作为20世纪医学上最重要的发现之一，抗生素不仅是治疗人类细菌感染最成功的药物，而且作为预防及治疗用药、促生长剂、饲料添加剂被广泛用于畜牧养殖业，是保障人类健康和现代养殖业健康发展的有力武器。随着密集型养殖模式的发展，为保证养殖动物健康，大量的抗生素用于养殖业，例如，仅2015年一年我国在养殖业中使用的抗生素高达9.7万t。养殖业中抗菌药物的过度使用甚至是滥用导致抗菌药物耐药性的迅速发展，近年来，养殖业尤其是养殖环境中耐药性问题引起了研究者的广泛关注，大量的研究也表明养殖环境可能在耐药菌、耐药基因的传播扩散中起着非常重要的作用。

文中主要关注养殖场环境及周边环境的耐药性问题，并将从动物养殖业抗生素耐药现状、耐药基因的持留和传播扩散、研究方法等方面进行综述，以期让更多人对养殖环境中抗生素耐药性问题有更深入的认识，为养殖业抗生素耐药性风险评估提供一定的支持。

1 动物养殖业抗生素耐药性现状 1.1 畜禽养殖业抗生素耐药性现状

抗菌药物在临床和畜禽养殖业的大量使用导致耐药菌不仅在人群和动物中广泛流行，而且逐渐向环境中扩散。目前，畜禽养殖业耐药菌的研究主要涉及动物传染性疾病相关病原菌及对人畜健康具有重要影响的病原菌，其中产超广谱β-内酰胺酶(Extend-spectrum-β-lactamases, ESBLs)的细菌、产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌(Carbapenem- resistance Enterobacteriaceae, CRE)、携带多黏菌素耐药基因mcr-1的细菌、多重耐药的沙门菌及甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌是目前人们较为关注的耐药菌。

β-内酰胺类抗生素是治疗细菌感染的最重要抗生素之一，尤其是三代和四代头孢菌素，而ESBLs可以水解几乎所有的青霉素类和头孢类抗生素，且编码ESBLs的基因大多在一个较大的质粒上，该质粒常携带多种抗生素耐药基因，因此ESBLs的菌株多数为多重耐药菌。携带编码ESBLs基因的质粒可在不同种属菌株之间水平传播，加速了编码ESBLs基因的传播。产ESBLs多重耐药菌的流行不仅对人类健康产生巨大的威胁，还会增加碳青霉烯类等新型非典型β-内酰胺抗生素的使用，从而加剧这类抗生素耐药性的发展。目前，产ESBLs菌不仅是院内感染中常见的多重耐药菌，而且在动物食品生产链条及环境中广泛流行。ESBLs最初在肺炎克雷伯菌中发现，而目前越来越多的产ESBLs大肠杆菌和沙门菌被报道^[1-3]。目前，编码ESBLs的基因已经超过600种变异体，大部分属于CTX-M、TEM和SHV型，其中CTX-M阳性菌逐渐成为畜禽养殖业中流行最广泛的产ESBLs细菌，例如Zheng等调查的食品动物源(猪、鸡和牛) 896株大肠杆菌中ESBLs阳性菌为127株，其中CTX-M型为111株(87.4%)^[4]。畜禽养殖场内产ESBLs细菌不仅可以通过动物排泄物、空气、苍蝇等进入环境，对环境造成污染，还可能通过食物链传播，给人类健康造成潜在威胁^[5-6]。

碳青霉烯类抗生素的结构与经典青霉烯结构相似，不同之处在于4位硫原子被碳原子代替及6位羟乙基侧链为反式构象，此特殊结构使得这类抗生素成为非典型β-内酰胺类抗生素^[7]。该类抗生素具有抗菌谱广、抗菌活性强和毒性低等特点，是目前治疗严重革兰氏阴性菌感染的最重要抗菌药物之一。因产ESBLs菌株和多重耐药革兰氏阴性菌的广泛流行，碳青霉烯类抗生素的使用量大幅度增加，导致碳青霉烯类抗生素耐药性日益严重。碳青霉烯酶通过水解碳青霉烯类抗生素介导细菌对该类抗生素耐药，其中KPC、VIM、NDM、OXA-23/40/48/58、IMP等在全球范围内广泛流行而受到广泛关注。一直以来医院是产碳青霉烯酶细菌的重要来源，院内流行的产碳青霉烯酶菌株主要为肺炎克雷伯菌和大肠杆菌^[8]。随着监测范围的扩大，在医院污水、城市污水、动物食品产业链、畜禽养殖环境等均有产碳青霉烯酶细菌的报道。Wang等对肉鸡产业链中NDM和MCR-1大肠杆菌分子流行病学的研究表明，产NDM肠杆菌科细菌在除孵化场之外的其他环节样本中均有检出，对其进行亲缘关系分析，发现肉鸡产业链各环节来源的部分大肠杆菌亲缘关系相近，商品鸡场不同来源的大肠杆菌的亲缘关系也相近，表明碳青霉烯耐药大肠杆菌可能在商品鸡场的不同环境因素之间相互传播^[9]。

随着碳青霉烯耐药菌的出现和流行，黏菌素又被重新启用，该药被认为是治疗产碳青霉烯酶菌引起的多重耐药革兰氏阴性菌感染的“最后一道防线”。由于黏菌素使用量的增加以及作为饲料添加剂的大量使用，导致其耐药性在最近十几年内迅速发展，尤其是质粒介导的可移动黏菌素耐药基因mcr，目前该基因已有6种变异体(mcr-2、mcr-3、mcr-4、mcr-5、mcr-6和mcr-7)被相继报道。7种mcr基因中mcr-1的流行范围最广，目前在全球40多个国家和地区相继发现^[9]，大部分国家动物源mcr-1阳性菌分离率较低(< 5%)，而在中国(4.9%-30.0%)、日本(13.2%-28.0%)、越南(12.5%-37.5%)、南非(17.6%)、法国(0.5%-20.5%)等国家和地区的分离率较高^[10]。值得注意的是，近年来多黏菌素耐药的产ESBLs和CRE菌株逐渐增加，这些多重耐药菌株的出现可能会使人类陷入无药可用的境地。2017年，Wang等在肉鸡产业链中分离到37株携带mcr-1基因的CRE^[9]；Savov等在临床上分离获得了4株产KPC-2型碳青霉烯酶和SHV-5型ESBL的多黏菌素耐药菌^[11]；Wu等在对中国4个省市的鸡场耐药性调查中，分离获得了44株携带mcr-1的ESBL阳性大肠杆菌^[12]。mcr-1基因在环境中的流行状况也不容乐观，易灵娴等报道称我国动物性食品源mcr-1阳性大肠杆菌的检出率为5%-30%，且表现为逐年增加的趋势^[10]。Zhang等在养殖场土壤中分离获得6株产ESBLs且同时携带mcr-1基因的大肠杆菌^[13]。2016年6月，有研究表明在比利时的仔猪和小牛样本中发现了多黏菌素耐药基因mcr-2^[14]，多数研究结果显示该基因的检出率非常低^[15-17]，目前，仅个别研究中该基因的检出率较高，例如Zhang等通过PCR方法对猪和家禽(鸡、鸭、鹅等)肛拭子和鼻拭子中mcr-1/2/3进行检测发现mcr-2的阳性率分别为56.3% (猪)、5.5% (鸡)、2.3% (鸭)、5.5% (鹅)和0% (鸽)^[18]。

2017年4月，在中国猪源大肠杆菌样本中发现了多黏菌素耐药基因mcr-3^[19]。同年有报道称，在意大利的2013年屠宰猪沙门氏菌样本中以及2015年和2016年西班牙和比利时的猪大肠杆菌样本中发现了多黏菌素耐药基因mcr-4^[20]。2017年8月，有报道称在德国2011–2013年禽类和食品的沙门菌样本中发现了mcr-5^[21]。由于mcr-3/4/5基因被报道的时间距今较短，相关数据较少。目前，基因库中已上传了多黏菌素抗性基因mcr-6和mcr-7的基因序列，但还未见相关文章和报道。

沙门菌是一种常见的食源性病原菌，多重耐药沙门菌在人群、畜禽养殖业以及屠宰场和肉类加工设施周围的环境中广泛流行，尤其在畜禽养殖业中多重耐药沙门菌的分离率甚至超过92%^[22]。目前，多重耐药沙门菌大多对四环素类、喹诺酮类、氯霉素类、青霉素类、单环β-内酰胺类和硝基呋喃表现出耐药^[23]。此外，来源不同的沙门菌对环丙沙星和头孢噻肟呈不同程度的耐药，例如在Sinwat等的研究中，来源于泰国和老挝的猪源(猪养殖场和猪肉)和人源沙门菌大多对环丙沙星、头孢他啶、头孢哌酮、头孢噻肟和头孢泊肟敏感^[22]；Trongjit等分离获得的345株沙门菌中仅6株为产ESBLs沙门菌^[24]，而关于我国六省零售整鸡中环丙沙星与头孢噻肟双耐药的沙门菌流行状况及分子分型的研究中，对环丙沙星与头孢噻肟双耐药的沙门菌共计227株(8.52%，227/2 629)^[3]。

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicilin-resistant Staphylococus aureus，MRSA)是一类严重威胁人类健康的“超级细菌”。MRSA除对甲氧西林耐药之外，对β-内酰胺类、四环素类、氨基糖苷类、大环内酯类药物等表现出不同程度的耐药。有研究显示，MRSA在世界范围呈广泛分布，不同国家或地区的分离率存在较大差异，例如德国和荷兰(> 35%)、波兰(20.6%)、中国(11.4%)、韩国(3.2%)、马来西亚(1.4%)、日本(0.9%)、中国台湾(14.4%)^[25]，动物源性MRSA主要在猪场流行，在家禽、牛、羊、马等养殖动物中检出率相对较低。MRSA不仅在养殖动物中流行，而且在养殖环境、动物食品生产链条中检出率也较高，例如聂青等研究显示MRSA在环境样、猪群、生猪肉和猪肠中的分离率分别为9.86%、22.68%、44.1%和12.5%^[26]。有研究显示，猪源MRSA与人源MRSA具有相关性(P=0.001)，动物源性MRSA在养殖业从业人群中的检出率较高，例如，美国和加拿大养猪农民MRSA的检出率分别为45%和20%^[27]。

随着环境中耐药基因作为新型污染物的概念出现后，荧光定量PCR和宏基因组学等非培养的研究方法用于表征各种环境介质中耐药基因的污染水平。荧光定量PCR检测方法主要用于表征畜禽养殖过程中常用抗生素的耐药基因的污染状况，如四环素类耐药基因(tetA、tetB、tetC、tetE、tetH、tetM、tetK、tetL、tetO、tetQ、tetS、tetT、tetW、tetX、tetP)、磺胺类药物耐药基因(sul1、sul2、sul3)、氟苯尼考耐药基因(floR、fexA、fexB、cfr、optrA等)、喹诺酮类耐药基因(qnrD、qnrS、qepA等)、MLSB (ermA、ermB、ermC、ermF、ermT、ermX)、β-内酰胺类耐药基因(TEM家族、SHV家族、CTX-M家族、OXA家族等)等^[11]。大量研究表明^[28-31]，上述常用抗生素耐药基因在养殖环境中广泛存在，但其污染水平在不同养殖环境中差异较大。例如，Wang等利用荧光定量PCR方法对中国东南地区5省的16个养殖场中的5类抗生素(四环素类、磺胺类、喹诺酮类、氨基糖苷类、大环内酯类)的21种耐药基因进行定量调查，发现粪便样品中ermB、tetM和sul2基因的污染程度最重，其相对丰度达到了10⁹ copies/g，阳性率大于90%。土壤样品中tet和sul为优势基因，sul2基因浓度最高达1.73×10⁹ copies/g，其次是tetC、tetM、sul1，浓度高于10⁸ copies/g^[30]。Tao等检测中国台湾6个猪场污水处理系统中耐药基因发现，耐药基因(tetA、tetW、sul1、sul2、bla_TEM)在所有样品中均被检出，且磺胺类耐药基因平均相对丰度最高(10^–2-10^–1)，其次是bla_TEM (10^–3-10^–2)，四环素类最低(10^–4-10^–3)^[32]。Mu等对中国北方养殖场环境中四环素类、磺胺类及质粒介导的喹诺酮类和大环内酯类等21种耐药基因污染水平的研究显示，21种耐药基因在大多数样品中均被检测到，大环内酯类耐药基因(ermB、ermC)、磺胺类耐药基因(sul1、sul2)、喹诺酮类耐药基因(qnrS、oqxB)和四环素类耐药基因中核糖体保护蛋白基因在所有的样品中均被检测到。畜禽(猪、鸡、牛)养殖场环境中污染最严重的是喹诺酮类和磺胺类耐药基因，大环内酯类耐药基因虽然在所有样品中均被检测到，但污染水平最低^[31]。Zhao等对河南地区猪场环境中氟苯尼考类耐药基因的研究发现，氟苯尼考类耐药基因整体污染水平较高(10^–1-10^–3)，fexA、optrA和floR在所有样品中均被检测到，floR平均相对丰度最高，其次是optrA^[33]。

畜禽养殖场中耐药基因可通过空气、污水、人类活动等对周边土壤、水体和社区造成污染。畜禽粪便或堆肥常作为有机肥用于农业生产，施肥后，土壤中耐药基因的多样性及丰度均明显提高，且土壤的菌群结构也有明显的改变，同时农产品也会受到耐药菌及耐药基因的污染^[34]。养殖业尤其是水产养殖过程中会产生大量的污水，而目前的污水处理技术不能有效地消除污水中残留的抗生素及抗生素耐药基因^[35]。目前，养殖业产生的污水多排入周边水体或用于灌溉，收纳水体及土壤中均能检测到残留的抗生素及耐药基因^[36]。Ma等和Li等通过宏基因组学对不同来源样品中耐药基因分析结果显示耐药基因及耐药基因的可移动遗传元件在人、不同动物及环境间发生水平传播^[37-38]。

1.2 水产养殖业抗生素耐药性现状

水产养殖同样被认为是水环境抗生素耐药基因和耐药菌的重要储库。磺胺类药物、青霉素类、四环素类、氟苯尼考类及喹诺酮类抗生素是水产养殖业防治细菌感染常用的几类抗生素。目前，水产养殖业耐药性的研究主要集中在气单胞菌属、沙门菌属、埃希氏菌属、克雷伯氏菌属等。

水产养殖分离获得的气单胞菌多数对杆菌肽、氨苄青霉素、青霉素耐药，而对卡那霉素、氟甲喹和恩诺沙星耐药的较少。不同研究中四环素、红霉素、链霉素、庆大霉素、恶喹酸等抗生素的气单胞菌耐药菌株分离率差异较大，例如不同研究中红霉素耐药气单胞菌的分离率分别为60%^[39]、95%以上^[40]、54.5%^[41]；四环素耐药气单胞菌分离率分别为0%^[39]、20%^[42]、48%^[43]、51.4%^[40]等。随着抗生素的大量使用，多重耐药气单胞菌的流行日益严重，在某些研究中多重耐药气单胞菌的分离率甚至达到100%^[44]。近年来，气单胞属对β-内酰胺类的耐药性呈上升趋势，在Radu等的研究中99.2%的气单胞菌株对一种或多种β-内酰胺类(头孢噻呋、氨苄西林-克拉维酸、氨苄西林、哌拉西林、头孢泊肟)表现出耐药性，25.2%菌株对上述所有的β-内酰胺类抗生素均耐药^[44]。Yin等发现气单胞菌还可能是多黏菌素耐药基因mcr-3的潜在储库^[19]。

水产养殖的肠杆菌科细菌对四环素类、氨苄西林和磺胺类药物表现出较高的耐药率，在多数研究中超过50%的大肠杆菌对氨苄青霉素表现为耐药，而对喹诺酮类及大环内酯类表现为较低的耐药率。近年来，人们对于多重耐药的肠杆菌科细菌越来越关注，水产养殖业也是多重耐药肠杆菌科细菌的重要来源，在Agoba等的研究中，90%的分离株对3种或3种以上的常用抗生素表现出耐药^[45]。目前，产ESBLs肠杆菌科细菌在水产养殖业中的报道较少，且在不同研究中产ESBLs的肠杆菌科细菌的分离率差异较大，Almeida等从零售的新鲜鱼虾样品中仅分离到2株产ESBLs大肠杆菌^[46]，而Brahmi等对地中海阿尔及利亚海岸野生鱼携带产ESBLs细菌的调查中，从300份样品中分离获得64株产ESBLs肠杆菌科细菌，其中产CTX-M型β-内酰胺酶的肠杆菌科细菌比例最高^[47]。

水产养殖业也是多重耐药沙门菌的重要来源之一。大量研究表明水产来源的沙门菌对头孢类、氯霉素类、四环素、利福平、林可霉素类、氨基糖苷类、磺胺类、大环内酯类、喹诺酮类、硝基呋喃类等多种抗生素表现出不同程度耐药性，同时在某些研究中也检测到有不同比例的多重耐药沙门菌^[48-53]。

基于非培养技术，关于水产养殖环境耐药基因分布特征的研究也越来越全面。在水产养殖环境中，磺胺类药物、四环素类、大环内酯类和β-内酰胺类抗生素耐药基因的检出率较高^[54-58]，多数研究表明磺胺类药物和四环素类耐药基因的相对丰度高于其他抗生素耐药基因^{[54, 56-57]}，且一种抗生素不同机制的耐药基因在养殖环境中均能检出^[54-57]。在对不同水产养殖模式下养殖环境中耐药基因的研究中，发现混养模式例如鸭-鱼模式的养殖环境中耐药基因的多样性明显高于单一养殖模式^[57]。Huang等和Muziasari等的研究表明养殖环境中的耐药基因主要来源于养殖动物的粪便^[57-58]。

2 耐药基因持留及传播扩散的相关因素

畜禽养殖环境中耐药基因呈高丰度、多样性分布，而出现这种结果是多方面因素共同作用产生的，目前的研究主要集中在养殖环境中抗菌药物的残留、重金属的污染、可移动遗传元件3个相关因素。

2.1 抗菌药物残留

抗菌药物作为治疗、预防用药和抗菌促生长剂而大量应用于畜禽养殖业。抗菌药物随着畜禽排泄物进入环境，成为环境中重要的污染物。残留在环境中的抗菌药物会对环境微生物产生选择压力，促进环境中细菌耐药性的发展^[59]。Ji等针对上海地区养殖场堆肥及养殖场周边农田土壤样品中耐药基因丰度与抗菌药物含量之间的相关性研究显示耐药基因sul1与磺胺嘧啶含量呈较强的正相关关系(r=0.847)^[60]。Zhao等对施用过鸡堆肥的农田土壤样品中耐药基因和耐药细菌的研究，同样发现磺胺类耐药基因与磺胺醋酰的残留量间存在非常强的正相关关系(R²=0.952 5)^[61]。Wu等对中国典型猪养殖场周边土壤中四环素类耐药基因分布特征的研究，显示四环素类耐药基因tetM、tetO、tetQ、tetW的总含量与四环素残留量间存在一定的正相关关系(R²=0.45)^[30]。Tang等和Zhao等在畜禽养殖环境中耐药基因和抗生素残留量的相关性研究中也获得了相似结果^{[33, 62]}。然而，目前也有研究显示，环境中耐药基因丰度与抗菌药物残留量间不存在明显的相关性^[63-64]，这种现象可能是由于环境样品的特殊性质或进入环境后不同耐药基因和抗菌药物的传播机制不同造成的^[63]。

2.2 可移动遗传元件

可移动遗传元件包括质粒、转座子、插入序列、整合子等可以在同种甚至不同种细菌间传播，从而介导耐药基因在基因水平上的快速传播。携带耐药基因质粒可携带一种或多种耐药基因，可通过接合、转化等方式传播耐药基因，如Wang等对同时携带bla_NDM和mcr-1基因的大肠杆菌的转移性研究中发现，bla_NDM和mcr-1既能单独又可同时发生转移^[9]。Ma等认为intI1 (Ⅰ型整合子)是环境中耐药基因污染的重要指征。intI1不仅可以携带耐药基因还可介导耐药基因的水平转移^[65]。例如，Hsu等在对猪养殖场及周围环境中磺胺类药物的耐药基因及耐药菌的研究中发现磺胺类药物耐药基因的传播扩散可能与intI1相关^[64]。Zhou等发现牛养殖场环境中耐药基因丰度与可移动遗传元件的丰度呈正相关关系，表明牛养殖环境中耐药基因的广泛流行可能与可移动遗传元件有关^[66]。

2.3 金属的污染

铜、锌等微量元素是动物饲料的成分之一，是动物生长所必需的。同时铜、锌等因其具有促生长和缓解断奶仔猪痢疾的作用而被广泛应用。这些金属离子随着粪便进入环境，对环境细菌耐药性的产生和发展具有重要影响。Knapp等发现土壤中耐药基因的丰度与铜、锌、镍、铁、铬等金属含量呈正相关，并且tet (M) 的丰度与金属污染程度的相关性最强，金属铜与土壤中耐药基因丰度相关性最强^[63]。Zhou等和Song等研究证明养殖场环境中耐药基因的维持和传播与铜和锌的含量密切关联^[66-67]。Song等研究证明在某些情况下，金属离子对于某些抗生素耐药性的选择压力可能超过抗生素^[67]。

在过去几十年中关于耐药基因和金属抗性基因共存的现象被不断报道，例如甲氧西林耐药基因与Zn抗性基因，四环素耐药基因与Cu抗性基因，多种耐药基因与Hg抗性基因等^[68-70]。在抗生素和金属负荷高的地区(例如畜禽及水产养殖环境)，这种共选择现象尤为常见^[71-72]。目前已发现多种与金属抗性基因相关的耐药基因，其中β-内酰胺、卡那霉素、杆菌肽、氨基糖苷类、多黏菌素和四环素类耐药基因被认为是最有可能与金属抗性基因共存的6种^[73]。环境中金属污染对细菌产生的选择压力，使金属抗性基因和耐药基因同时被富集。目前的研究还显示，耐药基因和金属抗性基因除了共存以外还存在共传播的现象，例如耐药基因与金属抗性基因常位于一个整合子或质粒上^[74]。同时与单一基因转移相比，耐药基因与金属抗性基因共转移的电位理论上可以增加细菌的适应性，从而加速耐药基因和金属抗性基因的扩散^[73]。

3 研究方法 3.1 细菌分离培养技术

基于传统的细菌分离培养技术的耐药基因分子机制研究是目前细菌耐药性研究中最常见的研究方法。首先，样品通过培养基分离纯化，获得环境样本中的耐药菌株；PCR技术对菌种的基因型和菌属进行测定；脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)等技术对其进行菌种分型分析。分子分型对于确定细菌耐药性的产生源头、传播途径、传播方式等具有重要意义。重要的基因型或特殊表型的菌种，可进一步对基因的耐药机制和传播机制展开研究。目前，基于细菌分离培养法的细菌耐药性研究方法已经非常成熟，在新型耐药基因的发现及耐药基因的传播扩散规律研究中发挥着重要的作用，如在耐药基因bla_NDM、质粒介导的多黏菌素耐药基因mcr-1、mcr-3的发现及mcr-1和bla_NDM通过食物链传播的研究中发挥着不可替代的作用^{[9, 19, 75]}。但是，此方法操作步骤复杂，且对环境中抗菌药物耐药菌的筛选具有很大的局限性。研究表明，目前环境中99%的微生物无法通过培养得到，因此可培养的方法不能全面地研究环境中耐药基因的流行状况。

3.2 实时荧光定量PCR技术

实时荧光定量PCR是一种利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每个循环扩增产物量的变化，最终精确定量模板起始量的方法，包括SYBR Green染料法和TaqMan探针法。实时荧光定量PCR方法可对样品总DNA进行定量检测目的基因的拷贝数，从而明确环境中耐药基因的污染水平。荧光定量PCR现已成为环境耐药性监测的重要研究手段。耐药基因在畜禽养殖场内及周边环境、施肥的农田、污水处理系统、河流、地表水、养殖场地下水等环境中的分布特征和污染程度相继被表征出来^{[30, 32, 64, 76-77]}。这些研究阐明了畜牧水产养殖环境、周边环境及受纳环境中耐药基因的分布特征，污水处理对于耐药基因的消除效果，医院及抗菌药物生产企业废水中耐药性、自然环境如河流、地表水中耐药基因的分布特征和污染水平，进一步揭示了人类活动对于环境细菌耐药性的影响。同时荧光定量PCR可与其他检测方法相结合，对于耐药基因在环境中传播规律的研究中表现出更大的优势。Popowska等通过荧光定量PCR与常规培养法相结合对土壤中四环素类、氨基糖苷类和大环内酯类耐药基因的分布特征进行了全面研究，显示四环素耐药基因分布广泛且污染程度高，施过肥的土壤样品中耐药基因污染程度高于未施肥的，且分离自前者的耐药菌MIC值高于后者^[78]。荧光定量PCR与16S rRNA测序技术相结合从宏观视角对环境中耐药基因及微生物群落特征进行全面研究。Zhu等通过荧光定量PCR方法与抗生素、金属离子定量分析方法结合，探究了猪场环境样品中抗生素耐药基因与抗生素残留及金属离子含量的相关性^[72]。

3.3 宏基因组学研究

宏基因组学研究是针对样品中微生物总DNA的分析。通过构建功能宏基因组文库或宏基因组测序文库，对样品中微生物的群落结构、特定功能的基因、未知基因等进行研究^[79]。Zhao等通过构建土壤宏基因组测序文库发现河南省的5个猪场土壤中氟苯尼考耐药基因呈不同程度的污染。同时，通过构建土壤功能宏基因组文库，筛选到对氟苯尼考耐药的克隆，并发现阳性克隆中可能存在某种新型耐药基因^[33]。Zhang等通过序列宏基因组文库，对各种水环境中耐药基因种类、丰度和可能的传播途径进行研究^[80]。序列宏基因组不仅在环境细菌耐药性研究领域中发挥着重要作用，而且在公共卫生安全领域的研究中也起着关键作用。Ma等对猪、鸡、人的粪便和污水处理厂废水中耐药基因的分布特征研究发现四环素类、大环内酯类、氨基糖苷类耐药基因和大环内酯类-林可霉素类-链阳菌素耐药基因在粪便样品中含量较高；猪、鸡、人的粪便样品和废水样品中存在多种相同耐药基因，如四环素耐药基因tetA-tetR以同样的排列方式存在于不同的样品中^[65]。Forsberg通过宏基因组学方法对土壤菌群及临床菌株中携带耐药基因的情况进行研究，发现土壤样品中多重耐药菌和临床耐药菌株携带的耐药基因岛具有高度一致性^[81]。上述研究结果表明耐药基因可能会在人、动物和生态环境之间相互传播，给公共卫生安全造成巨大的威胁。Oppegaard等^[82]、Hsu等^[64]、Li等^[38]的研究进一步揭示了耐药基因在人-动物-生态环境之间的水平传播的相关因素^{[38, 64, 82]}。

3.4 单分子测序技术

纳米孔测序技术最初由David Deamer、George Church和Daniel Branton三位科学家提出，随着测序技术的发展，现在已成为一种具有强竞争力的便携式测序技术^[83]。该技术主要利用单分子DNA链穿过纳米级的小孔时，不同碱基引起电流发生不同的变化，并将电信号转换为碱基序列来实现测序。该测序技术具有超长读长、实时测序、耗时短、可直接针对DNA和RNA进行测序、成本相对较低等特点^[84]。然而该测序技术的测序准确度相对较低，且对于测序的基因组、电脑配置和测序芯片质量要求高，从而一定程度上限制了该技术的推广^[84]。目前英国Oxford Technology公司推出了新型便携式测序仪MinION，通过MinION可以实现实时实地对样品中基因组进行快速检测，减少运输、储存等过程中造成的数据失真。目前，在耐药性研究领域已有采用该技术的相关研究，例如Xia等通过该技术对城市污水中大肠杆菌菌群耐药表型和基因型的相关性进行了研究^[85]；Ludden等使用纳米孔测序技术和二代测序技术证明了污水中携带碳青霉烯酶基因质粒可能在不同细菌之间交换，为环境中耐药基因传播机制的研究提供了一种新的研究方法^[86]。

4 总结

畜禽养殖场环境是耐药基因的重要储库，耐药基因通过污水和堆肥处理不能被有效消除，且能随着人类活动对周围环境造成污染，从而使环境成为耐药基因或耐药菌传播的重要介质和储库，给人类健康和公共卫生安全带来巨大威胁。除畜禽养殖常用抗菌药物的各类耐药基因外，临床上重要的抗生素耐药基因如碳青霉烯类耐药基因也可从环境中分离获得。目前研究从统计学层面分析得到畜禽养殖环境高水平的耐药基因污染现状是多方面因素共同作用的结果，但是对其形成机制研究较少。