随着我国城市建设的发展，城市污水处理面临很多挑战，特别是随着城市化进程加快，污水处理负荷越来越大，污水处理厂提标升级改造任务也十分紧迫。活性污泥法已成为城市生活污水和工业废水处理的主流工艺，而微生物是污水生物处理系统中碳、氮、磷等污染物去除的主体，污泥沉降性能的变化与系统中优势菌群的演替密切相关^[1]。高通量技术的发展极大地扩充了对活性污泥群落多样性的认识，研究表明，不同类型污水、不同废水处理系统或城市的地理位置及环境条件都能够影响活性污泥微生物群落组成^[2-5]，同一种废水也可能随水质变化而发生微生物群落变化，以维持污水处理系统的稳定运行^[6]，因此，深入了解活性污泥中微生物群落特征是理解生物处理污水本质的关键，同时也可为污水处理系统的优化及稳定运行提供理论依据、合理建议及技术帮助^[7-8]。光化合反应生物酶系统(Actinic reaction enzyme system，ARES)由光合反应器和生物酶构成，可在传统活性污泥法的基础上设置，该系统采用电气石与发热板为污泥中微生物提供适合生长的光线和热能，通过气管和曝气盘为微生物提供充足的氧气，可提高污泥中微生物的活性及稳定性、消减污泥中的臭味等^[9]。一些城市因管网雨污分流不彻底，很多污水处理厂在运行过程中因碳氮比的失调无法正常运行，不能满足达标排放要求，因此需通过投加碳源的方式运行，但也增加了污水厂的运行成本。如重庆市某生活污水处理厂运行的A²/O工艺，总规模为50 000 m³/d，通过外加碳源的方式，基本能满足城镇污水处理厂污染物排放一级A标准。而应用ARES技术在该污水处理厂升级改造后，在不投加外源碳源情况下，便可稳定运行，污水处理效果明显改善；尤其是与改造前相比，总氮在改造后的出水基本维持在10 mg/L以下，满足了《四川省岷江、沱江流域水污染物排放标准》(DB51/2311-2016)^[10]中对氮的控制标准。

本文依托Illumina-HiSeq 2000高通量测序平台，利用细菌的16S rRNA基因序列和真菌的内转录间隔区ITS序列，分析探讨了重庆某污水处理厂在ARES系统启动前后该污水处理厂活性污泥微生物群落结构特征及其与污水处理效果的相关性，以期获得更多更全面的活性污泥微生物群落结构和多样性信息，并为ARES技术在污水处理中的规模化推广应用提供理论依据。

重庆市某污水处理厂引入ARES系统改造后相比在原A²/O工艺增加了光化生物池，具体为增加污泥回流系统，在外回流检查井安装抽水泵，将5%的回流污泥引入光化生物池，光化生物池再通过内回流和外回流至A²/O工艺各单元，改造后的污水处理工艺如图 1所示。

图 1 改造后的污水处理工艺 Fig. 1 The improved process of sewage treatment.

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该污水处理厂引入ARES系统前后的进出水水质情况如表 1所示。改造前数据为2018年1月至2018年8月污水处理厂进出水水质数据，改造后数据为2018年9月至2019年5月污水处理厂进出水水质数据，数据来源由污水处理厂提供。该污水处理厂在ARES启动前通过补充外源碳源葡萄糖，维持了系统出水水质达到《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)^[11]一级A标准，而ARES启动后能在不外加碳源的条件下，使系统出水水质达到《四川省岷江、沱江流域污染物排放标准》(DB51/2311-2016)^[10]标准。

活性污泥样品采自重庆某污水处理厂ARES启动后正常运行期(2019年5月)，采样点为光化生物池(N1)、厌氧池(N2)、缺氧池(N3)、好氧池(N4) 4个功能单元；该污水处理厂改造前的活性污泥样品采样时间为2018年5月份，采样点为厌氧池(N5)、缺氧池(N6)、好氧池(N7) 3个功能单元。以每个单元多点混合的方式进行采集，活性污泥样品采集后立即置于冰盒带回放置−80 ℃条件下保存。

采用QIAGEN DNeasy PowerSoil Kit(100)试剂盒提取样本DNA，采用Bio-Tek微孔板分光光度计对DNA浓度和质量进行检测。以提取的DNA为模板，分别用343F (5′-TACGGRAGGCA GCAG-3′)和798R(5′-AGGGTATCTAATCCT-3′)扩增细菌16S rRNA基因片段。用ITS1F(5′-CTTG GTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2-(5′-GCT GCGTTCTTCATCGATGC-3′)扩增真菌ITS rRNA基因片段^[12]。基于Illumina-HiSeq 2000测序平台进行高通量测序。根据测序下机数据，经过Trimmomatic软件^[13]对原始双端序列进行去杂，进行质量控制分析，利用FLASH软件对通过质量初筛的双端序列进行拼接，QIIME软件^[14]对获得的序列以97%的序列相似度进行归并和可操作分类单元(Operational taxonomic units，OTUs)划分。

本研究中A²/O工艺污水处理厂在ARES系统启动前后厌氧、缺氧、好氧单元，包含ARES启动后的光化生物池共7个单元样品测序下机数据进行质控分析以获得有效序列，并以≥97%序列相似性为阈值划分OTUs，共获得2 264个细菌OTUs、1 630个真菌OTUs (表 2)，Alpha多样性指数分析表明，各单元样品的测序深度指数(Good’s coverage)覆盖度均高于98%，表明满足测序深度。Simpson为均匀度指数，Shannon指数同时衡量丰富度和均匀度，反映群落多样性情况，分析结果表明，ARES系统启动前后不同工艺单元样品中细菌群落间和真菌群落间的多样性及均匀度指数(Shannon/Simpson)无显著差异，说明本研究中ARES系统启动对A²/O工艺过程活性污泥中的微生物多样性及均匀度无显著变化。

7个单元样品中细菌的Rank-Abundance曲线在横坐标的宽度和线条陡度走势相近(图 2A)，进一步说明ARES系统启动对各单元物种丰富度和均匀度影响不大，只是光化生物池和缺氧区单元细菌丰富度与启动前后其他单元的物种丰富度略有区别。7个单元样品中真菌的Rank-Abundance曲线在横坐标的宽度和线条走势呈显著差异，ARES系统启动后各单元的真菌物种丰富度升高，均匀度呈更均匀趋势(图 2B)。

图 2 不同样品的Rank-Abundance曲线 Fig. 2 Rank-Abundance curves of different samples. (A) Rank-Abundance curves of Bacteria. (B) Rank-Abundance curves of Fungi.

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在A²/O工艺ARES启动前后各工艺单元活性污泥样品中共注释到36个门类364个属的细菌，通过堆叠柱形图展示平均相对丰度前15的微生物类群，在细菌门水平(图 3)上，丰富类群(平均相对丰度≥1%)的门类主要有9个，分别为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)、厚壁菌门(Firmicutes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、绿菌门(Chlorobi)和绿弯菌门(Chloroflexi)，这9个门类占整体测序细菌总量的96%–98%。其中，变形菌门(Proteobacteria)在ARES技术启动前后各单元的相对丰度为45.90%–55.33%，占主要优势，变形菌门中与脱氮相关^[15-16]的β-变性菌纲由启动前的17.12%– 18.09%上升到启动后20.57%–21.90%。拟杆菌门(Bacteroidetes)在ARES启动后厌氧单元的相对丰度由启动前的19.43%上升到32.41%。放线菌门(Actinobacteria)在厌氧单元的相对丰度呈现较明显变化由启动前的13.00%下降为启动后的3.40%，在光化器单元相对丰度为15.44%，ARES启动前后其他单元该菌门的相对丰度维持在12.03%–13.29%。硝化螺旋菌门(Nitrospirae)在ARES技术启动前后各单元相对丰度无显著差异，在2.83%–3.45%左右。Firmicutes门在厌氧区单元由启动前的2.33%降至ARES启动后的0.88%，ARES启动前后在其余单元启动前后的相对丰度变化不显著，维持在2.39%–2.65%。芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、绿菌门(Chlorobi)和酸杆菌门(Acidobacteria)在ARES启动后相对丰度均有升高，芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)由启动前的1.31%–1.44%上升到启动后的2.74%–3.77%，绿菌门(Chlorobi)由启动前的0.86%–1.12%上升到启动后的1.56%–3.52%，酸杆菌门(Acidobacteria)由启动前的0.86%–0.89%上升到启动后的1.95%–2.74%。绿弯菌门(Chloroflexi)在ARES启动前后各单元相对丰度变化不显著，基本维持在0.27%–1.04%。螺旋菌门(Spirochaetae)在ARES启动后各单元的相对丰度略有下降，由启动前0.78%–0.95%下降为0.22%–0.38%。

图 3 细菌在门水平的相对丰度 (top15) Fig. 3 Relative abundance of bacteria at the phylum level (top15).

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在细菌属水平(图 4)上，ARES启动前后各单元样品相对丰度变化明显，其中ARES启动前的丰富类群Haliangium属和Denitratisoma属变化较大，其中Haliangium属在ARES启动后各单元中的相对丰度呈现显著下降，由启动前的8.04%–9.19%下降到启动后的3.35%–5.41%。Denitratisoma属在ARES启动后各单元相对丰度升高，由启动前的3.82%–4.09%上升到启动后的4.85%–7.27%。脱氯菌属Dechloromonas在ARES启动前相对丰度为0.67%–0.76%，ARES启动后光化生物池相对丰度达到2.18%，进而使得启动后各功能区相对丰度上升，尤其是缺氧区和好氧区分别上升至2.14%和1.836%。硝化螺菌属Nitrospira ARES启动前后相对丰度变化不大，均在3%左右。Nakamurella属在启动前相对丰度为0.96%–1.11%，ARES启动运行10个月后，系统中该菌属除了厌氧区相对丰度降为0.55%外，其余各单元的相对丰度上升到3.14%–3.43%，其中光化器系统中该菌属的相对丰度为3.58%。Ferruginibacter属，启动前相对丰度为0.36%– 0.48%，ARES启动运行10个月后，该菌属的相对丰度上升到1.22%–3.49%，其中光化器中该属的相对丰度为1.65%。弓形菌属Arcobacter，ARES启动后各单元相对丰度呈现显著下降，由启动前的1.71%–3.67%下降到0.02%–0.31%，其中光化生物池中该菌属的相对丰度仅为0.02%。

图 4 细菌在属水平的相对丰度(top15) Fig. 4 Relative abundance of bacteria at the genus level (top15).

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真菌群落是水生生物食物网的重要组成部分，在淡水湖生态系统中的养分循环和物质转化过程中发挥着重要作用^[17]，也是难降解有机碳的主要分解者^[18]。对A²/O工艺7个单元活性污泥样品真菌群落ITS测序，以97%的序列相似度进行OTUs划分聚类，各样本OTUs个数分布在629–771之间，共注释到9个门类，其中丰富类群(平均相对丰度≥1%)有7个门类14个种，通过堆叠柱形图展示平均相对丰度前15的微生物类群。属于丰富类群的门类为子囊菌门(Ascomycota)、接合菌门(Zygomycota)、罗兹菌门(Rozellomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、球囊菌门(Glomeromycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和芽枝霉门(Blastocladiomycota)。这7个门类占整体测序真菌总量的79%–92%。ARES启动前后在门水平上的相对丰度差异显著(图 5)，ARES启动后相对丰度显著下降的门有罗兹菌门(启动前45.36%–48.05%下降到启动后1.28%–2.65%)和子囊菌门(厌氧区启动前26.66%下降到启动后13.27%)。ARES启动后相对丰度显著升高的门有接合菌门(缺氧区由启动前0.49%上升到启动后的33.77%)和球囊菌门(厌氧区由启动前0.02%上升到启动后的13.88%)。而担子菌门在ARES启动前后各单元相对丰度无明显变化，启动前为14.66%–17.70%，启动后为12.20%–20.95%。

图 5 真菌在门水平的相对丰度(top15) Fig. 5 Relative abundance of Fungi at the phylum level (top15).

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在真菌属水平上(图 6) 7个单元活性污泥样品真菌群落相对丰度大于1%的菌包括14个属，这14个属占整体测序真菌总量的80%–91%，其中罗兹菌属Rozellomycota sp.在启动前真菌群落内的相对丰度占绝对优势为45.36%–48.05%，而ARES启动后相对丰度显著降低为1.28%–2.65%。虫霉菌属Entomophthoraceae sp.和球囊菌属Glomeromycota sp.在启动前不同工艺单元几乎检测不到，相对丰度均≤0.05%，但是在ARES系统运行10个月后，系统中虫霉菌属Entomophthoraceae sp.相对丰度上升至31.39%–37.55%左右，占有绝对优势，球囊菌属Glomeromycota sp.相对丰度由ARES启动前0.01%–0.02%上升为启动后的6.28%–13.85%。Xylochrysis lucida在ARES启动后系统中各单元相对丰度呈显著下降，由启动前的4.62%–6.43%下降到0.36%–2.75%。

图 6 真菌在属水平的相对丰度(top15) Fig. 6 Relative abundance of Fungi at the genus level (top15).

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基于Bray-Curtis相异(不仅考虑样本中物种的有无，而且还考虑不同物种的相对丰度)和Jaccard (只考虑样本中物种的有无，不考虑相对丰度)相似距离矩阵进行主坐标分析(Principal coordinates analysis，PCoA)，结果表明，两种分析在第一主分上，ARES启动前和启动后的群落结构均可显著分离(图 7)，说明ARES启动前和启动后的群落结构间存在明显差异。层次聚类可以直观地展示各样本群落结构的相似程度(图 8)，可见ARES启动前明显区别于启动后，ARES启动后各功能区较为相似，启动前各功能区更相似，即ARES启动显著影响A²/O工艺各单元微生物群落结构。

图 7 基于Bray-Curtis相异和Jaccard相似距离矩阵的主坐标分析(PCoA) Fig. 7 Principal coordinates analysis (PCoA) based on Bray-Curtis dissimilarity and Jaccard similarity distance matrices. (A) PCoA based on Bray-Curtis dissimilarity of Bacteria. (B) PCoA based on Jaccard similarity distance matrices of Bacteria. (C) PCoA based on Bray-Curtis dissimilarity of Fungi. (D) PCoA based on Jaccard similarity distance matrices of Fungi.

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图 8 基于非加权组平均法(UPGMA)和Bray-Curtis距离矩阵对各样本群落相似性的层次聚类分析 Fig. 8 Hierarchical clustering based on UPGMA and Bray-Curtis distance matrix.

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ARES系统作为新型处理工艺由光化合反应器和生物酶构成，该系统通过电气石和发热板与传统的曝气方式相结合，为污泥中微生物提供适合生长的光线和热能，具有高效能、抗冲击能力强、出水稳定等特点^[9]。从污水处理厂ARES系统改造前后进出水总氮浓度及去除率中可以看出(表 1)，出水总氮的去除率由改造前(外加碳源)的69.2%上升到ARES启动后(无外加碳源)的73.1%，ARES系统改造后出水总氮维持在8.96 mg/L，满足《四川省岷江、沱江流域污染物排放标准》(DB51/ 2311-2016)^[10]中出水总氮10 mg/L以下的标准。

微生物是污水生物处理系统中碳、氮、磷等污染物去除的主体。通过对ARES启动前后系统各单元中群落结构及优势菌群分析表明，变形菌门(Proteobacteria)在ARES技术启动前后各单元的相对丰度为45.90%–55.33%，其中与脱氮相关的β-变性菌纲在ARES系统启动后相对丰度升高，有研究表明该菌门在好氧和厌氧环境中均可存活，在元素化学循环中起到重要作用^[19]。拟杆菌门(Bacteroidetes)在该污水处理厂的相对丰度与已报道的城市污水厂活性污泥处理系统中的微生物类群的分布规律相一致^{[5, 20]}。拟杆菌门所含细菌大多可以碳水化合物、蛋白质为底物，代谢生成糖、氨基酸、有机酸等，供聚磷菌吸收^[21]，同时拟杆菌门数量的增加有利于缓解菌群的代谢紊乱并提升菌群的新陈代谢水平^[22]，进而强化菌群降解有机污染物的能力^[23]。绿弯菌门(Chloroflexi)是严格的厌氧微生物，是一类构成污泥菌胶团絮状体的重要菌种，可以将CO₂转变为丙酮酸而具有固碳的作用，丝状细菌属于该门类^[24-25]，有多种代谢功能^[26]，该菌门在ARES启动前后各单元相对丰度变化不显著，基本维持在0.27%–1.04%。从属水平看，Denitratisoma属归属红环菌科(Rhodocyclaceae)，据报道有反硝化功能，但是目前对这类反硝化细菌研究较少^[27]，其在污泥系统中的功能与活性有待后续研究。亚硝酸盐氧化菌(NOB)主要包含硝化杆菌属Nitrobacter、硝化螺菌属Nitrospira、硝化球菌属Nitrococcus以及硝化刺菌属Nitrospina^[28]，本研究中发现ARES的启动增加了腐螺旋菌科(Saprospiraceae)、亚硝化单胞菌科(Nitrosomonadaceae)、硝化螺旋菌科(Nitrospiraceae)、红环菌科(Rhodocyclaceae)在A²/O工艺中的相对丰度，推测ARES通过上述菌群的响应提升系统总氮和氨氮的去除。Nakamurella属经常出现在许多大型污水处理厂活性污泥中，对有机物和营养物的去除起关键作用，对生物污水处理厂的系统性能直接相关^[29]，ARES启动前该菌属相对丰度为0.96%–1.11%，ARES启动运行10个月后，系统中该菌属除了厌氧区相对丰度降为0.55%外，其余各单元的相对丰度上升到3.14%–3.43%，其中光化器系统中该菌属的相对丰度为3.58%，呈显著上升，推测ARES启动促进Nakamurella菌生长，进而促进系统反硝化功能。脱氯菌属Dechloromonas归属红环菌科，其在ARES启动后呈现上升趋势，该菌属为氨氧化和反硝化除磷菌^[30]，其在活性污泥中的丰度与污水中有机物降解关系密切，在反硝化和生物除磷中有重要作用^[31]，此外，研究报道脱氯菌属Dechloromonas含量与COD去除率呈显著正相关^[32]。弓形菌属Arcobacter是许多城市污水和城市污水化学生物絮凝池活性污泥中的优势菌群，具有致病性^[33-35]，该属在ARES启动后相对丰度显著降低，推测ARES可以减少污水处理系统中包含该菌属在内的致病菌可能带来的环境风险。

此外，在生物污水处理系统中，真菌也是重要的贡献者，然而针对活性污泥中的真菌群落结构及其功能仍需要进一步探讨，与细菌相比，已知真菌会产生许多用于有机物降解和其他环境应用相关的胞外酶^[36]，真菌硝化作用比自养硝化细菌的硝化作用高1–4个数量级^[37]，有些真菌也会在污水处理过程中起反作用，如丝状真菌、致病性真菌。本研究通过真菌群落多样性结构分析表明，A²/O各工艺段在ARES启动前和启动后真菌的群落结构间存在显著差异，ARES启动后各功能区较为相似，启动前各功能区更相似；其中ARES启动抑制了活性污泥环境中罗兹菌属(Rozellomycota sp.)的相对丰度，由启动前45.36%–48.05%降低为1.28%–2.65%，相对丰度受抑制较明显的还有Xylochrysis 属，其在ARES启动后系统中各单元相对丰度呈显著下降，由启动前的4.62%–6.43%下降到0.36%–2.75%。启动后相对丰度显著上升的菌属有虫霉菌属(Entomophthoraceae sp.)和球囊菌属(Glomeromycota sp.)，特别是虫霉菌属(Entomophthoraceae sp.)相对丰度上升至31.39%–37.55%左右，每个功能单元相对丰度上升量均达到30%以上，系统中占有绝对优势。但是目前为止对于上述菌属的生理代谢及其在活性污泥中的具体功能研究还非常缺乏，本研究没能进一步展开研究讨论。

这项研究表明，ARES启动通过影响A²/O工艺系统中活性污泥微生物群落结构，激活活性污泥中对有机物和营养物质的去除起关键作用的菌群，进而影响了A²/O工艺系统性能。

ARES系统作为污水处理工艺中的新型技术，对A²/O工艺系统中活性污泥微生物群落结构具有显著调节作用，特别是真菌群落结构，进而表现出对系统中总氮去除效率的提升。活性污泥环境中复杂的微生物群落与废水中的有机营养物形成了复杂的食物链，这些微生物之间相互作用，它们的生理代谢和环境功能有待进一步验证。本研究通过高通量测序技术，鉴定了ARES对于A²/O工艺系统中活性污泥微生物菌群的影响，解析了ARES通过对污泥微生物结构组成的改变提升污水厂出水水质的理论基础，研究结果为理解ARES在污水处理系统中的作用提供了新的依据。