的表达也逐渐降低直至检测不到(图 4B-C)。对分化的DOX-iPS细胞恢复DOX-iPS培养条件,并添加Doxycycline进行连续传代后,DOX-iPS的克隆形态逐渐恢复,同时LAMB1-a再度表达(图 4B-C)。这表明,LAMB1-a与猪iPS细胞的重编程程度存在明确的相关性。
3 讨论在对小鼠的研究中,研究人员发现随着机体的发育,不同的组织和细胞中LN基因的表达具有不同的时空特性,从而产生不同的LN蛋白组合来行使不同的作用[24]。本研究通过检测猪组织和细胞中LN的表达情况证明,在不同组织和细胞中LN的表达均有各自的特征。这些结果表明,LN作为重要的细胞外基质存在于猪的整个生命周期和各种组织当中,并有可能参与不同的信号调控,对猪的生长发育产生不同的影响。
卵母细胞发育过程中,母源mRNA的积累和编码的蛋白不仅可以支持卵母细胞到胚胎的发育,还在合子基因的激活中发挥重要作用,促使胚胎进一步发育[25-26]。Elis等[25]发现,LAMB1和LAMC1在小鼠早期胚胎发育阶段就可以检测到,这与猪早期胚胎中LAMB1和LAMC1的表达谱相一致。这些基因随着胚胎的发育表达量逐渐减少,到桑葚胚期出现表达量极低的现象。这些基因表达量的下降可能与合子基因未被激活,母源mRNA的消耗、稀释和降解有关。到囊胚阶段LAMB1、LAMB3、LAMC1和LAMC3表达量再次升高,则说明其可能作为早期的合子激活基因,在随后的胚胎发育中具有重要作用。
Domogatskaya等报道,Laminin-511可以使鼠胚胎干细胞在无饲养层条件下保持不分化状态达169 d以上[27]。此外Rodin等通过将Laminin-511添加到培养基中,培养人ES和人iPS细胞,其多能性维持良好,并呈单层分布生长[16, 28]。可见Laminin-511对人和小鼠多能干细胞多能性的维持具有促进作用。然而,在本文发表之前,NCBI等数据库中并没有猪LAMA5基因相关信息,本研究通过分析最新猪基因组序列数据包(Assembly: Sscrofa11.1),确认了猪LAMA5基因的存在。同时在检测中发现,猪iPS细胞中也高水平地表达Laminin-511组合,为后续研究猪Laminin-511是否有利于猪多能性的维持提供了基本条件。
本研究在对猪iPS细胞LN表达情况的检测过程中,还发现LAMB1基因在猪多能细胞中出现两条特异性条带,经过对测序结果的分析,认定长度为639 bp的条带是LMAB1的可变剪接体LAMB1-a形式,该剪接体的表达水平与猪iPS细胞的多能性以及重编程程度呈正相关。这一发现在小鼠、人和其他物种中均未见报道,因此,这可能是猪多能干细胞与其他物种多能干细胞的一个重要区别,为猪多能干细胞的研究提供了新的研究方向。
[1] | Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse fibroblasts by four transcription factors. Cell Prolif, 2008, 41 Suppl 1: 51–56. |
[2] | Tsai ZY, Singh S, Yu SL, et al. A feeder-free culture using autogeneic conditioned medium for undifferentiated growth of human embryonic stem cells: comparative expression profiles of mRNAs, microRNAs and proteins among different feeders and conditioned media. BMC Cell Biol, 2010, 11: 76. DOI: 10.1186/1471-2121-11-76 |
[3] | Aryantini NPD, Kondoh D, Nishiyama K, et al. Anchorless cell surface proteins function as laminin-binding adhesins in Lactobacillus rhamnosus FSMM22. FEMS Microbiol Lett, 2017, 364(6): 42–48. |
[4] | Wu CC, Li YS, Haga JH, et al. Directional shear flow and Rho activation prevent the endothelial cell apoptosis induced by micropatterned anisotropic geometry. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(4): 1254–1259. DOI: 10.1073/pnas.0609806104 |
[5] | Hansel MC, Gramignoli R, Blake W, et al. Increased reprogramming of human fetal hepatocytes compared with adult hepatocytes in feeder-free conditions. Cell Transplant, 2014, 23(1): 27–38. DOI: 10.3727/096368912X662453 |
[6] | Hu ZX, Li TQ, Zhang XZ, et al. Hepatocyte growth factor enhances the generation of high-purity oligodendrocytes from human embryonic stem cells. Differentiation, 2009, 78(2/3): 177–184. |
[7] | Ingber DE. Mechanical control of tissue morphogenesis during embryological development. Int J Dev Biol, 2006, 50(2/3): 255–266. |
[8] | Lee M, Kim Y, Ryu JH, et al. Long-term, feeder-free maintenance of human embryonic stem cells by mussel-inspired adhesive heparin and collagen type Ⅰ. Acta Biomater, 2016, 32: 138–148. DOI: 10.1016/j.actbio.2016.01.008 |
[9] | Okita K, Ichisaka T, Yamanaka S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature, 2007, 448(7151): 313–317. DOI: 10.1038/nature05934 |
[10] | Theocharis AD, Skandalis SS, Gialeli C, et al. Extracellular matrix structure. Adv Drug Deliv Rev, 2016, 97: 4–27. DOI: 10.1016/j.addr.2015.11.001 |
[11] | Aumailley M, Bruckner-Tuderman L, Carter WG, et al. A simplified laminin nomenclature. Matrix Biol, 2005, 24(5): 326–332. DOI: 10.1016/j.matbio.2005.05.006 |
[12] | Zarinfard G, Tadjalli M, Razavi S, et al. Effect of laminin on neurotrophic factors expression in Schwann-like cells induced from human adipose-derived stem cells in vitro. J Mol Neurosci, 2016, 60(4): 465–473. DOI: 10.1007/s12031-016-0808-6 |
[13] | Yamashita K, Hitoi A, Matsuda Y, et al. Structural studies of the carbohydrate moieties of rat kidney γ-glutamyltranspeptidase. An extremely heterogeneous pattern enriched with nonreducing terminal N-acetylglucosamine residues. J Biol Chem, 1983, 258(2): 1098–1107. |
[14] | Vuoristo S, Virtanen I, Takkunen M, et al. Laminin isoforms in human embryonic stem cells: synthesis, receptor usage and growth support. J Cell Mol Med, 2009, 13(8B): 2622–2633. DOI: 10.1111/j.1582-4934.2008.00643.x |
[15] | Camacho A, Núñez N, Dekomien G, et al. LAMA2-related congenital muscular dystrophy complicated by West syndrome. Eur J Paediatr Neurol, 2015, 19(2): 243–247. DOI: 10.1016/j.ejpn.2014.11.005 |
[16] | Rodin S, Domogatskaya A, Ström S, et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol, 2010, 28(6): 611–615. DOI: 10.1038/nbt.1620 |
[17] | Miyazaki T, Futaki S, Suemori H, et al. Laminin E8 fragments support efficient adhesion and expansion of dissociated human pluripotent stem cells. Nat Commun, 2012, 3: 1236. DOI: 10.1038/ncomms2231 |
[18] | Gao J, DeRouen MC, Chen CH, et al. Laminin-511 is an epithelial message promoting dermal papilla development and function during early hair morphogenesis. Genes Dev, 2008, 22(15): 2111–2124. DOI: 10.1101/gad.1689908 |
[19] | Rajala K, Hakala H, Panula S, et al. Testing of nine different xeno-free culture media for human embryonic stem cell cultures. Hum Reprod, 2007, 22(5): 1231–1238. DOI: 10.1093/humrep/del523 |
[20] | Zhang SQ, Guo YJ, Cui Y, et al. Generation of intermediate porcine iPS cells under culture condition favorable for mesenchymal-to-epithelial transition. Stem Cell Rev, 2015, 11(1): 24–38. DOI: 10.1007/s12015-014-9552-x |
[21] | Cao SY, Han JY, Wu J, et al. Specific gene-regulation networks during the pre-implantation development of the pig embryo as revealed by deep sequencing. BMC Genomics, 2014, 15: 4. DOI: 10.1186/1471-2164-15-4 |
[22] |
Duan AQ, Wang N, Yu T, et al. A porcine (Sus scrofa domesticus) somatic cell line of tetracycline operator(TetO)-inducible system for reprogramming.
J Agric Biotechnol, 2014, 22(9): 1065–1073.
(in Chinese). 段安琴, 王宁, 于童, 等. 四环素调控基因(TetO)诱导重编程的猪体细胞系建立. 农业生物技术学报, 2014, 22(9): 1065-1073. |
[23] | Cheng D, Guo YJ, Li ZZ, et al. Porcine induced pluripotent stem cells require LIF and maintain their developmental potential in early stage of embryos. PLoS ONE, 2012, 7(12): e51778. DOI: 10.1371/journal.pone.0051778 |
[24] | Indyk JA, Chen ZL, Tsirka SE, et al. Laminin chain expression suggests that laminin-10 is a major isoform in the mouse hippocampus and is degraded by the tissue plasminogen activator/ plasmin protease cascade during excitotoxic injury. Neuroscience, 2003, 116(2): 359–371. DOI: 10.1016/S0306-4522(02)00704-2 |
[25] | Elis S, Batellier F, Couty I, et al. Search for the genes involved in oocyte maturation and early embryo development in the hen. BMC Genomics, 2008, 9: 110. DOI: 10.1186/1471-2164-9-110 |
[26] | Wang H, Luo X, Leighton J. Extracellular matrix and integrins in embryonic stem cell differentiation. Biochem Insights, 2015, 8(Suppl2): 15–21. |
[27] | Domogatskaya A, Rodin S, Boutaud A, et al. Laminin-511 but not -332, -111, or -411 enables mouse embryonic stem cell self-renewal in vitro. Stem Cells, 2008, 26(11): 2800–2809. DOI: 10.1634/stemcells.2007-0389 |
[28] | Okumura N, Kakutani K, Numata R, et al. Laminin-511 and -521 enable efficient in vitro expansion of human corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2015, 56(5): 2933–2942. DOI: 10.1167/iovs.14-15163 |