生物工程学报  2018, Vol. 34 Issue (12): 2016-2024
http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.180083
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
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文章信息

陈云雨, 孙红, 刘刚, 胡华波, 张国利, 刘晓平, 岳玉环
Chen Yunyu, Sun Hong, Liu Gang, Hu Huabo, Zhang Guoli, Liu Xiaoping, Yue Yuhuan
人源抗ICAM-1单链抗体的制备及其生物学活性鉴定
Preparation and identification of anti-human ICAM-1 scFv
生物工程学报, 2018, 34(12): 2016-2024
Chinese Journal of Biotechnology, 2018, 34(12): 2016-2024
10.13345/j.cjb.180083

文章历史

Received: March 12, 2018
Accepted: May 2, 2018
人源抗ICAM-1单链抗体的制备及其生物学活性鉴定
陈云雨1,2 , 孙红2,3 , 刘刚1 , 胡华波1 , 张国利2 , 刘晓平1 , 岳玉环2     
1 皖南医学院 药学院 新药筛选与评价中心,安徽 芜湖 241002;
2 军事医学研究院 军事兽医研究所,吉林 长春 130122;
3 黑龙江生物科技职业学院 生物制药系,黑龙江 哈尔滨 150025
收稿日期:2018-03-12; 接收日期:2018-05-02; 网络出版时间:2018-06-19
基金项目:国家自然科学基金(Nos. 81703546,81272485),安徽省自然科学基金(No. 1808085QH265),吉林省科技发展计划(No. 20160520045JH),皖南医学院博士科研启动基金(No. RCQD201617),国家重点研发计划“宠物病毒性传染病血液生物制品研究与产品创制” (No. 2016YFD0501002)资助
摘要:利用噬菌体展示技术筛选特异性人源抗ICAM-1单链抗体(Anti-human ICAM-1 scFv)并进行生物学活性鉴定。应用Tomlinson I+J噬菌体抗体库,以P1抗原肽为包被抗原,经过4轮“吸附-洗脱-扩增”进行亲和富集筛选。以PCR反应、ELISA抗原交叉反应和Dot blotting实验进行阳性克隆的鉴定。scFv经原核表达和分离纯化后,以Western blotting实验、竞争ELISA实验和细胞黏附抑制实验对其生物学活性进行初步鉴定。Tomlinson I+J噬菌体抗体库经4轮亲和富集筛选,利用ELISA方法成功筛出4株阳性克隆。通过PCR鉴定反应、ELISA抗原交叉反应和Dot blotting实验,最终获得了1株既能与P1抗原肽特异结合又能与人ICAM-1抗原特异结合的阳性克隆J-A1。对scFv进行原核表达和亲和层析后获得了高纯度的目的蛋白。竞争ELISA实验和细胞黏附抑制实验证实纯化的scFv具有良好的亲和活性和抗细胞黏附活性。文中成功利用噬菌体展示技术筛选到特异性人源抗ICAM-1 scFv,为进一步探索该抗体在炎症相关性疾病治疗中的应用奠定了基础。
关键词噬菌体展示技术    细胞间黏附分子    ICAM-1    单链抗体    人源化抗体    
Preparation and identification of anti-human ICAM-1 scFv
Chen Yunyu1,2 , Sun Hong2,3 , Liu Gang1 , Hu Huabo1 , Zhang Guoli2 , Liu Xiaoping1 , Yue Yuhuan2     
1 Center for New Drug Screening & Evaluation, School of Pharmacy, Wannan Medical College, Wuhu 241002, Anhui, China;
2 Institute of Military Veterinary Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Changchun 130122, Jilin, China;
3 Department of Biomedicine, Heilongjiang Vocational College of Biology Science and Technology, Harbin 150025, Heilongjiang, China
Abstract: To screen the specific anti-human intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) single chain fragment variable (scFv) using phage display library technology and to identify its biological activity. P1 peptide was used as antigen, and the phage antibodies against human ICAM-1 antigen were panned by four binding-eluting-amplifying cycles using Tomlinson I+J phage display library. After four rounds of selective enrichment screening, the positive clones were determined by PCR, enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)-based antigenic cross reaction and Dot blotting. Then the binding specificity and biological activity of purified scFv were identified by Western blotting, competitive ELISA and cell adhesion inhibition assay respectively. Furthermore, four positive clones were first panned through P1 peptide coated-ELISA assay, and then J-A1 was obtained and identified by PCR, ELISA-based antigenic cross reaction and Dot blotting, which could show a specific binding between P1 peptide and human ICAM-1 protein antigen. Subsequently, the purified scFv showed a satisfactory specificity and anti-adhesive activity in competitive ELISA and the cell adhesion inhibition assay. The specific anti-human ICAM-1 scFv was prepared successfully from Tomlinson I+J phage display library, which pave the way for further application of anti-human ICAM-1 scFv for inflammation diseases therapeutics.
Keywords: phage display technology    intercellular adhesion molecule    ICAM-1    scFv    humanized antibody    

细胞间黏附分子-1 (Intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)广泛表达于多种细胞表面,属于免疫球蛋白超家族成员,是由膜外区、跨膜区和胞浆区组成的跨膜糖蛋白。在细胞生理状态时,ICAM-1处于低水平表达;当细胞受到致炎因子刺激后,ICAM-1表达量明显增加。通过与淋巴细胞功能性相关抗原(Lymphocyte functional antigen-1,LFA-1)结合,介导粒细胞、淋巴细胞与血管内皮细胞的黏附,促进白细胞游走和趋化于炎症病灶,加重病理损伤,在炎症性疾病的发生与发展中发挥重要作用,已经成为炎症相关性疾病治疗的新靶标[1-4]。利用重组抗体封闭ICAM-1生物学功能,减轻并改善病理性炎症损伤已经成为抗炎治疗的重要策略。目前,应用抗ICAM-1单克隆抗体疗法对移植排斥反应、自身免疫性疾病、多发性骨髓瘤、糖尿病肾病、溃疡性结肠炎等多种疾病的治疗已经取得了较好的疗效[5-7]

与传统的嵌合抗体相比,单链抗体(Single chain fragment variable,scFv)不仅保持亲本抗体的特异性、载体性和靶向性特点,还具有分子量小、免疫原性低、组织穿透力强和易于改造等诸多优点,已经成为重组抗体领域的研究热点[8-9]。郝文波等利用抗ICAM-1单克隆抗体对噬菌体十二肽库进行筛选,证实保守序列P1短肽(KLYLIAEGSVAA)同样具有天然ICAM-1的生物学功能[10]。本研究将P1短肽作为抗原,利用Tomlinson I+J噬菌体抗体库,经4轮“吸附-洗脱-扩增”亲和富集筛选人源抗ICAM-1 scFv,经分离纯化后,对其生物学活性进行初步研究。

1 材料与方法 1.1 材料

小鼠抗ICAM-1单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb) 2C5由本实验室制备;P1抗原肽(KLYLIAEGSVAA)由上海强耀生物科技有限公司合成;Tomlinson I+J噬菌体抗体库、辅助噬菌体KM13、Escherichia coli TG1和E. coli HB2151由中国科学院过程工程研究所刘瑞田教授惠赠;c-Myc(9E10)-HRP购自Santa Cruz公司;脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、胰酶、四甲基联苯胺溶液(3, 3';, 5, 5';-Tetramethylbenzidine,TMB)和二氨基联苯胺溶液(3, 3';-Diaminobenzidine,DAB)购自Sigma-Aldrich;2×Easy Taq®酶、DNA标准分子量购自TransGen公司;二辛可宁酸(Bicinchoninic acid,BCA)蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo公司;HisTrap亲和层析柱购自GE公司;人ICAM-1抗原购自R/D公司;其他试剂为国产分析纯。

1.2 方法 1.2.1 抗ICAM-1 scFv的亲和富集筛选

将P1抗原肽(1 μg/孔)包被96孔酶标板,使用Tomlinson I+J噬菌体抗体库(I库库容1.47×108;J库库容1.35×108;scFv产物含有c-Myc和His标签),在96孔酶标板中实施4轮“吸附-洗脱-扩增”亲和富集筛选过程。进行第1轮筛选时,以含0.1% Tween-20的磷酸盐(Phosphate buffered solution,PBS)缓冲液(PBST)洗板10次,第2轮及其以后的筛选中分别洗板20次,充分洗去非特异性吸附的噬菌体。洗涤后以胰酶室温消化30 min,洗脱噬菌体。经过“吸附-洗脱-扩增”过程将每轮筛选所收集的噬菌体置于下一轮筛选条件中,从而使阳性噬菌体得到富集并计算每轮筛选的富集倍数。

1.2.2 阳性克隆的ELISA检测

将第4轮亲和富集筛选的阳性噬菌体感染E. coli HB2151后,从所涂布的TYE平板上随机挑取单克隆菌落接种到96孔细胞培养板(含100 μg/mL Amp和1%葡萄糖的2×TY培养基)培养过夜。次日从该板上转接2 μL菌液至第二块96孔细胞培养板(含100 μg/mL Amp和0.1%葡萄糖的2×TY培养基),37 ℃培养至OD600约为0.9时加入1 mmol/L IPTG诱导,30 ℃培养过夜。次日离心取上清进行阳性克隆菌株的ELISA检测。

在ELISA检测中,以P1抗原肽(1 μg/孔)包被96孔酶标板,以包被1 μg牛血清白蛋白(Bull serum albumin,BSA)作为阴性对照。酶标板经2%脱脂奶粉(Skim milk)封闭后,每孔加入50 μL诱导上清,室温孵育1 h。PBST洗涤3次后,每孔加入1:500稀释的c-Myc(9E10)-HRP抗体,室温孵育1 h。再以PBST洗板3次后,每孔加入TMB底物溶液避光显色,然后加入2 mol/L H2SO4终止反应,酶标仪测定OD450值。每份样品做双孔测定,取OD平均值。阳性克隆菌株确定标准:OD值为阴性对照值3倍以上。

1.2.3 PCR鉴定阳性克隆

按照pIT-2载体基因序列,合成两条引物扩增scFv基因片段。P1:5';-CAGGAAACAGCTATGA C-3';;P2:5';-CTATGCGGCCCCATTCA-3';。

PCR反应体系如下:引物P1 (10 μmol/L)和P2 (10 μmol/L)各0.5 μL,阳性克隆菌液1 μL,2×Easy Taq® 10 μL,再用无菌蒸馏水补足体积至20 μL。

PCR扩增条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s,30个循环;72 ℃延伸10 min。PCR反应结束后,用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果。

1.2.4 阳性克隆的ELISA抗原交叉反应实验

分别以P1抗原肽(1 μg/孔)、3%牛血清白蛋白(BSA)和2%脱脂奶粉(Milk)包被96孔酶标板,4 ℃过夜。次日,每孔分别加入PCR鉴定含有完整scFv基因片段的阳性克隆诱导的上清进行ELISA抗原交叉反应实验,实验步骤如1.2.2所述。

1.2.5 Dot blotting实验鉴定阳性克隆

将硝酸纤维素膜置于平皿中,以1 μL人ICAM-1抗原(1.0 mg/mL)在硝酸纤维素膜中央点样。经2%脱脂奶粉封闭后,加入500 μL经抗原交叉反应实验鉴定的阳性克隆诱导的上清,以牛血清白蛋白(BSA)为阴性对照,37 ℃孵育2 h。PBST洗涤3次后,每孔加入1:500稀释的c-Myc(9E10)-HRP抗体,37 ℃孵育1 h。再以PBST洗涤3次,以DAB溶液显色。

1.2.6 抗ICAM-1 scFv的分离纯化与Western blotting鉴定

将J-A1工程菌接种于500 mL 2×TY培养基(含100 μg/mL Amp+0.1%葡萄糖)中进行scFv的诱导表达(1.0 mmol/L IPTG,30 ℃诱导16 h)。离心收集上清,以40%饱和硫酸铵沉淀目的蛋白,用20 mL平衡液(25 mmol/L Tris,0.5 mol/L NaCl,pH 7.5)稀释后,制备粗提液。将HisTrap亲和层析柱以平衡液进行平衡后。以0.5 mL/min上样,再以平衡液洗脱流穿峰至基线。最后以洗脱液(25 mmol/L Tris,0.5 mol/L NaCl,200 mmol/L咪唑,pH 7.5)进行梯度洗脱并收集目的蛋白峰。纯化的目的蛋白以10% SDS-PAGE进行分析,将其透析过夜后,以BCA蛋白浓度测定试剂盒进行定量。

将含人ICAM-1抗原的SDS-PAGE胶进行转膜,进行Western blotting检测。一抗为1:200稀释的纯化scFv,二抗为1:500稀释的c-Myc(9E10)- HRP抗体,用增强型HRP (Horseradish peroxidase)底物化学发光液显影成像。

1.2.7 抗ICAM-1 scFv的生物学活性鉴定

1) 竞争ELISA实验

将P1抗原肽(1 μg/孔)包被96孔酶标板,以牛血清白蛋白(BSA)封闭酶标板。将0.1 mg/mL McAb 2C5与倍比稀释的scFv混合后,100 μL/孔依次加入酶标板,37 ℃孵育1 h。PBST洗板3次后,加入HRP标记的羊抗小鼠IgG,37 ℃孵育1 h。以TMB底物溶液避光显色,2 mol/L H2SO4终止反应,酶标仪检测OD450值。

2) 人血管内皮细胞-单核细胞黏附抑制实验[11-12]

将以LPS刺激后的人血管内皮细胞ECV304用Hank’s液洗涤2次后,前两组加入抗ICAM-1 scFv (2 μg、5 μg),后两组加入McAb (2 μg、5 μg),每组设置8孔,以加入PBS孔作为对照组,37 ℃培养60 min。每孔加入单核细胞悬液100 μL (约1×105/孔),37 ℃孵育60 min,用预温培养基轻轻洗去未黏附单核细胞。充分洗涤后,每孔加入100 μL 0.25% Rose Bengal溶液,室温静止5 min。弃除染料后,以PBS洗涤2次,每孔再加入PBS-乙醇(V/V=1:1) 200 μL,室温静置30 min,酶标仪检测OD570值。

黏附率(%)=(ECV304细胞黏附单核细胞OD值-ECV304细胞OD值)/总单核细胞OD值×100%。

1.2.8 统计学分析

计量资料用x±s表示,两组均数比较采用t检验,以P < 0.05时为差异显著。

2 结果与分析 2.1 抗ICAM-1 scFv的亲和富集筛选

Tomlinson I+J噬菌体抗体库经4轮“吸附-洗脱-扩增”亲和富集筛选后,噬菌体抗体收获率由第1轮的2.00×10-8增加到第4轮的4.00×10-5,富集倍数增加2 000倍左右(表 1)。亲和富集筛选过程中噬菌体抗体收获率的逐渐升高是特异性噬菌体抗体富集的表现,是评价亲和富集筛选效果的一个核心指标[13-15]

表 1 亲和富集筛选对抗ICAM-1 scFv的富集效应 Table 1 Selective enrichment of anti-human ICAM-1 phage antibodies from Tomlinson I+J phage display library
Round Input phage (pFU) Output phage (pFU) Recovery rate (%) (output/input) Enrichment (rate(n)/rate(1))
1 1.00×1013 2.00×105 2.00×10-8 1
2 5.40×1012 8.50×106 1.60×10-6 80
3 6.80×1012 7.80×107 1.10×10-5 550
4 5.00×1012 2.00×108 4.00×10-5 2 000

将第4轮亲和富集筛选的阳性噬菌体感染E. coli HB2151后,从所涂布的TYE平板中随机挑取400个单克隆菌落接种于96孔板中进行培养并诱导表达scFv,利用ELISA实验进行初步筛选,最后得到4株阳性克隆,分别命名为J-A1、J-H12、I-B7和I-B10。

2.2 阳性克隆的鉴定

以PCR法对上述4株阳性克隆进行PCR扩增,在约930 bp处均扩增出特异条带,与预期大小一致,说明其含有完整的scFv基因(图 1A)。将4株阳性克隆用ELISA实验进行抗原交叉反应检测,实验结果表明,J-A1菌株特异性较好,其他3株与牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶粉(Milk)均有较高的交叉反应(图 1B)。Dot blotting实验表明,J-A1菌株可以与人ICAM-1抗原发生特异性结合反应(图 1C)。

图 1 阳性克隆的鉴定 Figure 1 Identification of four positive clones. (A) PCR products of four positive clones. 1: DNA marker; 2: J-A1; 3: J-H12; 4: I-B7; 5: I-B10. (B) ELISA-based antigenic cross reaction of four positive clones. (C) Dot blotting assay for J-A1 clone. 1: negative control; 2: J-A1 clone.
2.3 J-A1序列测定与分析

J-A1序列分析表明,抗ICAM-1 scFv基因全长720 bp,其中重链可变区基因位于Linker的上游,长348 bp,编码116个氨基酸;轻链可变区基因位于Linker的下游,长327 bp,编码109个氨基酸。两者由含15个氨基酸的柔性短肽连接(加粗序列),构成了完整的抗ICAM-1 scFv基因序列(图 2)。Blast分析表明,该基因序列符合数据库中单链抗体所具有的特点,重链可变区和轻链可变区具有完整的骨架区和互补决定区(划线序列)结构。

图 2ICAM-1 scFv基因序列分析 Figure 2 Sequence analysis of anti-ICAM-1 scFv gene. underline: complementary-determining region; bold: linker.
2.4 抗ICAM-1 scFv的分离纯化与Western blotting鉴定

J-A1工程菌经IPTG诱导培养后,离心收集上清,经HisTrap亲和层析柱分离纯化后,收集目的蛋白样品进行SDS-PAGE,经考马斯亮蓝染色后呈单一蛋白条带,表明纯化的scFv具有较高的纯度。蛋白样品分子量为30 kDa,与scFv理论分子量基本一致(图 3A)。scFv经透析和BCA法定量后,其浓度为0.65 mg/mL。Western blotting实验表明,以纯化的scFv作为一抗,在相对分子量55 kDa左右出现特异性条带,其与ICAM-1抗原分子量大小一致,证实了纯化的scFv可与人ICAM-1抗原发生特异性结合反应(图 3B)。

图 3 抗ICAM-1 scFv的分离纯化与鉴定 Figure 3 Purification and identification of anti-ICAM-1 scFv. (A) Purification of anti-ICAM-1 scFv. 1: protein marker; 2: purified anti-ICAM-1 scFv. (B) Western blotting assay of anti-ICAM-1 scFv. 1: negative control; 2: human ICAM-1 antigen band (55 kDa).
2.5 抗ICAM-1 scFv生物学活性鉴定

竞争ELISA实验表明,伴随scFv的倍比稀释,OD450值逐渐升高,说明scFv和McAb与P1抗原肽的结合作用是相互排斥的,scFv能与McAb竞争结合P1抗原肽(图 4)。

图 4 竞争ELISA实验 Figure 4 Competitive ELISA assay of anti-ICAM-1 scFv.

利用Rose Bengal对黏附细胞进行染色,计算细胞黏附率。2 μg和5 μg scFv组的黏附率分别为30.39%与26.47%;同剂量McAb组的黏附率分别为27.45%与25.49%,PBS对照组为40.19% (图 5)。细胞黏附抑制实验表明,scFv和McAb都能抑制单核细胞与人血管内皮细胞间的黏附,黏附抑制作用与其浓度呈正相关,与PBS对照组相比,差异显著。这表明所制备的抗ICAM-1 scFv具有较好的抗细胞黏附活性。

图 5 细胞黏附抑制实验 Figure 5 Cell adhesion inhibition assay of anti-ICAM-1 scFv and McAb. *P < 0.05 compared to PBS control. P values were calculated using t test.
3 讨论

黏附分子介导的细胞黏附是机体生理和病理过程的基本现象和共同过程。由细胞间黏附分子-1 (ICAM-1)和淋巴细胞功能性相关抗原(LFA-1)相互作用介导的炎症级联反应过程在炎症性疾病的发生与发展中发挥重要作用[2, 5]。应用新型抗黏附分子抗体特异性阻断上述作用已经成为炎症相关性疾病治疗的新热点,并成功应用于烧伤、移植排斥反应、缺血再灌注损伤、类风湿性关节炎等多种疾病的临床治疗[5, 16]。美国FDA已经批准Enlimomab、Efalizumab等抗黏附分子抗体进入Ⅱ期临床研究[17-19]

噬菌体展示技术是一种可以不经免疫动物和细胞融合等过程,通过抗体片段的克隆选择,可以快速制备出几乎所有抗原的人源化抗体的技术[20-23]。因此,为快速制备人源抗ICAM-1 scFv,本研究利用Tomlinson I+J噬菌体抗体库,采用固相筛选法,以P1抗原肽为包被抗原,经过4轮亲和富集筛选使特异性噬菌体抗体得到了2 000倍的富集。通过ELISA方法对第4轮亲和富集后的部分单克隆菌落进行抗体活性的初步鉴定,成功筛出4株阳性克隆。通过PCR鉴定反应、ELISA抗原交叉反应和Dot blotting实验,最终获得了1株既能与P1抗原肽特异结合又能与人ICAM-1抗原特异结合的阳性克隆J-A1。J-A1工程菌经IPTG诱导表达,成功进行了scFv的可溶性表达,继而采用HisTrap亲和层析柱进行分离纯化。采用Western blotting实验、竞争ELISA实验和细胞黏附抑制实验进行了scFv生物学活性的初步鉴定。上述实验表明,纯化的scFv具有与人ICAM-1抗原特异性结合的特性且结合强度与scFv浓度呈正相关;scFv能够明显抑制人血管内皮细胞和单核细胞间的黏附,其抗黏附作用随scFv浓度的增高而增强,但单链抗体的黏附抑制作用稍弱于单克隆抗体。

BLAST进行J-A1序列分析表明,J-A1含有完整的单链抗体恒定区和可变区,与已报道的抗ICAM-1 scFv氨基酸序列相比[24],J-A1的互补决定区(Complementary-determining region,CDR)序列与其差异较大,尤其是重链可变区中的CDR3区和轻链可变区中的CDR1区。由于抗原-抗体的特异性结合与抗体轻链和重链的CDR区环状结构的氨基酸序列密切相关[25],故此CDR区氨基酸序列差异可能是导致scFv亲和力差异的关键,进一步优化CDR区氨基酸序列可能是提高抗ICAM-1 scFv生物学活性的重要策略。

与本室曾采用的以大肠杆菌原核表达系统制备抗ICAM-1 scFv相比[24, 26],利用噬菌体展示技术制备scFv更加简便易行并具有更高的产量和生物学活性。在后续的研究中,我们将继续深入研究以提高抗ICAM-1 scFv的稳定性和亲和性,使其具有更佳的生物学活性,探索抗ICAM-1 scFv在炎症相关性疾病治疗中的应用前景。

致谢 衷心感谢中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室生物药物工程研究部主任刘瑞田教授在噬菌体展示技术方面给予的悉心指导和无私帮助!

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