2019年12月初，武汉华南海鲜市场开始集中出现新型冠状病毒(SARS-CoV-2)所致肺炎(WHO定名：COVID-19)疫情，后来迅速蔓延至全国。截至2020年2月20日，我国确诊病例已累计7万余例，死亡2 000余人。2020年1月30日，世界卫生组织宣布该疫情构成国际关注的突发公共卫生事件。疫情发生后，全国多省市陆续启动重大突发公共卫生事件Ⅰ级响应，多省市大中小学幼儿园和单位延期开学、开工，旅游业暂停，部分交通设施及各类娱乐场所暂时关闭。新型冠状病毒肺炎的暴发严重威胁了人民的生命健康并且为我国经济发展带来了重创。严峻形势下，我们急需探究针对此病毒的新型药物以及有效的防控措施。本文主要介绍了亲环素A对冠状病毒复制的影响及其抑制剂的抗病毒效果，旨在为抗新型冠状病毒药物的研发提供科学依据及思路。

亲环素A (Cyclophilin A，CypA)属于Cyclophilin (Cyp)家族成员，该家族成员具有顺反异构酶活性，在生物界中广泛分布，并具有高度保守性。CypA最早于1984年由Handchumcher等从牛胸腺中提取出来并进行提纯^[1]，并发现其作为胞内蛋白对具有免疫抑制功能的环孢菌素A (Cyclosporin A，CsA)具有极高的亲和性。同年，Fischer等^[2]发现了具有肽基脯氨酰顺/反异构酶(PPIase)活性的蛋白，进一步研究表明该PPIase活性蛋白即为CypA蛋白，随后亲环素家族的其他成员相继被发现。目前已经在人体内发现了16种结构不同的Cyps家族成员(CypA、CypB、CypC、CypD、CypE、Cyp40、CypNK等)，其中，含量最多的是CypA，其含量约占细胞质蛋白总含量的0.1%–0.6%^[3]。它们都具有由约109个氨基酸构成的亲环素样结构域(Cyclophilin-like domain，CLD)^[4-5]，在哺乳动物、植物、昆虫、细菌、真菌甚至病毒中均有存在。CsA的免疫抑制作用是通过CsA、CypA和钙调磷酸酶形成三元复合物来实现的。CsA在进入体内后先与CypA结合，CsA-CypA复合物结合并抑制钙调神经磷酸酶，使其底物激活的T细胞核因子(Nudear factor of activated T cells，NF-AT)等不能被去磷酸化，导致其不能从细胞质向细胞核转位，从而在转录水平阻断淋巴细胞活化，使T细胞活化必需的一些细胞因子表达受阻^[6]。大量研究发现，CypA除了作为免疫抑制剂CsA的受体蛋白以外，还参与细胞凋亡、转录调控、信号转导、病毒复制等多种生命过程^[7-9]。

CypA能够调控多种病毒的复制。CypA可与丙肝病毒(HCV)的NS2蛋白^[10]、NS5A蛋白^[11]和NS5B蛋白产生相互作用，并被证明是HCV复制所必需的宿主因子^[12]。现有的抗HCV药物Alisporivir即是阻碍了CypA和NS5A的结合，从而影响了HCV的复制。无免疫抑制特性的Cyps抑制剂如NIM811、Debio-025和SCY-635已经进入临床试验中^[13]，有望成为今后有效的治疗药物。CypA也被发现可与人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的Gag蛋白相互作用^[14]，CypA-Gag相互作用对于人类细胞中HIV-1的复制至关重要，CsA通过阻止CypA-Gag相互作用抑制HIV-1感染^[15]，在Gag的CypA结合区中引入突变也可减少HIV-1的感染。我们实验室的研究发现，CypA也可与甲型流感病毒(IAV)的M1蛋白相互作用，并整合到流感病毒粒子中^[16]，M1蛋白在流感病毒的复制周期中起到多种功能，包括病毒的脱衣壳、转录、组装和释放^[17]。CypA主要通过加速M1蛋白的降解从而在翻译后水平上影响流感病毒的复制^[18]。同时，CypA还能够通过靶向RIG-I和MAVS的泛素化来调控RIG-Ⅰ介导的Ⅰ型干扰素的产生，从而影响IAV等病毒的复制^[19]。此外，CypA还与多种其他病毒的复制有关。例如：CypA的稳定性在VV感染的细胞中显著增加，CypA会重新定位到细胞核的外周区域，与病毒产生共定位，然后掺入病毒颗粒中并特异性地定位于核心中^[20]；CypA与VSV的核衣壳蛋白相互作用，并且与VV类似，可以掺入VSV病毒颗粒中，它可能充当核衣壳蛋白的分子伴侣，包裹基因组RNA以产生转录的功能模板^[21]；轮状病毒(RV)感染是全世界5岁以下婴幼儿急性脱水性腹泻的主要原因。RV感染可引发CypA蛋白的暂时增加。在RV感染的细胞中，CypA被募集到RV的病毒体中，并且与RV结构蛋白VP2相互作用以抑制RV感染细胞并通过其PPIase活性抑制RV复制^[22]。

值得关注的是CypA在多种冠状病毒的复制中必不可少。冠状病毒是一类具有包膜的单股正链RNA病毒，可引起多种哺乳动物(人类、蝙蝠、猫和小鼠等)以及鸟类不同程度的呼吸道、胃肠道及中枢神经系统疾病^[23]。冠状病毒主要分为4种属：α属、β属、γ属和δ属^[24]。已知可感染人类的冠状病毒有7种，分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV以及SARS-CoV-2。在冠状病毒感染过程中起作用的蛋白主要有6种，分别为核衣壳蛋白(N)、刺突糖蛋白(S)、小包膜糖蛋白(E)、膜糖蛋白(M)、多聚酶以及3CL水解酶^[25]，其中S、E、M和N蛋白为冠状病毒的结构蛋白。在冠状病毒中，三分之二的基因组位于基因组5′区域内，该区域包含开放阅读框1a (ORF1a)和开放阅读框1b (ORF1b)^[26]，它们编码RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)、解旋酶和其他非结构蛋白(Nsp)。在基因组的其余三分之一中，结构蛋白的基因以固定顺序编码：S-E-M-N，这些基因之间存在数量可变的ORF编码辅助蛋白^[27]。

HCoV-229E、HCoV-OC43于20世纪60年代被发现，主要造成普通感冒，一般不会引起严重病症。SARS-CoV是一种高度侵袭性的人类病原，可引起严重呼吸系统窘迫综合征，通常具有致命的后果^[25]。该病毒在越过物种壁垒(最有可能从蝙蝠到果子狸再到人类)后，于2003年开始流行，是第一种已知的有可能导致人类高发病率和高死亡率的疾病发生的冠状病毒^[28]，造成8 098例感染及774例死亡^[29]。由于没有高效的治疗方法，该流行病最终可以通过有效的传统公共卫生措施进行隔离得以控制。CoV-NL63、HCoV-HKU1分别于2004年^[30]和2005年^[31]被发现，易感染儿童，可能会引起严重的下呼吸道感染，如支气管炎和肺炎。2012年，中东地区出现了一种新的人类冠状病毒MERS-CoV，与SARS-CoV同样可能导致肾衰竭和急性肺炎，但死亡率更高，约为50%^[24]。2019年12月初，武汉华南海鲜市场开始集中出现不明原因的肺炎疫情，该流行病的病原体被确认为SARS-CoV-2，属于β属冠状病毒，将其全基因组核苷酸序列与β属的SARS-CoV和MERS-CoV进行比对，发现相似性分别约为70%和40%。值得注意的是，SARS-CoV-2与SARS-CoV都是主要通过S-蛋白与人血管紧张素转换酶2 (ACE2)互作来感染人的呼吸道上皮细胞^[32]。

病毒的复制大多需要宿主因子的参与，至今已有大量文章报道CypA在多种冠状病毒的复制中起着重要的作用。有关CypA可能参与冠状病毒复制的提示来自于SARS-CoV相关研究。研究人员通过表面等离子体共振生物传感技术发现CypA与SARS-CoV的N蛋白具有非常高的亲和力^[33]，并通过定点突变和亲和力的测定确定了它们的结合位点，推测CypA可能作为N蛋白的分子伴侣在复制过程中发挥着重要作用。CD147是一种Ⅰ型跨膜蛋白，已被确定为细胞外CypA的主要信号受体^[34]。尽管SARS-CoV蛋白没有直接与CD147分子结合，但是通过表面等离振子共振分析发现SARS-CoV的N蛋白能够与和CD147相互作用的CypA结合，并且CD147拮抗剂对SARS-CoV具有抑制作用。这些结果表明CD147分子在促进SARS-CoV入侵宿主细胞中发挥功能性作用^[35]，CsA可能会通过抑制CypA的功能进而抑制SARS-CoV的复制^[36]。另外，SARS-CoV Nsp1是一种体内毒力因子，其作用与免疫应答的早期阶段有关，包括对干扰素信号传导的拮抗活性和对宿主蛋白质合成的抑制作用^[37-38]，而CypA可以与Nsp1蛋白的氨基(N)末端区域互相作用并可能充当分子伴侣^[39]。这些研究为探究SARS-CoV以及其他冠状病毒感染途径提供新的提示，并进一步为抗SARS药物筛选提供一种可行的方法。

研究人员构建了分别敲低CypA和CypB的CaCo-2细胞系，通过噬斑实验观察到CaCo-2CypA细胞完全不支持CoV-NL63生长，表明CoV-NL63的复制过程功能性依赖CypA，而不是CypB^[40]。还有研究表明CypA在HCoV-229E的复制过程中也担任着重要角色^[29]。CypA不仅对于感染人的冠状病毒发挥着举足轻重的作用，它对于动物冠状病毒的复制也有一定作用。猫科动物冠状病毒(FCoV)的复制也需要Cyps的参与，过表达CypA与CypB能够明显促进FCoV的复制及其蛋白的表达，FCoV在CypA和CypB敲除细胞中的病毒载量下降了超过95% (与其在野生型细胞中相比)^[41]。

一般来说，RNA病毒基因组通常以低保真度复制并经历快速的进化变异，尽管冠状病毒编码一个校对的核糖核酸外切酶(Nsp14 ExoN)，有校对活动，可增强其大型基因组的复制稳定性，但该域内的突变亦会显著提高其突变率^[42]。病毒复制依赖于多种宿主因子，这些宿主因子是潜在的抗病毒靶点。迄今为止，既没有针对引起普通感冒的冠状病毒的药物，也没有针对高致病性冠状病毒的有效治疗药物。抗病毒药物的开发集中在病毒蛋白酶和解旋酶抑制剂的开发上，且针对病毒靶标的药物通常倾向于快速地产生耐药性。因此，将病毒复制所需的宿主因子作为靶点，可能会减少耐药性的产生，寻找这些靶点和抑制剂是当务之急。

CsA是一种众所周知的广泛应用于临床的免疫抑制药物，它与Cyps结合以抑制钙调神经磷酸酶(钙调钙蛋白激活的丝氨酸/苏氨酸特异性磷酸酶)。钙调神经磷酸酶的抑制作用阻止了NF-AT从胞质溶胶转移到核中，从而阻止了编码细胞因子(如白介素2)的基因的转录^[43]。上文中已经阐述了CypA在多种冠状病毒的复制过程中担任着举足轻重的角色，抑制其PPIase活性不仅会阻止蛋白的正确折叠，而且还会抑制许多病毒复制过程中必不可少的病毒蛋白。目前已有大量研究表明CsA是某些人类和动物冠状病毒的有效抑制剂^{[36, 39, 41]}，一些关于CsA抑制机理的研究表明这与Cyps参与病毒复制有关。

研究人员用CsA处理感染了SARS-CoV的Vero-E6细胞和293/ACE2细胞(可稳定表达SARS-CoV的受体ACE2)以及感染了HCoV-229E- GFP的Huh7细胞和感染了MHV-GFP的17CL1细胞，结果表明CsA可以抑制SARS-CoV、HCoV-229E和MHV的复制，其中对于HCoV-229E的抑制效果最好^[36]。SARS-CoV Nsp1的过度表达或SARS-CoV感染会大大增强NF-AT通路的信号传导，并增强对IL2的诱导，表明NF-AT信号通路对免疫细胞的活化有影响，从而解释了严重SARS病例中观察到的细胞因子失调和免疫依赖性发病机制。有研究表明，CsA与细胞内Cyps结合并阻断NF-AT途径，Cyps-CsA复合物也可能会抑制病毒复制所需的Cyps的其他功能^[44]。此外，研究人员发现CsA抑制了其他CoV成员的复制。MERS-CoV感染细胞后，病毒RNA合成迅速增加，在感染后的13–24 h开始出现不同程度的细胞病理学改变，加入CsA后，细胞病理现象有明显改善^[45]。CsA可以明显地抑制HCoV-NL63的复制以及病毒蛋白的合成^[40]，猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、禽传染性支气管炎病毒(IBV)及FCoV的复制也可被CsA明显抑制^{[39, 41]}。

对于具有较低致病性的病毒感染的治疗，我们希望利用CsA能够抑制PPIase活性这一特点，并且希望它不抑制免疫活性，所以目前已经开发出很多满足这些标准的CsA衍生物，包括ALV^[46]、NIM811、复合物3^[47]等。研究人员通过用ALV、NIM811以及复合物3处理转染了HCoV-229E-GFP的人类肝癌细胞(利于HCoV-229E的稳定生长)，发现这3种非免疫抑制性的CsA衍生物可以明显地抑制HCoV-229E的复制。同时，ALV也可明显地抑制HCoV-NL63的复制^[40]。另外一种新型环孢霉素衍生物STG-175，不具有免疫抑制作用，在已知同类别化合物中是一个活性很高的Cyps抑制剂，也有可能是一种潜在的抗冠状病毒药物^[48]。

严峻形势下，我们急需探究针对新型冠状病毒的新型药物以及有效的防控措施。基于已有研究结果，可以发现CypA与冠状病毒等多种病毒的关键蛋白互相作用，并且参与了多种病毒的复制过程。尽管尚不能确定CsA等CypA抑制剂抗冠状病毒的确切机制，但该类药物可能通过干扰病毒蛋白与多个蛋白家族的一个或多个成员之间的功能相互作用从而抑制冠状病毒的复制。而且，CsA是一种广泛应用于临床的老药，安全、有效、质量可控，如果能用于治疗冠状病毒引起的疾病，将大大缩短其进入临床的时间。总之，CypA在多种冠状病毒复制过程中发挥重要作用，其抑制剂将是一类非常有潜力的广谱抗冠状病毒的候选药物。CypA及其抑制剂在新型冠状病毒复制过程中的作用还有待进一步研究。