冠状病毒(Coronavirus，CoV)属于冠状病毒科、冠状病毒属，是一类具有囊膜包裹的线性单股正链RNA病毒，在自然界广泛存在，是目前已知的RNA病毒中基因组最大的病毒^[1]。据世界卫生组织统计数据，在过去的20年里，有多次冠状病毒暴发，如2002年记载的严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)^[2]和2012年首次发现中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)^[3]。冠状病毒可感染人、蝙蝠、猫和小鼠等哺乳动物及鸟类，引起不同程度的呼吸系统、消化系统、神经系统症状等^[4]。该病毒的不断出现且流行，对公共卫生构成严重威胁。

人类冠状病毒(HCoVs)是一组重要的冠状病毒，与多种不同严重程度的呼吸系统疾病相关，包括普通感冒、肺炎和支气管炎^[5]。由于其基因组核苷酸高替换率和重组，HCoVs被认为是进化较快的病毒之一。截止目前，已报道了6种HCoVs，即HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoVOC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV；其中HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKU1在人群中广泛存在，约占人类普通感冒感染率的1/3^[6]。2019年12月，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)首次暴发后迅速席卷全球。疫情发生后，我国多省市迅速启动Ⅰ级预警。作为一种新型病毒，目前还没有针对SARS-CoV-2引发疾病的特效治疗方法。对SARS-CoV-2结构蛋白及受体功能的研究，包括与宿主互作致病机制研究，对预防和治疗具有重要的指导意义。本文对SARS-CoV-2感染和复制加以综述，旨在为获得病毒侵染宿主细胞致病机制的探究提供理论依据，也为特效药物的研发提供基础支持。

1 冠状病毒 1.1 冠状病毒形态结构

冠状病毒病毒粒子呈球状或椭圆形，具有多形性，直径为60–220 nm。病毒包膜上存在棘突，电镜下呈皇冠状，不同的冠状病毒的棘突存在差异。根据其形态学特征，1975年国际病毒命名委员会正式命名为冠状病毒。

冠状病毒病毒粒子由包膜、透明中间带和内部核衣壳组成。包膜为双层脂，包括纤突蛋白(Spike protein，S)、包膜蛋白(Envelope protein，E)和膜蛋白(Membrane protein，M)三种主要糖蛋白，部分毒株还有HE蛋白(Haemagglutinin- esterase)，属Ⅰ型糖蛋白。病毒核酸可与核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，N)结合，N蛋白是一种碱性磷蛋白，主要与免疫机制相关。S蛋白为包膜外的棒-球形三聚体糖蛋白，其中S1亚基形成球状头结构，S2亚基形成跨膜柄。在冠状病毒感染宿主的过程中，大多数β属冠状病毒S蛋白在侵染过程中都会分裂为S1和S2，S1亚基与细胞表面受体结合，S2亚基则介导膜融合，协助病毒进入细胞。E蛋白散在分布于病毒包膜上，是一种膜整合蛋白。M蛋白是跨膜蛋白，在病毒的包膜形成与出芽过程中起重要作用^{[1, 7]}。冠状病毒的主要结构蛋白基因一般按照5′至3′以S、E、M和N的顺序排列^[1]。

1.2 冠状病毒基因组特征

冠状病毒粒子内部有一个螺旋对称的核衣壳，包裹着单链正义RNA基因组，长度约为27–31 kb。RNA链5′端有甲基化帽子结构，3′端有polyA尾巴结构，其基因组RNA自身具有翻译模板的作用。复制酶和转录酶是由基因组编码、翻译形成的蛋白，下游开放阅读框的病毒产物均来自于亚基因组mRNA。在冠状病毒中，复制酶基因约占基因组5′端的2/3，由两个重叠的开放阅读框(ORFs) ORF1a和ORF1b组成，共编码16个非结构蛋白(Nsps)。其余的冠状病毒基因组RNA编码冠状病毒典型的4种结构蛋白。此外，在结构蛋白基因中还分布有多个副ORFs，其数量和位置因CoV的种类而异^[8-9]。

冠状病毒在侵染细胞时，通过膜融合内吞作用进入细胞，病毒的复制基本在胞浆内进行。从病毒RNA出发，完成宿主体内多蛋白1a/1ab (pp1a/pp1ab)的合成，转录通过双膜囊泡中的复制转录复合物和亚基因组RNAs序列的合成进行。值得注意的是，转录终止发生在转录调控序列上，位于ORFs间，作为亚基因组mRNA产生的模板。在非典型CoV基因组中，至少有6个ORFs存在。其中，ORF1a和ORF1b之间的移码指导pp1a和pp1ab多肽的产生，pp1a和pp1ab多肽由病毒编码的类糜蛋白酶或主蛋白酶处理，以及类木瓜蛋白酶用于产生16种Nsps^[10]。

2 新型冠状病毒

Chan等^[11]从非典型肺炎患者中分离出的SARS-CoV-2基因组与蝙蝠SARS样CoVZXC21的核苷酸同源性为89%，与人SARS样CoVZXC21的核苷酸同源性为82%。SARS-CoV-2感染者临床体征主要以发热和咳嗽为主^[12]，且重症患者更容易出现呼吸困难^[13]。在与流感病毒共感染的病例中，SARS-CoV-2对上呼吸道的敏感性明显降低^[14]，提示对SARS-CoV-2的检测仍存在相当大的不确定性，需要进行更广泛的病毒检测。

2.1 SARS-CoV-2基因组特征

通过基因序列比对，证实SARS-CoV-2与SARS同属冠状病毒β属。该病毒与SARS-CoV和MERS-CoV具有同源性(79%和51.8%)^[15]。Gianguglielmo等^[16]对数据库中52株病毒进行了全基因组分析，确定SARS-CoV-2基因组全长为29.9 kb，而SARS-CoV和MERS-CoV的基因组分别为27.9 kb和30.1 kb^[17]。SARS-CoV-2基因组mRNA携带一个保守的前导序列，9个转录调控序列和2个末端非翻译区域(UTRs)，9个嵌套的亚基因组mRNA共表达12个假定的功能性ORFs。5′和3′ UTRs分别为265和358个核苷酸，5′和3′ UTRs序列与其他βCoVs的核苷酸相似度为83.6%。在基因组5′-2/3的区域内，由部分重叠的5′端ORF1a/b编码的大型复制酶聚蛋白pp1a和pp1ab被蛋白酶水解成16个Nsps。4个结构蛋白按照S、E、M、N的顺序排列在后1/3处，未发现HE蛋白编码基因^[11]。

目前，对于SARS-CoV-2转录组分析尚不清晰。Narry等^[18]利用DNA纳米球测序和纳米孔RNA直接两种互补的测序技术，展示了高分辨率的SARS-CoV-2转录组和表位转录组。定量分析结果显示，N是表达最丰富的转录本，其次是S、7a、3a、8、M、E、6和7b。同时，借助纳米孔测序对单个分子“从头到尾”测序的优势，研究人员发现病毒RNA的poly(A)尾巴平均由47个腺苷酸构成，全长的病毒RNA比亚基因组RNA的poly(A)尾巴更长。修饰后的RNA的poly(A)尾巴比未修饰的RNA短，证实修饰后的RNA与3′尾巴之间存在相关性。此外，研究还发现病毒转录本上至少有41个RNA修饰位点，其中AAGAA是较常见的基序。除了标准基因组和9个亚基因组RNA外，SARS-CoV-2还产生编码未知ORFs的转录本。

2.2 SARS-CoV-2编码蛋白特性

研究病毒蛋白结构特征是研究其发病机制的基础。S蛋白由S1和S2亚基组成，S1亚基包含N端结合域和受体结合域，其中受体结合基序负责与受体相互作用以进入宿主体内。S2亚基在整合病毒与宿主细胞膜融合过程起关键作用，它包含融合肽、中心螺旋和连接域^[19]。当SARS-CoV-2的S蛋白处于融合后的状态，S1分离，S2发生构象变化，从压缩的形态向柄状形态延伸。在SARS-CoV-2中，S2亚单位高度保守。与受体的结合打开了S1的受体结合域，从而促进S1复合物和S1单体从融合前的突起中释放出来，触发融合前到融合后的构象转变^[20]。

Nsps是重要的参与冠状病毒复制的酶，但不参与病毒颗粒的组装^[1]。Yuan等^[21-22]根据SARS冠状病毒基因组特征对SARS-CoV-2基因组的16个Nsps功能进行了初步分析和推断。这些假定的Nsps包括两种病毒半胱氨酸蛋白酶，即Nsp3 (木瓜蛋白酶样蛋白酶)和Nsp5 (糜蛋白酶样蛋白酶、3C样蛋白酶或主蛋白酶)、Nsp12 (RNA依赖性RNA聚合酶RdRp)、Nsp13 (螺旋酶)和其他可能参与病毒转录和复制的Nsps。SARS-CoV-2和SARS冠状病毒ORFs和Nsps之间没有显著差异，主要区别在于ORF3b、S蛋白和ORF8，但在此前被认为是重组热点的S1蛋白和ORF8中变化尤为明显^[11]。在蛋白质水平上，Nsp7、Nsp13、包膜、基质或辅助蛋白p6和8b中没有发生氨基酸替换，但在Nsp2、Nsp3、S蛋白、基础亚结构域，即受体结合域中均有氨基酸突变。

3 SARS-CoV-2感染与复制

病毒感染宿主细胞包括病毒吸附、入侵、遗传物质释放、基因组转录和复制、组装和出芽等过程。这一过程对于病毒的生存和致病性至关重要，这个过程需依赖宿主细胞蛋白的参与^[23]。作为细胞内专性寄生囊膜病毒，SARS-CoV-2主要通过膜融合的方式利用宿主细胞机制完成自身复制^[6] (图 1)。

3.1 SARS-CoV-2细胞受体

宿主受体是决定病毒致病性、组织趋向性和宿主范围的主要因素^[24]。冠状病毒感染有明显的宿主特异性和组织嗜性，这主要取决于病毒囊膜表面的纤突蛋白S和宿主细胞膜表面受体的特异性结合和后续的膜融合过程^[25]。

ACE2 (血管紧张素转化酶，Angiotensin Ⅰ converting enzyme peptidyl-dipeptidase A 2)是目前发现的SARS-CoV-2吸附、入侵宿主细胞的主要受体^[26]。该基因编码的蛋白质属于血管紧张剂转化酶家族成员，在肺、心脏、肾脏和肠道广泛分布^[27]。截至目前，关于ACE2的功能主要分为3种，作为肾素-血管紧张素系统调节因子，靶向血管紧张素Ⅱ，保护心血管系统^[28]；作为SARS病毒受体，在病毒感染后肺衰竭的致病机制中发挥作用^[20]；与氨基酸转运蛋白结合，促进肾脏和肠道的氨基酸吸收^[29]。Yan等^[30]利用冷冻电镜技术成功解析了人ACE2蛋白全长。ACE2蛋白主要是以二聚体的形式存在，一个ACE2二聚体能同时结合两个病毒S蛋白三聚体，且开放和闭合两种构象都有与冠状病毒结合的界面。从S蛋白与ACE2蛋白的结合形态来看，病毒S蛋白横跨在ACE2蛋白的表面，与SARS病毒结合方式相似。

3.2 SARS-CoV-2 S蛋白与受体互作

S蛋白是位于冠状病毒最外层的多功能蛋白，促进病毒和细胞表面受体介导的抗原和膜融合，还是诱发细胞免疫和体液免疫的主要成分^[31]。冠状病毒S蛋白主要以三聚体的形式存在，每个单体中约1/4氨基酸构成了受体结合域^[20]。Whittaker等^[32]提出了S蛋白的两个关键的裂解位点，一个发生在S1/S1边界，另一个发生在S2的R797处，共同介导了膜融合和病毒感染。CoV进入细胞取决于S蛋白的表面单位S1与细胞受体的结合，这有助于病毒附着到靶细胞表面。此外，进入需要通过细胞蛋白酶启动S蛋白，这需要在S1/S2和S2′位点进行蛋白质切割，并促进病毒和细胞膜融合，这一过程由S2亚单位驱动^[33]。SARS-CoV-2 S蛋白的受体结合域由4个扭曲的反向平行β片(β1、β2、β3和β6)形成，以短螺旋和环为核心，在核心链β3和β6之间，有一个包含短β4和β5链、α4和α5螺旋和环的插入，该插入片段是细胞受体与SARS-CoV-2结合的大部分接触残基的受体结合基序^[34]。

研究表明SARS-CoV可利用ACE2作为受体^[35-36]，通过跨膜蛋白酶/丝氨酸亚家族成员2 (TMPRSS2)与细胞表面的ACE2共域化^[32]，并结合CD209L分子，形成SACE2-CD209L复合物，通过网格蛋白和窝蛋白非依赖型内吞途径发生入胞^[37]。MERS-CoV则利用二肽酰肽酶4 (DPP4/CD26)进入细胞^[38]，DPP4主要存在于下呼吸道、肾脏、小肠、肝脏和免疫系统的细胞中^[39]。基于上述研究结果，Hoffmann等^[26]对S蛋白结合ACE2进入细胞过程中可能互作的宿主因子进行探究，结果证实SARS-CoV-2通过受体ACE2粘附细胞，丝氨酸蛋白酶TMPRSS2和胞内半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶B和L (CatB/L)均可用于S蛋白启动，抑制这两种蛋白酶是阻断病毒进入细胞的必要条件。然而，只有TMPRSS2活性对病毒在受感染宿主中的侵染和发病机制是必需的，而CatB/L活性则是非必需的。因此，TMPRSS2抑制剂可以作为临床治疗的一种选择。宿主受体CD26从倒数第2位为L-脯氨酸或L-丙氨酸的多肽中切割氨基末端二肽，导致T细胞活化，从而在病毒感染中起免疫调节因子作用^[40]。Vankadari等^[41]基于计算模型的选择性对接建立了SARS-CoV-2 S蛋白和CD26互作的三维结构模型，S蛋白与CD26对接的复杂模型显示了蛋白间的大界面，这表明模型结构中的S1域环与CD26表面之间可能存在紧密的相互作用。

Wrapp等^[42]利用冷冻电镜和表面离子共振技术测定了S蛋白的3.5Å 分辨率，通过生物物理分析S蛋白与ACE2的亲和力。结果显示，SARS-CoV-2 S蛋白与ACE2的平衡解离常数约是15 nmol/L，比ACE2与SARS-CoV的亲和力高10–20倍，推测这可能是新冠肺炎的传播能力强于SARS的原因。研究发现，相较于SARS-CoV和MERS-CoV新冠病毒S蛋白存在Furin蛋白酶切位点，该突变是大部分冠状病毒β属所不具有的突变，这一发现暗示这种变异有可能增强SARS-CoV-2的传播能力^[43]。随后，Hoffmann等^[44]验证了该推测，他们发现细胞蛋白酶Furin可以裂解S1/S2，而且这种裂解对于S蛋白介导的细胞融合和进入人肺细胞至关重要。此外，优化S1/S2位点增加了细胞-细胞融合，而非病毒-细胞融合，这表明病毒的变异很可能表现出细胞-细胞扩散增加和潜在的毒性改变。但是，通过对Vero-E6细胞培养的SARS-CoV-2的菌斑纯化，发现了一系列含有在S1/S2连接处分别有15–30 bp的缺失或点突变的菌斑。值得注意的是，某些缺失删除了S蛋白S1/S2连接区域的PRRA基序。SARS-CoV-2的一个独特特征是在S蛋白的S1和S2亚基连接处的多碱性切割位点。缺失、突变或S1/S2连接处的其他突变体中缺失30 bp可能会减弱病毒的致病性^[45]。因此，在无症状感染病例中筛选这些变异的流行是很有必要的，评估其作为减毒疫苗或实验室工具的潜力。

3.3 Nsp参与病毒复制过程

SARS-CoV-2的复制是由Nsp的多亚基复制/转录复合物共同介导的^[46]，该复合物的核心成分是依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)的催化亚基(Nsp12)，是重要的病毒靶点之一^[47-48]。Nsp12活性小，其功能需要包括Nsp7和Nsp8在内的辅助因子，增加RdRp与模板绑定的过程^[49]。Yin等^[50]在昆虫细胞共表达Nsp12、Nsp7和Nsp8复合物，结果显示纯化后的Nsp12单独与5′碱基的部分双链RNA模板引物结合时几乎没有活性，类似于SARS-CoV，而Nsp7和Nsp8的存在增加了Nsp12的活性。Nsp12-Nsp7-Nsp8复合物在加入三磷酸腺苷后，在聚脲嘧啶核苷酸模板上也表现出RNA聚合活性，与SARS-CoV的RdRp结构不同。模板RTP-RdRp结构在模板链中含有14个碱基RNA，在引物链中含有11个碱基RNA，双链RNA螺旋由模板引物RNA的11个碱基对组成。在模板引物RNA和Nsp12之间观察到广泛的蛋白质RNA相互作用，共有29个Nsp12残基直接参与RNA的结合。值得关注的是，Nsp7和Nsp8没有介导RNA相互作用，尽管这两种蛋白质是RdRp结合RNA所必需的，从Nsp12到模板引物RNA的任何碱基对都没有接触，这说明RdRp与RNA的序列无关。这与RdRp在伸长阶段的酶活性不需要特定的序列是一致的。SARS-CoV-2 RNA的合成与由修饰性内质网膜组成的复制细胞器有关，它们被转化为含有病毒双链RNA的双膜囊泡和其他膜元素，一起形成网状泡状网络，且双膜囊泡的形成仅在冠状病毒中发现。含有跨膜结构域的SARS-CoV的Nsp3、Nsp4和Nsp6都是必需的^[51]。

除了在病毒复制和转录中的作用外，一些CoVs的Nsp15及其同源物Nsp11在动脉病毒中的作用已被证实可拮抗先天免疫反应。过表达SARS-CoV的Nsp15可显著抑制Ⅰ型干扰素的产生，其机制可能是通过抑制MAVS诱导的细胞凋亡^[52]。Nsp可在病毒致病性中起关键作用，Angeletti等^[53]分析了新冠病毒ORF1ab编码Nsp2和Nsp3的跨膜螺旋段，发现723 (Nsp3-543)的位置是丝氨酸而不是甘氨酸残基，1010 (Nsp3-192)的位置是脯氨酸而不是异亮氨酸。这两个突变位点均在与SARS-CoV中的磷酸酶相似的蛋白质附近，在病毒感染细胞和复制过程中起关键作用^[54]。蝙蝠SARS-CoV 501位是非极性氨基酸，而SARS和SARS-CoV-2在该位置是极性氨基酸，推测其可以赋予蛋白质更高的稳定性。该突变位点落在Nsp2的区域内，该区域与禽传染性支气管炎病毒相似的内泌体相关蛋白同源，在病毒致病性中起关键作用^[55]。Nsps可参与CoVs的复制及致病过程，研究Nsps与机体蛋白复合物的分子间相互作用，探讨Nsps影响机体的致病机理和拮抗天然免疫反应机制，也是重要的研究方向。

4 展望

新型冠状病毒作为一种新发传染病，具有全球流行的能力，还会引发较多的临床并发症。但目前尚未研制出疫苗及特效药。除已知ACE2受体外，考虑到CD26与S蛋白之间的对接大界面，是否CD26有可能是潜在受体？与CD26的互作会不会影响与机体细胞免疫反应？S1/S2裂解位点的氨基酸缺失、突变或Furin位点的增加，对SARS-CoV-2的复制都具有一定的影响，可能是作为疫苗或临床治疗干预的靶点选择。结合Nsps在CoVs致病性中的关键作用，是否同样在SARS-CoV-2致病过程中也发挥作用？Nsps和S蛋白受体结合域的关键氨基酸位点的突变是否会导致病毒致病性增强和跨宿主传播？阐明SARS-CoV-2与病毒入侵、基因组复制等互作的细胞因子，可能为治疗靶点的发现提供新的思路。探索病毒与机体免疫相关的细胞因子的互作机制，将有利于筛选中和抗体等。