生物工程学报  2021, Vol. 37 Issue (12): 4158-4168
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引用本文
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天然产物是来源于自然界的化学物质，其多种多样的生物活性在药物发现及开发方面具有关键作用。研究表明，50%以上的小分子药物来自天然产物及其衍生物[1]。抗生素作为天然产物中的重要组成部分，是微生物生长代谢过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物。现在，通过生物合成、化学合成或半合成的具有抗菌活性的化合物被统称为抗生素[2]。自1928年首个抗生素——青霉素被发现以来，人类社会步入抗生素发现的黄金时期，超过23 000种具有不同活性的抗生素相继被发现[3]。其中核苷类抗生素是由核苷或核苷酸经过一系列修饰后所形成的次生代谢物，具有多样的生物活性，如抗菌、抗肿瘤、抗病毒、除草杀虫、免疫刺激和免疫抑制等[4-5]。
喷司他丁作为一种高效的腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase) 抑制剂，其特殊的生物活性受到了研究者们的广泛关注。1978年Warner-Lambert公司首次实现了喷司他丁的化学合成，在此之后其合成路线不断得到改进[6]。与化学合成相比，微生物发酵合成喷司他丁具有经济、绿色等优势。近10年来，喷司他丁的生物合成机制得到了阐明，而关于生物合成喷司他丁的研究主要集中在菌种选育、培养基组分与发酵工艺优化等方面，生物合成喷司他丁方面的相关综述尚未见报道。因此，本文对喷司他丁结构与活性、当前合成方法及其生物合成机制进行综述，并探讨了提高喷司他丁合成效率的相关策略，为实现喷司他丁的高效生物制造提供指导。
1 喷司他丁的发现、结构与药理活性喷司他丁是1974年由Warner-Lambert公司从抗生链霉菌Streptomyces antibioticus的发酵液中分离出来的一种天然核苷类抗生素[7]。喷司他丁作为一种强腺苷脱氨酶抑制剂，其抑制常数Ki为2.5×10-12 mol/L[8-9]。1995年，Warner-Lambert公司进一步优化喷司他丁的分离纯化过程，建立了高效的喷司他丁提取方法，提取纯度达到99.7%[10]。1998年，美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA) 正式批准了注射剂型喷司他丁(商品名Nipent) 作为临床药物上市，主要用于慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病等疾病的治疗[11-12]。
如图 1所示，从化学结构上看，喷司他丁是腺苷的结构类似物，其独特的二氮杂卓环，尤其是杂环中手性醇的R构型，使喷司他丁具有独特的生物活性，对腺苷脱氨酶有极强的抑制效果[13-14]。
喷司他丁作为一种抗代谢类抗肿瘤药物，通过抑制患者细胞内腺苷脱氨酶的活性，使体内脱氧腺苷三磷酸(Deoxyadenosine triphosphate，dATP) 的水平增高，dATP通过抑制核糖核苷酸还原酶，导致用于DNA合成的其他3种脱氧核苷三磷酸的缺乏，使DNA合成过程受阻，进而抑制淋巴细胞繁殖[15]。此外，喷司他丁与其他药物的联合用药已成为临床中常用的治疗恶性肿瘤的手段[16]。例如：喷司他丁与维奈克拉(Venetoclax) 联合治疗急性淋巴细胞白血病[17]；喷司他丁、环磷酰胺和利妥昔单抗(Rituximab)的联合用药对治疗淋巴瘤有明显的效果[18]。
2 喷司他丁的化学合成1978年，Warner-Lambert公司首次报道了喷司他丁的化学全合成路线[6]。在此之后，研究人员围绕喷司他丁的化学合成，主要针对合成路线中七元杂环结构的不稳定性、糖苷配基与七元杂环中手性醇的立体选择性等3个关键问题开展研究。1982年Warner-Lambert公司在之前的基础上进行改进，通过低温策略得到1:1糖基化产物，其反应收率为80%-95%，并选择硼氢化钠作为还原剂得到1:1的R/S产物，其反应收率为85% (图 2)[19]。但这一反应存在诸多限制，如：原料价格昂贵、易导致催化剂中毒、需多次分离纯化等。1994年，Thien等以L-乙烯基甘氨酸来合成二氮杂卓环结构，其原料可以特异性合成杂环中的R型手性醇[20]。2002年，Bristol-Myers Squibb公司为进一步提高产率，减少生产成本，以5-硝基咪唑为原料合成二氮杂卓环，该路线与Warner-Lambert的合成路线相比成本低、反应条件温和，并使反应收率提升了近一倍[21]。2002年，Reliable Biopharmaceutical公司提出利用L-酒石酸二甲酯合成喷司他丁的方法，该路线简短、原材料价格低廉，且解决了糖基化的立体选择性问题，但手性醇的问题没有得到有效的解决[22]。2005年，美国SuperGen公司提出了喷司他丁中杂环合成的新方法，以次黄嘌呤为原料，将其六元环在O-C-N官能团处扩为七元杂环，极大缩减了喷司他丁合成的反应步骤，反应收率得到了明显提高[23]。2010年，浙江大学吴东平教授团队在Bristol-Myers Squibb公司现有合成路线的基础上，以5-硝基咪唑为原料进行喷司他丁的合成，过程中采用不对称氢转移反应使手性醇R/S的比例达到99:1，但该反应的催化剂的反应活性并不稳定，中试中喷司他丁的总收率为1.3%[24]。表 1总结了以上不同路线化学合成喷司他丁中间产物的立体选择性(表 1)。
| Starting materials | Target products | Glycosylation ratios (α/β) | Chirality ratios (R/S) | References |
| 5-nitro-4-styrylimidazole | Pentostatin | 15:14 | 3:2 | [19] |
| 4-methyl-5-nitroimidazole | Pentostatin | 1:1 | 1:1 | [20] |
| L-vinylglycine | Tetrahydroimidazodiazepinol aglycon of pentostatin | / | 99:1 | [21] |
| L-dialkyl tartarates | Pentostatin | 7:15 | Unknown | [23] |
| 4-methyl-5-nitroimidazole | Pentostatin | 1:1 | 99:1 | [25] |
综上，喷司他丁化学合成路线中七元杂环的稳定性得到了有效解决，但是，针对糖苷配基与七元杂环中手性醇的立体选择性等问题尚未有突破性的进展。目前，采用化学合成喷司他丁过程路线长、产率低、反应条件苛刻、中间体纯化难度大、成本高，难以实现大规模工业化生产。
3 喷司他丁生物合成机制随着生物技术的快速发展，组学技术在核苷类抗生素生物合成机制的挖掘方面展现出巨大的潜力[25]。如Lacalle等利用dmpm和pac作为探针从白黑链球菌Streptomyces alboniger的基因组文库中克隆出生物合成嘌呤霉素基因簇，并在此基础上，通过基因簇的异源表达实现了嘌呤霉素在变铅青链霉菌Streptomyces lividans中的合成[26]。2017年，武汉大学陈文青教授团队根据抗生链霉菌Streptomyces antibioticus NRRL 3238的全基因组数据，挖掘出一个参与嘌呤代谢途径的基因簇，并成功解析了喷司他丁的生物合成机制[27]。同时，马杜拉放线菌Actinomadura madurae与蛹虫草Cordyceps militaris中的喷司他丁生物合成机制也被揭示[13, 28]。
3.1 细菌中喷司他丁的生物合成机制针对抗生链霉菌中喷司他丁生物合成途径，Hanvey等通过在抗生链霉菌发酵液中添加[U-14C]-甘氨酸、[U-14C]-腺嘌呤和[U-14C]-腺苷溶液，发现腺苷是喷司他丁生物合成的前体物质，且其生物合成途径与初级代谢中组氨酸生物合成途径有一定的关联[29]。在此基础之上，研究发现抗生链霉菌中存在一种NADPH依赖性还原酶，其可催化8-酮基喷司他丁还原生成喷司他丁[19, 30-31]。
2017年，武汉大学陈文青教授团队将基因簇pen导入到金产色链霉菌Streptomyces aureochromogenes CXR 14中，实现了喷司他丁的异源合成[27]。该基因簇大小为10.5 kb，包含penA-penJ共10个基因，其中的PenA、PenB、PenC是喷司他丁生物合成的关键酶，共同介导喷司他丁的合成。PenA被鉴定为一种与HisG同源的ATP磷酸核糖转移酶，在组氨酸代谢途径中负责磷酸核糖焦磷酸(Phosphoribosyl pyrophosphate，PRPP) 与dATP的偶联；体外实验表明PenB是短链脱氢酶家族中的一员，负责喷司他丁合成的最后一步；而PenC作为SAICAR合成酶的同系物，其功能尚未明确。2020年，Ren等研究表明纯化后的PenA只能以dATP为底物，并且PenA是喷司他丁生物合成途径中的限速酶[32]。
2017年，武汉大学陈文青教授团队证实马杜拉放线菌ATCC 39365可以同时生产喷司他丁、2′-氯代喷司他丁及2′-氨基-2′-脱氧腺苷，并基于抗生链霉菌NRRL 3238中喷司他丁合成基因簇序列信息，通过分析马杜拉放线菌ATCC 39365全基因组序列，定位到2′-喷司他丁和2′-氨基-2′-脱氧腺苷的生物合成基因簇ada[13]。该研究发现，基因簇ada全长14.4 kb，由adaA-adaM共13个基因组成，其中AdaA、AdaB、AdaC、AdaK、AdaL与AdaM参与喷司他丁的合成，但AdaK与AdaM的敲除不影响喷司他丁的合成，而AdaE被预测为一种反向转运蛋白负责喷司他丁的氯化。目前，喷司他丁在细菌中的生物合成途径如图 3所示。
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| 图 3 细菌中的喷司他丁生物合成途径(根据文献[13]和[27]修改) Fig. 3 The biosynthetic pathway of pentostatin in bacteria (modified from reference [13] and [27]). PRPP: phosphoribosyl pyrophosphate; PenA, AdaC, AdaL, HisG: ATP phosphoribosyltransferase; HisE: phosphoribosyl-ATP pyrophosphohydrolase; HisI: phosphoribosyl-AMP cyclohydrolase; HisA: phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase; AdaK: phosphoribosyl isomerase A; His: other enzymes required to synthesize histidine; PenC, AdaA: SAICAR synthetase; PenB, AdaB: short-chain dehydrogenase; AdaM: hydrolase. |
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1979年，Kodama等发现构巢曲霉Aspergillus nidulans能同时生产喷司他丁和虫草素，这是真菌生产喷司他丁的首次报道[33]。1983年，Kanbe等报道了构巢裸胞壳Emericella nidulans也能合成喷司他丁[34]。2017年，中国科学院上海植物生理生态研究所王成树团队通过蛹虫草基因组数据分析，鉴定出虫草素生物合成基因簇cns。该基因簇全长10.3 kb，由cns1-cns4组成，其中Cns1和Cns2负责虫草素的合成，Cns3和Cns4参与喷司他丁生物合成及转运[28]。该团队的进一步研究发现，Cns3包含核苷/核苷酸激酶(Nucleoside/ nucleotide kinase，NK) 与HisG两个结构域。在罗伯茨绿僵菌Metarhizium robertsii与球孢虫草Cordyceps bassiana中异源表达NK与HisG结构域，结果表明HisG结构域能独立介导喷司他丁的合成。最近，山东大学凌建亚教授团队基于蛹虫草的研究，从九州虫草Cordyceps kyushuensis Kobayasi中比对出4个参与虫草素和喷司他丁合成的假定基因，但未对其功能进行进一步的验证[35]。目前，在真菌中的喷司他丁生物合成途径如图 4所示。
携带有喷司他丁生物合成基因簇的细菌与真菌，在合成喷司他丁的同时，还能生产其他腺苷类似物。喷司他丁通过抑制腺苷脱氨酶的活性，可防止微生物细胞中伴生的其他腺苷类似物经腺苷脱氨酶脱氨发生转化，这一保护机制被称为Protector- protégé strategy[27-28]。表 2对比了抗生链霉菌与蛹虫草体内喷司他丁的生物合成过程。放线菌中由多酶共同参与喷司他丁的合成，但蛹虫草中仅Cns3就能转化喷司他丁的合成。造成这种现象的原因一方面可能是细菌与真菌进化上存在的差异，另一方面可能是这类真菌中有其他内源酶参与了喷司他丁的合成。研究表明，源于抗生链霉菌参与喷司他丁合成的功能酶PenA、PenB和PenC与源于蛹虫草的功能酶Cns3并未存在序列相似性[28]。除此之外，真菌与细菌中喷司他丁合成酶是否共用一个途径，还需要进一步的研究来验证。
| Streptomyces antibioticus | Cordyceps militaris | |
| Substrate | PRPP, dATP | PRPP, adenosine |
| Enzyme | PenA, PenB, PenC | Cns3 |
| NADPH | √ | Unknown |
| ATP | √ | √ |
| Protector-protégé strategy | Arabinofuranosyladenine | Cordycepin |
相对于步骤烦琐、反应条件苛刻的化学合成，微生物合成喷司他丁具有合成步骤简单、收率高、成本较低等优势[36]。目前，微生物合成喷司他丁的菌株主要是抗生链霉菌与马杜拉放线菌，成品药NipentⓇ已经采用抗生链霉菌进行生产。
1975年，Warner-Lambert公司发表专利提供了一种利用抗生链霉菌NRRL 3238发酵生产喷司他丁的方法，并于1992年报道了从抗生链霉菌NRRL 3238发酵液中大规模分离提取喷司他丁的方法，其提取纯度大于99.7%[37-38]。1995年，Warner-Lambert公司进一步优化喷司他丁分离提取的方法，将50 000 L的发酵液经微孔过滤器过滤后，通过5 000 L的离子交换柱，经过“洗脱→浓缩→沉淀→过滤→重结晶→分离”等多个步骤后，得到648.5 g (纯度＞99.7%) 喷司他丁[10]。2010年，华东医药集团朱健等公开了一种链霉菌SW 0701发酵生产喷司他丁的专利，但未报道具体产量[39]。上海医药工业研究院陈少欣等通过优化抗生链霉菌NRRL 3238的培养基组分、温度和pH等发酵参数，使喷司他丁产量达到55 mg/L[40]。2013年，福建微生物研究所邹昕研究员通过优化抗生链霉菌Fim 06-063发酵条件，包括pH、温度、接种量及发酵周期等参数，使得喷司他丁产量达到183 mg/L[41]。最近，福建微生物研究所郑孝贤研究员发现添加植物油对提升抗生链霉菌产喷司他丁能力有显著的影响[42]。在该研究中，通过优化发酵工艺，建立了抗生链霉菌Fim 0426摇瓶水平发酵产量为232 mg/L的工艺；在此基础上，放大发酵工艺，最终实现抗生链霉菌Fim 0426在5 000 L发酵罐中产210 mg/L喷司他丁的能力。
此外，Warner-Lambert公司发现马杜拉放线菌ATCC 39365可以合成喷司他丁衍生物——2′-氯代喷司他丁[43-44]。2014年，中国科学院天津工业生物技术研究所刘涛团队在最适pH发酵条件下，采用变温发酵技术，使得马杜拉放线菌ATCC 39365产喷司他丁能力达100 mg/L[45]。2019年，天津商业大学王素英教授团队通过常压室温等离子诱变(Atmospheric room temperature plasma，ARTP) 技术与核糖体工程，成功筛选到一株马杜拉放线菌ATCC 39365突变菌株，其摇瓶水平发酵产量为6.077 mg/L[46]。
目前，研究人员主要通过优化微生物菌株外界生产环境，包括培养基组分、温度、pH等发酵参数，以提升喷司他丁合成效率。在现有的研究报道中，利用微生物合成喷司他丁的最高产量为232 mg/L，但这与工业化生产还存有较大的差距。因此，利用系统代谢工程进行喷司他丁的规模化生产已成为必然趋势。
5 总结与展望喷司他丁注射剂NipentⓇ作为治疗毛细胞性白血病的一线药物，其售价高达2 200美元每瓶(10 mg)[47]。目前，既无原研药进入我国市场，也无国内企业生产这类药物。为了满足喷司他丁的市场需求，出于当前合成喷司他丁方式存在的局限，迫切需要建立一种更加经济、高效、绿色的生物合成方法。微生物的高效合成需要解决菌种和发酵工艺两个关键性问题。尽管，已有多株菌种用于喷司他丁的发酵生产，并利用现代发酵技术优化生产条件，但产量较低，难以满足临床需求。研究表明，喷司他丁关键酶的过表达及前体物质的添加已被证明能显著增加喷司他丁的产量[28]。
通过现代生物技术对菌种进行基因改造，使喷司他丁绿色高效合成成为可能。系统代谢工程作为一种提升菌株性能的有力研究策略，通过将系统生物学、合成生物学、进化工程与传统代谢工程相结合，为实现喷司他丁高效生物合成提供了新方法与新思路[48]。转录因子的调控、核糖体工程、前体饲喂、生物合成基因簇的修饰及扩增等手段是增加核苷类抗生素产量的通用策略[49]。将来，可通过以下两方面策略来改造生产喷司他丁的微生物细胞工厂，以提升目标产物合成效率。一方面，利用诱变育种策略，构建一株遗传性状稳定的高产菌株，以此为出发菌株，建立成熟的遗传操作手段，并在此基础上采用代谢工程手段对菌株进行改造，以提升喷司他丁的合成效率；另一方面，选择合适的底盘细胞以实现喷司他丁的异源从头合成。放线菌作为抗生素、抗肿瘤药物等次级代谢产物的主要来源菌，不仅能提供丰富的前体物质，还具备独特的抗性机制来抵御产物的自毒性[50]。天蓝色链霉菌Streptomyces coelicolor、变铅青链霉菌等常见的链霉菌底盘细胞宿主已成功实现多种核苷类抗生素的异源表达[51]。除此之外，大肠杆菌、酿酒酵母作为模式微生物，具有遗传背景清晰、基因编辑技术成熟等优势，被广泛应用于各类天然产物的异源合成[52]。目前，笔者实验室已经开展喷司他丁异源合成的相关工作。
喷司他丁在微生物细胞工厂中合成时，不仅给细胞带来较大的代谢压力，同时也会造成细胞代谢的失衡。针对这些问题，转运工程、共培养工程及动态调控等策略可有效改善细胞代谢压力[53-55]。采用转运工程策略可将喷司他丁分泌到胞外，减少胞内产物积累对细胞造成的毒害；通过分析喷司他丁生物合成途径的特征，采用动态调控策略通过平衡微生物生长与目标产物的合成，使得代谢流更多用于喷司他丁的合成；基于模块化工程设计喷司他丁合成路径，通过共培养工程思路构建高版本生物体系进行目标产物优质合成，提升喷司他丁生产效率。随着代谢工程与合成生物技术的快速发展，改造微生物使其成为高效生产喷司他丁的细胞工厂，为解决喷司他丁高效优质合成开辟了一条新途径。本文通过介绍喷司他丁的合成方法及其生物合成机制，并提供提升喷司他丁合成效率的相关策略，以期为喷司他丁的生物合成提供参考。
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表1(Table 1)
