猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)属于圆环病毒科，无囊膜，直径约12-23 nm，具有大约1.7 kb的单链环状DNA基因组^[1]，是猪圆环病毒相关疾病(PCV2-associated disease, PCVAD)的主要病原体，给养猪业造成了巨大的经济损失^[2-5]。

PCV2的cap基因编码衣壳蛋白Cap，作为PCV2唯一的结构蛋白及主要的免疫原性蛋白，Cap蛋白在病毒入侵及致病性方面发挥重要作用^[6-8]。PCV2的rep基因编码两个病毒复制相关蛋白Rep和Rep′，Rep和Rep′能够与位于基因间区复制起点(ori)内的特定序列结合，启动PCV2复制^[9-12]。PCV2 rep基因启动子区存在一个类干扰素刺激反应元件(Interferon-stimulated response element，ISRE)，这个类ISRE作为一个转录因子结合位点(Transcription factor binding sites，TFBS)，可以促进rep基因转录及病毒增殖^[13]，本研究旨在探究PCV2 rep基因启动子是否具有利用类ISRE等TFBSs调控自身基因转录的生物学特性，并鉴定参与这一调控过程的宿主蛋白。

研究表明，某些病毒的基因启动子可以与宿主转录因子结合，通过调控病毒基因的启动子活性而调节自身基因的转录及翻译。如单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus type 1，HSV-1)、人乳头瘤病毒(Human papillomavirus，HPV)的启动子均具有利用宿主转录因子调节启动子活性的功能。本研究通过分析发现，PCV2 rep基因启动子上除了拥有一个已知的类ISRE，还存在其他一些潜在的TFBSs，这些TFBSs是否具有生物学功能？何种宿主蛋白可与之结合并调控基因转录？

本研究通过DNA-pull down联合液相-串联质谱分析(Liquid chromatography-tandem mass spectrometric，LC-MS/MS)等试验鉴定出猪源转录因子AP-2δ (Porcine transcription factor AP-2δ，poTFAP2δ)可以在体外与rep基因启动子结合。据报道，TFAP2家族蛋白具有与病毒基因启动子结合并调控启动子活性的功能，如TFAP2能与EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)及人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)等病毒的启动子结合，调控病毒基因的表达^[14-16]。本研究通过一系列试验证明，poTFAP2δ不仅能够显著增强PCV2 rep基因启动子活性及rep/cap基因的转录和翻译，还能在一定程度上促进PCV2的病毒滴度。

1 材料与方法 1.1 细胞和病毒

无PCV污染的猪肾细胞系(Porcine kidney epithelial cell line，PK15)由本实验室保存，在含有8%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。PCV2 HZ0201毒株(GenBank登录号：AY188355)为本实验室分离保存，病毒毒价为10^6.4 TCID₅₀/0.1 mL。

1.2 主要试剂及载体

双荧光素酶报告系统质粒pGL3-Basic (Basic)和pRL-TK均购自Promega公司；真核表达载体pCMV-N-Myc (Myc-Empty Vector, Myc-EV)由本实验室保存；RPMI-1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自Biological Industries公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒、细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒均购自碧云天公司；限制性内切酶购自New England BioLabs公司；蛋白Marker、EMSA化学发光试剂盒、尼龙膜均购自Thermo Fisher Scientific公司；0.22 μm无菌滤器购自Millipore公司；DNA胶纯化试剂盒购自Axygen公司；质粒小提试剂盒购自Tiangen公司；荧光定量PCR试剂(SYBR Green Master Mix)、一步克隆法试剂盒(Clonexpress Ⅱ one step cloning kit)、增强型ECL化学发光检测试剂盒均购自诺唯赞公司；转染试剂Lipofectamine 3 000及链霉亲和素磁珠均购自Invitrogen公司；鼠抗Myc单抗购自Biolegend公司；兔抗β-actin单抗购自杭州华安生物技术有限公司；鼠抗Rep单抗(2E11)及鼠抗Cap单抗(5E11)为本实验室制备并保存；HRP标记羊抗鼠IgG、HRP标记羊抗兔IgG、FITC标记羊抗鼠IgG均购自KPL公司。

1.3 rep基因启动子区潜在TFBSs预测及分析

PCV2 rep基因启动子位于rep基因的上游，从–193 nt至ori，共193 bp (图 1)。本研究用在线数据库JASPAR (http://jaspar.genereg.net/)对PCV2 rep基因启动子进行潜在TFBSs的预测，对预测分值较高(score > 10)的位点进行后续分析。

1.4 凝胶迁移实验(Electrophoretic mobility shift assay, EMSA)验证rep基因启动子的核蛋白结合活性

根据rep基因启动子潜在TFBSs预测及分析结果，本研究设计了用于EMSA试验的互补生物素标记的单链核酸探针p119biotin-s和p119biotin-a (表 1)及未标记的竞争探针并委托金斯瑞生物科技有限公司进行合成。p119biotin-s和p119biotin-a为5'端生物素标记的长度为119 nt (–133 nt至–15 nt，图 1)的互补单链核苷酸序列，包含EGR、SP、KLF、ZNF、YY、TFAP2、XBP、Crem、Atf、IRF等主要潜在TFBSs，竞争探针为没有生物素标记的同序列单链探针。单链探针进行退火操作后可获得用于EMSA试验的双链生物素标记探针p119biotin及竞争探针p119。

细胞核蛋白抽提按细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒操作说明进行，将PK15细胞接种于25 cm²细胞瓶，常规培养至细胞密度约为90%，从3×10⁶个PK15细胞中抽提细胞核蛋白用于EMSA试验。EMSA试验按照EMSA化学发光试剂盒操作说明进行，反应体系如下：p119biotin (1×10⁴ fmol/L)，2 μL，10×结合缓冲液2 μL，细胞核蛋白提取物4 μL，p193 (1×10³ pmol/L)，4 μL。

1.5 DNA-pull down联合LC-MS/MS鉴定结合蛋白

为了探索能与PCV2 rep基因启动子结合的宿主转录因子，本研究采用DNA-pull down联合LC-MS/MS技术进行鉴定。具体步骤如下：将5 μg p119biotin与500 μg PK15细胞核蛋白提取物室温孵育30 min，加入链霉亲和素标记的磁珠充分混匀，4 ℃翻转过夜，利用磁力架反复清洗3次，最后将沉淀进行LC-MS/MS蛋白鉴定(上海博苑生物科技有限公司)。

1.6 重组质粒的构建

poTFAP2δ基因根据NCBI数据库中的预测序列(GenBank登录号：XM_003356639)委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因合成，并利用一步克隆法构建真核表达载体pCMV-N-Myc-poTFAP2δ (Myc-poTFAP2δ)。PCV2 rep基因启动子测试载体pGL3-Basic-p193 (p193)由本实验室保存。

1.7 双荧光素酶报告基因试验

PK15细胞接种于24孔细胞板，常规培养24 h至细胞密度约为75%，用Lipofectamine 3000将Basic/pRL-TK、p193/pRL-TK分别与Myc-EV和Myc-poTFAP2δ共转染PK15细胞，转染24 h后依据双荧光素酶检测试剂盒说明书进行相对荧光素酶活性检测，分析poTFAP2δ对rep基因启动子活性的影响。

1.8 实时荧光定量PCR (Quantitative real-time PCR, qPCR)

将PK15细胞接种于12孔板，常规培养24 h至细胞密度约为75%，用Lipofectamine 3000将Myc-EV和Myc-poTFAP2δ分别转染PK15细胞，转染24 h后，以感染复数(Multiplicity of infection, MOI) =1的PCV2 HZ0201毒株感染该细胞，在感染后24、48、72 h收取细胞，trizol法抽提病毒RNA，取10 ng进行反转录得病毒cDNA，用qPCR (SYBR法)检测rep、cap的mRNA水平。qPCR引物如表 1所示，两步法qPCR反应程序按SYBR Green Master Mix使用说明书进行。

1.9 免疫印迹试验(Western blotting, WB)

将Myc-EV和Myc-poTFAP2δ在PK15细胞上瞬时过表达后接种PCV2 HZ0201 (MOI=1)，方法如1.8所述，病毒感染24、48、72 h后收集细胞，裂解蛋白样品后WB检测Rep及Cap的蛋白表达水平。WB所用一抗分别为鼠抗Myc单抗(1:1 000)、兔抗β-actin单抗(1:1 000)、鼠抗Rep单抗2E11 (1:500)和鼠抗Cap单抗5E11 (1:500)，二抗分别为HRP标记羊抗鼠IgG (1:7 500)和HRP标记羊抗兔IgG (1:7 500)。最后加入ECL显色液用Amersham Imager 600超敏多功能成像仪显色，用ImageJ软件进行灰度值分析，计算Rep和Cap对β-actin的比率。

1.10 间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescent assay, IFA)测定PCV2病毒滴度

将Myc-EV和Myc-poTFAP2δ在PK15细胞上瞬时过表达后接种PCV2 HZ0201 (MOI=1)，方法如1.8所述，在感染后24、48、72 h收取板子，反复冻融3次后收集病毒样品，4 ℃、12 000 r/min离心10 min后收取上清，利用IFA测定样品中病毒的半数组织培养感染量(Median tissue culture infectious dose, TCID₅₀)。IFA所用一抗为鼠抗Cap单抗5E11 (1:500)，二抗为FITC标记羊抗鼠IgG (1:350)。最后，用Reed-Muench方法计算各样品中PCV2的TCID₅₀。

2 结果与分析 2.1 PCV2 rep基因启动子上存在多个潜在的TFBSs

为了探究PCV2 rep基因启动子是否具有利用宿主转录因子促进自身启动子活性的功能，本研究利用JASPAR数据库对rep基因启动子进行潜在TFBSs的预测分析，结果发现，该启动子上存在多处潜在的TFBSs，如图 1所示，评分较高(score > 10)的有EGR、SP、KLF、ZNF、YY、TFAP、XBP、Crem、Atf、IRF等TFBSs，这些位点集中在rep基因启动子的中间位置(–133 nt至–15 nt, 119 bp)，所以推测这段序列是rep基因启动子的转录因子结合核心区域。

2.2 PCV2 rep基因启动子具有核蛋白结合活性

根据潜在TFBSs的预测结果，将rep基因启动子的关键序列119 bp合成标记探针p119biotin及竞争探针p119，利用EMSA验证rep基因启动子的核蛋白结合活性。结果如图 2所示，当标记探针中加入PK15细胞核蛋白提取物时，p119biotin出现了明显的迁移条带，说明PK15细胞核蛋白提取物中存在与p119biotin结合的宿主蛋白；但是，当加入竞争探针p119时迁移条带消失，说明这种蛋白与探针的结合具有高度特异性。

2.3 poTFAP2δ可以与PCV2 rep基因启动子结合

为了探究何种核蛋白可以与PCV2 rep基因启动子结合，本研究以p119biotin为探针进行DNA-pull down联合LC-MS/MS试验，将DNA- pull down后能与p119biotin结合的细胞核蛋白进行LC-MS/MS分析，质谱鉴定结果显示，与rep基因启动子序列结合的蛋白中有poTFAP2δ，这个发现与rep基因启动子的潜在TFBSs预测结果相吻合，所以推测poTFAP2δ可能在rep基因的转录启动方面发挥重要作用。

2.4 poTFAP2δ对PCV2 rep基因启动子的活性具有促进作用

为了探究poTFAP2δ是否可以特异性增强rep基因启动子活性，本研究比较了rep基因启动子在poTFAP2δ瞬时过表达及对照PK15细胞中的启动子活性差异。结果如图 3所示，在poTFAP2δ瞬时过表达的PK15细胞中，p193的平均相对荧光素酶活性为16.95，而其在对照PK15细胞中的平均相对荧光素酶活性仅为7.732，差异显著，这个结果充分证明poTFAP2δ对rep基因启动子活性具有显著的促进作用。

2.5 poTFAP2δ对PCV2 rep、cap基因的转录及翻译具有促进作用

poTFAP2δ可以促进rep基因的启动子活性，那么是否也能促进rep基因的转录和翻译，从而进一步促进cap基因的转录及翻译？为了探究这个问题，试验将PCV2分别接种poTFAP2δ瞬时过表达及对照PK15细胞，感染24、48、72 h后检测rep、cap基因mRNA及蛋白表达水平的差异。结果如图 4所示，在poTFAP2δ瞬时过表达的PK15细胞中，PCV2 rep mRNA的平均表达水平在病毒感染后24、48、72 h分别是对照组的2.133、1.587、2.444倍，而PCV2 cap mRNA的平均表达水平在病毒感染后24、48、72 h分别是对照组的2.196、1.993、1.811倍。不论在病毒感染后24、48 h还是72 h，poTFAP2δ过表达后病毒基因mRNA水平均显著上调，说明在PCV2感染过程中poTFAP2δ可以持续显著促进rep及cap基因的转录。

poTFAP2δ是否能进一步促进Rep及Cap蛋白的表达？结果如图 5所示，将WB试验所检测的Rep、Cap蛋白与β-actin蛋白条带进行灰度值比值分析，发现在poTFAP2δ瞬时过表达的PK15细胞中，PCV2 Rep蛋白的平均相对表达水平在病毒感染后24、48、72 h分别为0.295、1.858、3.985，而对照组为0.183、1.144、2.361，说明在PCV2感染后24、48、72 h，poTFAP2δ过表达均能上调Rep蛋白的表达量，虽然感染后24、48 h上调不显著，但是72 h上调极显著；同样的，在poTFAP2δ瞬时过表达的PK15细胞中，PCV2 Cap蛋白的平均相对表达水平在病毒感染后24、48、72 h分别是0.520、1.390、2.790，而对照组为0.512、0.883、1.997，说明在PCV2感染后24、48、72 h，poTFAP2δ过表达均能上调Cap蛋白的表达量，虽然感染后24 h上调不显著，但48 h上调显著，72 h上调极显著。这两组试验结果说明poTFAP2δ过表达能在PCV2感染的整个过程中持续促进Rep及Cap蛋白的表达，且这种促进作用随着感染进程的推进而增强。依据以上实验结果推测，在PCV2感染过程中，poTFAP2δ不仅可以促进rep基因的转录及翻译，而且能通过促进Rep蛋白的表达进一步促进PCV2 cap基因的转录及翻译。

2.6 poTFAP2δ对PCV2病毒增殖具有一定的促进作用

为了确认poTFAP2δ是否可以增加PCV2病毒滴度，本研究利用IFA对PCV2在poTFAP2δ瞬时过表达及对照PK15细胞上的TCID₅₀进行测定，结果如图 6所示。在对照PK15细胞上，PCV2感染后24、48、72 h的平均滴度为10^3.250/0.1 mL、10^3.667/0.1 mL、10^4.333/0.1 mL，而在poTFAP2δ瞬时过表达PK15细胞中则为10^3.417/0.1 mL、10^4.000/0.1 mL、10^4.917/0.1 mL。瞬时过表达组与对照组PCV2在感染后24、48、72 h的病毒滴度比值分别为1.469、2.153和3.837。虽然t检验分析显示，poTFAP2δ瞬时过表达组与对照组的差异并不显著，但是滴度比值显示，poTFAP2δ对PCV2的滴度还是具有一定的促进作用，说明poTFAP2δ可以在一定程度上促进PCV2的增殖。

3 讨论

作为严格的细胞内寄生微生物，病毒利用宿主蛋白调控自身增殖是许多病毒的普遍生存法则。在自然界中，病毒利用宿主转录因子调控自身基因启动子活性，从而调节病毒基因转录及翻译的情况并不罕见，如HIV-1基因组5'末端的长末端重复序列(Long terminal repeat, LTR)，作为启动子，LTR可以借助NF-κB、SP及TATA盒等TFBSs与宿主转录因子结合调控自身的基因转录^[17-18]；HSV-1的LAT启动子，可以与宿主细胞的信号转导及转录激活因子结合，调控病毒启动子活性^[19]；HPV的E6/E7基因启动子P97，可以与细胞因子YY1结合而下调自身基因转录活性^[20]；恒河猴疱疹病毒(Rhesus rhadinovirus, RRV)的复制和反式激活子(Replication and transactivator, Rta)的启动子，可以与宿主Sp蛋白结合，启动Rta的转录翻译，实现RRV的潜伏感染^[21]。

PCV2作为最小的动物病毒之一，基因组仅为1.7 kb，表达的蛋白非常有限，为了更好地生存，它是否也存在利用宿主蛋白调控自身增殖的复制机制？前期研究发现，PCV2 rep基因启动子区存在一个类ISRE，与PCV2 rep基因启动子的活性、病毒的复制增殖及干扰素促进PCV2增殖的功能均相关，但具体机制还未得到阐释。PCV2 rep基因启动子是否能像HIV-1 LTR等病毒启动子一样存在一系列TFBSs，通过与宿主转录因子的结合调控病毒基因转录，从而突破自身编码蛋白有限的困境？

本研究通过在线数据库对PCV2 rep基因启动子区进行潜在TFBSs的预测，结果显示，这个启动子上除了有类ISRE，还存在诸如EGR、SP、KLF、TFAP2等一系列TFBSs，这些位点均集中在启动子中部的119 bp (–133 nt至–15 nt)，特别是位于–133 nt至–120 nt的位点“GGCGGGGGTGGAGG”、位于–86 nt至–69 nt的位点“TGGCTGCGGGGGC GGTGT”和位于–46 nt至–33 nt的位点“TTGGA TACGTCATA”，这三个位点均含有一些分值较高的潜在TFBSs，推测可能是rep启动子与宿主转录因子结合的核心区域。

EMSA证明了rep基因启动子确实能与宿主核蛋白结合，DNA-pull down联合LC-MS/MS将这些结合蛋白鉴定为包含有转录因子的一系列宿主核蛋白(数据未展示)，其中包括poTFAP2δ。TFAP2家族是序列特异性的DNA结合蛋白，在动物发育、分化和肿瘤发生过程中调控基因表达，发挥重要作用^[22]。哺乳动物普遍存在5个TFAP2基因(TFAP2α/β/γ/δ/ε)，分别编码TFAP2α/β/γ/δ/ε蛋白。TFAP2家族常表达于中枢神经系统，基因缺失小鼠实验表明TFAP2家族对发育极其关键，常为致死性缺失^[23-30]。TFAP2δ与TFAP2家族其他成员的相似度最低，对于TFAP2家族蛋白功能极其重要的8个保守残基，TFAP2δ仅有3个^[31-33]。据报道，TFAP2家族蛋白具有与病毒基因启动子结合并调控启动子活性的功能，如TFAP2α/β/γ能与EBV的LMP1基因启动子结合，促进LMP1蛋白的表达，稳定EBV的潜伏感染^[14-15]；TFAP2还可以与HIV-1的LTR结合，调控HIV-1基因的表达^[16]。巧合的是，在预测的rep基因启动子潜在TFBSs结果中也存在TFAP2位点，那么poTFAP2δ是否可以与rep基因启动子结合而调节rep基因的转录？通过启动子活性试验、qPCR、WB及IFA等一系列试验，表明poTFAP2δ不仅可以促进rep基因启动子的活性，而且可以在PCV2感染过程中持续促进rep及cap基因的转录及翻译，最后对PCV2的病毒滴度也有一定的促进作用。

PCV2自身不编码复制酶，主要依靠细胞有丝分裂S期表达的酶及蛋白进行滚环复制，PCV2的复制起始依赖于Rep及Rep′蛋白与PCV2复制子的结合，所以rep基因的转录翻译在PCV2复制增殖中发挥至关重要的作用。我们基于本研究的结果推测，poTFAP2δ可以特异性地与rep基因启动子区某位点结合启动或促进rep基因的转录，翻译所得的大量Rep及Rep′蛋白启动病毒复制，产生更多的PCV2基因组及基因转录所需的模板，导致Cap蛋白的大量表达，保证了PCV2病毒包装所需衣壳蛋白及基因组的供给，于是病毒滴度增加。从试验结果可见，poTFAP2δ对PCV2 Rep、Cap蛋白及病毒滴度的促进均具有时间依赖性，随着PCV2感染进程的推进，这种促进作用越来越强，说明以上推测的poTFAP2δ对PCV2复制增殖的促进是一个不断累加的循环过程。至于poTFAP2δ是否与预测的TFAP2位点“TGGCTGCGGGGGCGGTGT” (–86 nt至–69 nt)结合，还需要大量的后续试验验证。

本研究首次证明了PCV2 rep基因启动子具有通过利用宿主转录因子poTFAP2δ促进病毒基因转录、翻译及病毒滴度的生物学功能，从病毒利用宿主因子的角度阐释了PCV2的复制机制。该研究结果为进一步从病毒与宿主互作角度阐明PCV2的致病机制提供新的研究思路，亦为PCV2高效疫苗的研制提供了理论基础。