2021, Vol. 37
表1(Table 1)
利用CRISPR-Cas9系统与核糖体工程获得新型可利霉素产生菌
http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.200763
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 刘娟娟, 张妍, 赫卫清
- Liu Juanjuan, Zhang Yan, He Weiqing
- 利用CRISPR-Cas9系统与核糖体工程获得新型可利霉素产生菌
- Construction of a novel carrimycin-producing strain by using CRISPR-Cas9 and ribosome engineering techniques
- 生物工程学报, 2021, 37(6): 2116-2126
- Chinese Journal of Biotechnology, 2021, 37(6): 2116-2126
- 10.13345/j.cjb.200763
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文章历史
- Received: November 28, 2020
- Accepted: February 9, 2021
- Published: February 23, 2021
引用本文
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刘娟娟, 张妍, 赫卫清, 等. 利用CRISPR-Cas9系统与核糖体工程获得新型可利霉素产生菌. 生物工程学报, 2021, 37(6): 2116-2126
Liu JJ, Zhang Y, He WQ, et al. Construction of a novel carrimycin-producing strain by using CRISPR-Cas9 and ribosome engineering techniques. Chinese Journal of Biotechnology, 2021, 37(6): 2116-2126.
利用CRISPR-Cas9系统与核糖体工程获得新型可利霉素产生菌
1. 中国医学科学院医药生物技术研究所 卫健委抗生素生物工程重点实验室中国医学科学院药物合成生物学重点实验室，北京 100050;
2. 沈阳同联集团有限公司，辽宁 沈阳 110042
2. 沈阳同联集团有限公司，辽宁 沈阳 110042
摘要：可利霉素(Carrimycin，CAM) 是将异戊酰基转移酶基因(Isovaleryltransferase gene，ist)
导入到螺旋链霉菌中产生的以异戊酰螺旋霉素(Isovalerylspiramycin，ISP) 为主组分的抗生素。原工程菌中的ist基因与螺旋霉素(Spiramycin，SP) 生物合成基因簇相距较远，且具有两种抗性基因，难以对其进行基因改造，因此需要构建新型CAM工程菌株。文中通过CRISPR-Cas9基因编辑系统靶向切割2个位点，将ist和其正调控基因acyB2通过同源重组插入到SP生物合成基因簇附近且不参与SP合成的orf54基因下游，获得2种无外源抗性基因插入的CAM产生菌54IA-1和54IA-2，经发酵产物检测发现54IA-2菌株中的ISP产量明显高于54IA-1菌株。通过实时定量PCR (Quantitative real-time PCR，qPCR) 检测证实54IA-2菌株中ist和acyB2基因以及部分SP生物合成基因的表达量均高于54IA-1菌株。为进一步获得高产菌株，以54IA-2为出发菌株，利用核糖体工程的方法筛选利福平(Rifampicin，RFP) 抗性菌株，在RFP浓度为40 μg/mL的抗性菌株中，ISP的产量明显提高，最高可达842.9 μg/mL，比原始菌株提高约6倍。对其中7株菌的rpoB基因进行测序分析，每株菌的第576位丝氨酸都突变为丙氨酸，在其他错义突变中产量最高的菌株RFP40-6-8在第424位的谷氨酰胺突变为亮氨酸。综上所述，本研究应用CRISPR-Cas9系统成功构建了无任何抗性标记的新型CAM工程菌株54IA-1和54IA-2，并通过核糖体工程技术筛选获得了新型CAM高产菌株RFP40-6-8，为CAM工程菌株的进一步优化改造奠定了基础。
关键词：可利霉素 4″-O-异戊酰基转移酶基因 CRISPR-Cas9系统 核糖体工程
Construction of a novel carrimycin-producing strain by using CRISPR-Cas9 and ribosome engineering techniques
1. CAMS Key Laboratory of Synthetic Biology for Drug Innovation, NHC Key Laboratory of Biotechnology of Antibiotics, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China;
2. Shenyang Tonglian Group Co., Ltd., Shenyang 110042, Liaoning, China
2. Shenyang Tonglian Group Co., Ltd., Shenyang 110042, Liaoning, China
Abstract: Carrimycin (CAM) is a new antibiotics with isovalerylspiramycins (ISP) as its major components. It is produced by Streptomyces spiramyceticus integrated with a heterogenous 4″-O-isovaleryltransferase gene (ist). However, the present CAM producing strain carries two resistant gene markers, which makes it difficult for further genetic manipulation. In addition, isovalerylation of spiramycin (SP) could be of low efficiency as the ist gene is located far from the SP biosynthesis gene cluster. In this study, ist and its positive regulatory gene acyB2 were inserted into the downstream of orf54 gene neighboring to SP biosynthetic gene cluster in Streptomyces spiramyceticus 1941 by using the CRISPR-Cas9 technique. Two new markerless CAM producing strains, 54IA-1 and 54IA-2, were obtained from the homologous recombination and plasmid drop-out. Interestingly, the yield of ISP in strain 54IA-2 was much higher than that in strain 54IA-1. Quantitative real-time PCR assay showed that the ist, acyB2 and some genes associated with SP biosynthesis exhibited higher expression levels in strain 54IA-2. Subsequently, strain 54IA-2 was subjected to rifampicin (RFP) resistance selection for obtaining high-yield CAM mutants by ribosome engineering. The yield of ISP in mutants resistant to 40 μg/mL RFP increased significantly, with the highest up to 842.9 μg/mL, which was about 6 times higher than that of strain 54IA-2. Analysis of the sequences of the rpoB gene of these 7 mutants revealed that the serine at position 576 was mutated to alanine existed in each sequenced mutant. Among the mutants carrying other missense mutations, strain RFP40-6-8 which carries a mutation of glutamine (424) to leucine showed the highest yield of ISP. In conclusion, two markerless novel CAM producing strains, 54IA-1 and 54IA-2, were successfully developed by using CRISPR-Cas9 technique. Furthermore, a novel CAM high-yielding strain RFP40-6-8 was obtained through ribosome engineering. This study thus demonstrated a useful combinatory approach for improving the production of CAM.
Keywords:
Carrimycin 4″-O-isovaleryltransferase gene CRISPR-Cas9 system ribosome engineering
可利霉素(Carrimycin，CAM)，原名为必特螺旋霉素(Bitespiramycin)，是将耐热链霉菌Streptomyces thermotolerans中的4″-O-异戊酰基转移酶基因(4″-O-isovaleryltransferase gene，ist)整合至螺旋链霉菌Streptomyces spiramyceticus的基因组中所获得的基因工程菌株的发酵产物[1]。CAM的主组分是异戊酰螺旋霉素(Isovalerylspiramycin，ISP)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，它对革兰氏阳性菌有较强的活性，尤其是对肺炎链球菌、肺炎支原体和衣原体的活性较强[2]。由于CAM较螺旋霉素(Spiramycin，SP) 在结构上增加了4″-O-异戊酰基侧链，使其亲脂性与体内的抗菌活性增强，且半衰期延长[3-5]。Ⅲ期临床试验证实，CAM的药效和安全性都优于阿奇霉素。2019年，CAM作为国家1类创新药获得国家药品监督管理局批准(国药证字：H20190009)，并于同年上市。
原有的CAM工程菌由于经过多轮遗传改造和诱变育种，已具有安普霉素和硫链丝菌素两种抗性基因，难以通过抗性基因再对其进行遗传操作。CRISPR-Cas9系统可以高效地对基因组特定位点进行靶向编辑，包括敲除、修复和替换等[6]，而且能够不利用抗性基因同时敲除多个基因。近年来，CRISPR-Cas9系统已经广泛应用于链霉菌基因组遗传改造中[7]，包括基因定点突变[8]、验证基因功能[9]、激活沉默次级代谢产物生物合成基因簇[10]等。利用该系统，我们成功将S. spiramyceticus中负责SP 3位的酰化基因bsm4替换为ermEp*启动子控制下的ist基因，获得了只产ISPI且不带有抗性基因的新型工程菌[11]。
微生物次级代谢产物的生物合成与核糖体密切相关，通过核糖体工程技术对核糖体、RNA聚合酶及转录因子进行修饰改造可以提高次级代谢产物的合成能力[12-13]。该方法常用靶向核糖体或RNA聚合酶的抗生素来筛选抗性突变株[14]，一般采用的抗生素包括链霉素(Streptomycin，STR)、利福平(Rifampicin，RFP)、庆大霉素(Gentamicin，GEN)、巴龙霉素(Paromomycin，PRM) 和夫西地酸(Fusidic acid) 等。因其获得突变株的过程简单、获得高产菌株效率高、应用时无需了解菌株的遗传背景等优点，该技术已被广泛应用于菌种改良等方面[15]。
为了满足对CAM工程菌进一步遗传改造的需要，本研究采用CRISPR-Cas9系统将ist-acyB2连锁基因克隆至SP生物合成基因簇的下游附近，构建不带任何抗性标记的新型CAM工程菌。并且通过核糖体工程技术对构建成功的CAM工程菌株进行菌种诱变，筛选获得新型CAM高产菌株。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种和质粒螺旋霉素产生菌S. spiramyceticus 1941由本实验室保藏。耐热链霉菌S. thermotolerans ATCC 11416T，用于提取基因组DNA扩增ist基因和正调控基因acyB2，购于美国模式培养物集存库(American type culture collection，ATCC)。新型无抗性CAM产生菌54IA-1和54IA-2，由本研究室构建。大肠杆菌Escherichia coli DH5α感受态细胞，用于基因克隆和重组质粒构建，购自北京全式金生物技术有限公司。E. coli ET 12567/pUZ8002甲基化缺陷型大肠杆菌，用于重组质粒去甲基化；枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis CPCC 100029，用于工程菌发酵产物的活性检测，均为本实验室保存。
CRISPR-Cas9基因组编辑质粒pKCcas9do[8]，由中国科学院上海生命科学研究院姜卫红研究员惠赠。重组质粒pKCas-ia-1和pKCas-ia-2由本研究室构建。
本研究所用引物序列见表 1。
表 1 本文中所用引物
Table 1 Primers used in this study
| Oligos | Sequences (5′–3′) |
| orf54-sgRNA-F1 | GGACTAGTCTTGCGCACCGCTGCCCCCAGTTTTAGAGCTAGAAAT |
| orf54-sgRNA-F2 | GGACTAGTGCGCGGTGCCCGCACCACCAGTTTTAGAGCTAGAAAT |
| orf54-Down | GCTCTAGACTCAAAAAAAGCACCGACTCGG |
| orf54-LF | GCTCTAGAGCCACTGGCGAGGATGTTCA |
| orf54-LR | CGGAATTCTGCGGCGGTATCGGGAAGA |
| ist-acyB2-F | CGGAATTCCACCCAGCTCGAATACGCC |
| ist-acyB2-R | CCGGATATCGACCTTGACAGTCCTCGCCTC |
| orf54-RF | CCGGATATCCCCTCGGAATCCTTCTCACAG |
| orf54-RR | CCCAAGCTTGTGCTGCTGCCCATTCTCATC |
| 54IA-YF | GGCCTCGGTGCTCGATAAG |
| 54IA-YR | GCATGGACACCATCACCCTCT |
| IA-F | GCGAACACCGCTGAGAACA |
| IA-R | AGATCGCCGCTCACCCTTA |
| 16S RNA-F | GGTAGAGCTTGTTGACGCAGAG |
| 16S RNA-R | ATGAGGGCGAGGACAGCGATGC |
| ist-F | GTCTCCATCCCCCTGGTCGCAC |
| ist-R | CTGGATGATCAGGTAGTGCACG |
| acyB2-F | GCCCAGCACCTCATGGAACA |
| acyB2-R | ACCCCGAACAGCAGGAGCGT |
| bsm3-F | AGACGTTGCCTGGAGTTGGG |
| bsm3-R | GCTGGGTGAACCGCTGATAG |
| bsm5-F | GACGGCCTGCTGCGTGAACT |
| bsm5-R | GGGCCACTTGTCGCTGATGT |
| bsm9-F | ATGTTCAGCTCCATAGGCCACC |
| bsm9-R | GCACAGAATGCGAGACCCG |
| bsm42-F | TCTCGTGGGTCTGCCCTTCA |
| bsm42-R | AAGTCGGCGTCCACCTGCT |
| rpoB-F | GAGCGCATGACCACCCAG |
| rpoB-R | TCGTAGTTGTGACCCTCCC |
氯霉素(Chloramphenicol，CM) 购自北京市医药公司制药厂。安普霉素(Apramycin，AM) 购自武汉远城科技发展有限公司。硫链丝菌素(Thiostrepton，TSR)、氨苄青霉素(Ampicillin，AMP) 和利福平(RFP) 购自Sigma公司。SP对照品，购自河南天方药业股份有限公司。CAM标准品，沈阳同联集团有限公司提供。溶菌酶购自生工生物工程(上海) 股份有限公司。链霉菌基因组快速提取试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司。限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司。KOD FX Neo DNA聚合酶(TOYOBO) 购自北京百灵克生物科技有限公司。
1.1.3 培养基R2YE培养基用于S. spiramyceticus 1941原生质体的制备和再生[16]，S. spiramyceticus 1941的斜面、种子、发酵和生物检定培养基均按参考文献[17]配制。
1.2 实验方法 1.2.1 CRISPR-Cas9基因编辑质粒的构建链霉菌基因组DNA的提取按照文献[18]进行。E. coli ET12567/pUZ8002感受态细胞的制备，目的片段的扩增，PCR产物纯化，限制性酶切，DNA连接与转化，重组转化子的筛选与鉴定等分子克隆操作按照文献[19]进行。DNA测序由中美泰和生物技术(北京) 有限公司完成。
以提取的S. spiramyceticus 1941基因组DNA为模板，用引物orf54-LF/LR、orf54-RF/RR进行扩增获得ist-acyB2基因整合位点两端的左和右同源臂。大小为988 bp的左同源臂用Xba Ⅰ和EcoR Ⅰ进行酶切回收，大小为980 bp的右同源臂用EcoR Ⅴ和Hind Ⅲ酶切回收。以S. thermotolerans ATCC 11416T基因组DNA为模板，用ist-acyB2-F/R引物扩增出3 335 bp ist-acyB2基因片段，并用EcoR Ⅰ和EcoR Ⅴ酶切回收。分别用引物orf54-sgRNA-F1、orf54-sgRNA-F2与orf54-Down配对，以pKCcas9do质粒为模板进行PCR，获得2条150 bp左右的引导RNA (Single-guide RNA, sgRNA)的DNA序列sgDNA-1和sgDNA-2，用Spe Ⅰ和Xba Ⅰ酶切回收。再分别将sgDNA-1、sgDNA-2与左右同源臂和ist-acyB2基因片段克隆至pKCcas9do载体的Spe Ⅰ和Hind Ⅲ位点获得重组质粒pKCas-ia-1和pKCas-ia-2。
1.2.2 目的菌株的筛选将构建好的重组质粒pKCas-ia-1和pKCas-ia-2通过原生质体转化法[16]分别导入到S. spiramyceticus 1941中，利用1 μg/mL TSR诱导Cas9表达，由sgRNA引导Cas9对SP生物合成基因簇下游orf54基因的靶位点进行切割形成双链断裂，重组质粒上带有同源臂的ist-acyB2基因通过同源重组插入到靶位点。将发生同源双交换的目的菌株于37 ℃培养，使质粒停止复制，通过AM抗性和无抗性平板进行筛选，获得ist-acyB2基因插入到靶位点且不带有抗性基因的菌株，并进行PCR鉴定和测序验证。
1.2.3 菌株发酵及发酵产物的提取挑取阳性转化子接种于斜面培养基上28 ℃培养5–7 d，挖块面积为1 cm2左右的菌落，接种到装有50 mL发酵培养基的250 mL三角瓶，每个菌株接种3瓶，28 ℃振荡培养96–120 h后，发酵液经离心取上清液稀释，进行抗菌活性检测。
发酵产物的提取：发酵液室温8 000 r/min离心10 min，上清液用5 mol/L NaOH调pH至8.5–9.0之间，用1/2体积的乙酸乙酯萃取，吹干后用100 μL乙酸乙酯或甲醇溶解于1.5 mL离心管中。
1.2.4 抗生素生物效价测定以Bacillus subtilis CPCC 100029为检定菌，参考《中华人民共和国国药典》2020年版(二部)乙酰螺旋霉素含量测定项下微生物检定法[20]。采用管碟法，用标准曲线法进行测定。
1.2.5 qPCR分析用TSB培养基[16]培养54IA-1和54IA-2菌株，取培养72 h的菌丝分别提取总RNA，进行反转录PCR (Reverse transcription PCR，RT-PCR) 和qPCR分析。以16S rRNA作为内参基因(引物16S RNA-F/R，表 1)，对每个样品中ist和acyB2及与SP生物合成相关基因表达进行定量分析，每个样品做3个重复。使用SYBR Green Ⅰ染料法进行定量分析，2–ΔΔCt方法计算不同菌株中的基因表达量。qPCR反应条件：96 ℃预变性3 min；96 ℃变性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共计35个循环；72 ℃延伸10 min (罗氏公司LightCycler 96)。
1.2.6 高效液相色谱(High performance liquid chromatography，HPLC) 分析发酵液经提取、挥干后溶于色谱纯乙腈，0.22 μm的滤膜过滤后进样10 μL。色谱仪：岛津LC-10ATvp液相色谱仪，色谱柱：Kromasil C18 (4.5 mm×150 mm，5 μm)，流动相：CH3OH/1% CH3COONH4 (65︰35)，检测波长：231 nm，流速：1 mL/min，柱温：25 ℃。以CAM标准品为对照，检测并计算ISPⅠ、Ⅱ和Ⅲ的峰面积，确定CAM主组分的相对含量。
1.2.7 抗药性突变株筛选取扩大培养的54IA-2菌丝体，放入带玻璃珠和无菌水的试管中，剧烈振荡5 min，制成孢子悬液。制备不同浓度(20、40、80 μg/mL) 的RFP筛选平板，将孢子悬液涂布在筛选平板上，并设置空白对照组，28 ℃培养3–4 d。再将生长起来的单菌落用同样浓度的抗生素传代培养，进行摇瓶复筛：挑选传代后的菌株接种于种子培养基，28 ℃培养48–52 h，以10%的接种量转入发酵培养基(每个500 mL三角瓶装100 mL发酵培养基)，28 ℃培养96 h，提取发酵产物进行HPLC检测。
1.2.8 RFP抗性突变株的突变位点分析RFP抗性突变株是由于RNA聚合酶b亚基的基因(rpoB) 发生突变从而获得抗性。为研究54IA-2的RFP抗性突变株中rpoB基因的碱基变化部位，提取RFP突变株DNA，利用rpoB-F/R引物扩增出在RFP抗性压力下rpoB基因容易发生变化的区域，分析其中发生突变的碱基，找出发生突变的对应氨基酸残基。
2 结果与分析 2.1 ist-acyB2基因片段的插入位点分析CAM生物合成基因簇[21]中负责SP生物合成的部分为89 kb左右，包含在一个约110 kb的序列中(GenBank登录号：MH460451)。这个序列中包含了54个预测的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，经鉴定与SP生物合成相关的有42个，按顺序依次命名为bsm1至bsm42[22]，它们与生二素链霉菌Streptomyces ambofaciens ATCC 23877中公布的SP生物合成基因簇[23]同源性较高。bsm42与S. ambofaciens中位于整个基因簇边界附近的SP正调控基因srm40[24]是同源基因；其下游的orf43-orf48是一些未知功能的基因和与ATP酶驱动运输相关的基因，推测是负责SP的运输；orf49-orf53绝大部分是功能未知基因；orf54基因编码一种包含WD40重复序列的蛋白[25]，在真核细胞中WD40蛋白家族成员常作为生物大分子相互作用的支架蛋白，在原核细胞中这类蛋白常参与信号传导和营养物质的合成，因此这个基因应该与SP的生物合成无关。在原CAM产生菌中ist基因整合在一个Ⅱ型PKS基因中间，距离SP的生物合成基因簇3 Mb以上，空间上的距离会影响异戊酰基转移酶对SP的后修饰效率。若将ist基因整合在SP生物合成基因簇附近，可能提高SP转化为ISP的效率。因此将带有ist和其正调控基因acyB2的重组质粒pKCas-ia-1和pKCas-ia-2通过CRISPR-Cas9系统插入到SP生物合成基因簇的相邻基因orf54的下游(图 1A)。
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| 图 1 在SP生物合成基因簇下游插入ist-acyB2基因变株的构建(A) 和验证(B) Fig. 1 Construction (A) and validation (B) of a mutant with ist-acyB2 genes inserted downstream of the SP biosynthetic gene cluster. M: Trans 15k DNA marker; 1: pKCas-ia-1 (SpeⅠ/Hind Ⅲ); 2: pKCas-ia-2 (SpeⅠ/Hind Ⅲ); 3–5: IA-F and IA-R primer, 3: wildtype strain, 4: 54IA-1, 5: 54IA-2; 6–8: 54IA-YF and 54IA-YR primers, 6: wildtype strain, 7: 54IA-1, 8: 54IA-2. |
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利用Spe Ⅰ和Hind Ⅲ对构建成功的质粒pKCas-ia-1和pKCas-ia-2进行酶切鉴定，结果如图 1B中泳道1和2所示，13 kb左右的条带为pKCcas9dO载体，5 kb左右的条带为带有同源臂的ist-acyB2基因片段，片段大小与预期相符，并经测序确证。将两个质粒导入S. spiramyceticus 1941中，通过TSR诱导、抗性和温度筛选出两种目的菌株54IA-1和54IA-2。利用鉴定引物IA-F/R和54IA-YF/R对原株S. spiramyceticus 1941和ist-acyB2基因片段插入后的54IA-1、54IA-2变株进行鉴定(图 1B)。泳道3–5显示IA-F/R鉴定引物在原株中没有扩增出产物，在54IA-1、54IA-2变株中扩增出约预期大小的1.8 kb目的片段；泳道6–8显示54IA-YF/R鉴定引物在原株中扩增出约2.7 kb的特异性片段，在两种变株中扩增出6 kb的特异性片段，二者之差为3.3 kb左右，符合ist-acyB2片段的大小，证明ist-acyB2基因片段已成功插入到orf54基因的下游。同时，将54IA-YF/R鉴定引物PCR扩增产物进行测序，证实两种变株中ist-acyB2片段在orf54基因下游的插入位点完全一致。
2.3 新型CAM工程菌株的发酵检测将54IA-1和54IA-2菌株进行发酵，对发酵产物进行鉴定。虽然设计了两种不同的Cas9切割位点，但是通过测序证实，两种工程菌株插入目的基因的位置与序列完全相同。但对两种变株在发酵培养基中的发酵上清进行抗菌活性测定发现，54IA-1上清液形成的抑菌圈明显小于54IA-2的抑菌圈。54IA-1的效价为(57±5.1) μg/mL，而54IA-2的效价达到(179±8.2) μg/mL，明显高于54IA-1的效价。通过HPLC检测(图 2)也发现54IA-2菌株中ISP的产量明显高于54IA-1。
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| 图 2 菌株54IA-1和54IA-2发酵产物的HPLC检测 Fig. 2 HPLC analysis of the fermentation products of strains 54IA-1 and 54IA-2. (A) Control of CAM. (B) 54IA-1. (C) 54IA-2. Ⅰ: ISPⅠ; Ⅱ: ISPⅡ; Ⅲ: ISPⅢ. |
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通过qPCR检测54IA-1和54IA-2中ist和acyB2以及与SP生物合成相关基因的表达情况，结果显示，54IA-2中ist和acyB2的表达量分别比在54IA-1中高5倍和1.5倍左右(图 3)，且bsm3、bsm5、bsm9和正调控基因bsm42的表达量(表 2)也明显高于54IA-1。其中bsm3编码23S rRNA的甲基转移酶，是一种修饰23S rRNA而获得抗生素抗性的基因，抗性基因的高表达通常能提高抗生素的产量[11, 26]；bsm5编码O-甲基转移酶，参与聚酮合酶底物的合成；bsm9编码SAM依赖的甲基转移酶，参与NDP-脱氧糖基的生物合成；bsm42是SP生物合成的正调控基因[22-23]。菌株54IA-2中ist、acyB2以及部分与SP生物合成相关基因的表达情况与其CAM产量高于54IA-1相符，表明工程菌株54IA-1的ISP产量低于54IA-2可能是由于相关基因表达受影响引起的。
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| 图 3 菌株54IA-1和54IA-2中ist和acyB2基因表达情况 Fig. 3 The expression level of ist and acyB2 in 54IA-1 and 54IA-2 strains. (A) RT-PCR detection of ist and acyB2 in 54IA-1 and 54IA-2 strains. 1–6: 54IA-1, 1 & 4:16S rRNA, 2 & 5: ist, 3 & 6: acyB2; 7–12: 54IA-2, 7 & 10:16S rRNA, 8 & 11: ist, 9 & 12: acyB2. (B) qPCR detection of ist and acyB2 in 54IA-1 and 54IA-2 strains. |
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表 2 54IA-1和54IA-2菌株中与SP生物合成相关基因的表达情况
Table 2 Expression of genes related to SP biosynthesis in strains 54IA-1 and 54IA-2
| Gene | Proposed function | Proposed role in SP biosynthesis | Fold change (54IA-2/54IA-1) |
| bsm3 | 23S ribosomal RNA methyltransferase | Resistance | 4.99 |
| bsm5 | O-methyltransferase | Provision of extender units for PKS | 12.47 |
| bsm9 | SAM-dependent methyltransferase | Sugar biosynthesis | 8.69 |
| bsm42 | DDE_5 superfamily, transcriptional regulator | Positive regulation | 73.52 |
由于新构建菌株发酵水平远远达不到工业需求，所以通过核糖体工程方法来提高菌株的CAM产量。对新构建的菌株54IA-2进行核糖体工程常用抗生素的敏感性测试发现，该菌株对RFP比较敏感，其MIC为0.2 μg/mL，因此选择RFP作为抗性压力筛选54IA-2突变株。对一系列RFPR菌株进行发酵，并对发酵产物进行检测，发现在40 μg/mL RFP平板上生长的抗性突变株RFP40-6的ISP产量最高，为290.4 μg/mL。将突变菌株RFP40-6进行自然分离，选取15个由单个孢子长成的菌落进行摇瓶复筛。HPLC检测结果显示，ISP产量最高的为RFP40-6-8，可达842.9 μg/mL，较原始菌株提高了约6倍(表 3)。将产量变化较大的7株菌进行rpoB基因测序，结果发现所有菌株都存在576位的丝氨酸(Serine，Ser) 突变为丙氨酸(Alanine，Ala)，突变情况见表 3。RFP40-6-1、RFP40-6-5均在基因序列的1 319位发生突变，碱基鸟嘌呤G突变为腺嘌呤A，使得440位精氨酸(Arginine，Arg) 变为组氨酸(Histidine，His)。RFP40-6-2、RFP40-6-3和RFP40-6-7均在基因序列的1 281位发生突变，碱基A突变为G，427位天门冬氨酸(Aspartic acid，Asp) 变为谷氨酸(Glutamic acid，Glu)。突变株RFP40-6-12中基因序列的1 310位A碱基突变为胞嘧啶C，使得437位His突变为脯氨酸(Proline，Pro)。CAM产量提高最为明显的RFP40-6-8中基因序列的1 271位A碱基突变为胸腺嘧啶T，对应的424位谷氨酰胺(Glutamine，Gln) 突变为亮氨酸(Leucine，Leu)。
表 3 40 μg/mL RFP突变株中rpoB基因突变位点分析
Table 3 Analysis of the rpoB mutations in mutants resistant to 40 μg/mL RFP
| Strains | Position of mutations in rpoB | Amino acid exchange | Production of ISP (μg/mL) | The proportion of ISP to total (%) |
| 54IA-2 | – | – | 120.1 | 12.3 |
| RFP40-6 | – | – | 290.4 | 28.3 |
| RFP40-6-1 | 1 319 (G→A)/1 726 (T→G) | Arg440His/Ser576Ala | 329.5 | 12.9 |
| RFP40-6-2 | 1 281 (A→G)/1 726 (T→G) | Asp427Glu/Ser576Ala | 482.5 | 18.7 |
| RFP40-6-3 | 1 281 (A→G)/1 726 (T→G) | Asp427Glu/Ser576Ala | 329.5 | 12.9 |
| RFP40-6-5 | 1 319 (G→A)/1 726 (T→G) | Arg440His/Ser576Ala | 457.2 | 17.9 |
| RFP40-6-7 | 1 281 (A→G)/1 726 (T→G) | Asp427Glu/Ser576Ala | 365.3 | 14.3 |
| RFP40-6-8 | 1 271 (A→T)/1 726 (T→G) | Gln424Leu/Ser576Ala | 842.9 | 33.0 |
| RFP40-6-12 | 1 310 (A→C)/1 726 (T→G) | His437Pro/Ser576Ala | 472.5 | 18.5 |
CAM是利用基因工程方法获得的工程菌发酵产物，具有良好的抗菌活性，已经取得国家1类新药证书和生产批文，并在抗击新冠肺炎疫情中进入科技部发布的国家新冠治疗方案。本研究应用CRISPR-Cas9系统成功构建了没有任何抗性标记的新型CAM工程菌株54IA-1和54IA-2，并进一步通过核糖体工程技术筛选获得了新型CAM高产菌株RFP40-6-8，为CAM工程菌株的优化奠定了基础。
原有的CAM工程菌，由于经过多次的基因改造使其带有两种抗性基因，很难进行其他的基因改造。而CRISPR-Cas9系统可以通过sgRNA指导Cas9蛋白对靶基因进行双链剪切，利用细胞自身的同源定向修复机制完成基因的编辑，目前已广泛应用于链霉菌基因组的修饰或改造。本研究在应用CRISPR-Cas9系统构建新型CAM工程菌时，设计了两条切割位点不同的sgRNA，成功构建了没有任何抗性标记的新型CAM菌株54IA-1和54IA-2。测序结果显示目的片段在两株菌中的插入位点与插入序列完全一致，但是发酵结果却显示两株菌合成CAM的能力大不相同，菌株54IA-2的产量明显高于菌株54IA-1。qPCR结果显示54IA-2中ist、acyB2、bsm3、bsm5、bsm9和bsm42的表达量均高于54IA-1。推测可能是sgRNA-1引导Cas9蛋白对目的基因切割时产生脱靶，影响CAM的生物合成，导致了菌株54IA-1产量偏低。后续将对两株工程菌株进行全基因组测序，以确定是否由于脱靶现象对菌株基因组产生影响而导致的CAM产量差异。总之，利用CRISPR-Cas9系统成功构建的新型CAM工程菌54IA-1和54IA-2为进一步遗传改造提供了菌种基础。
新型CAM工程菌54IA-2的发酵水平虽然高于54IA-1，但产量还比较低。本实验选取RFP为筛选压力通过核糖体工程来筛选高产菌株。研究证实，RFP抗性突变株是由于rpoB基因(编码RNA聚合酶β亚基) 发生突变所导致的[27]。通过RFP抗性筛选54IA-2突变株发现，40 μg/mL RFP筛选获得的抗性突变株的CAM产量提高比较明显，且所有测序菌株均存在rpoB基因突变。RFP40-6-1、RFP40-6-5菌株中Arg440变为His，与Hu等[27]报道的Streptomyces lividans 66正突变株RH-1的突变位点相同。RFP40-6-2、RFP40-6-3和RFP40-6-7的Asp427变为Glu，与Hu等[27]报道的S. lividans 66正突变株DE-1和Ma等[28]报道的Toyocamycin产生菌1628正突变株1628-T09的突变位点相同。文献报道[27-30]另一个出现频率较高的rpoB基因突变位点是1 309位的C碱基和1 310位的A碱基，即His437可突变为Leu、天冬酰胺(Asparagine，Asn)、酪氨酸(Tyrosine，Tyr)、Arg、半胱氨酸(Cysteine，Cys) 或Asp，但在突变株RFP40-6-12中发生了一个新的突变His437Pro。CAM产量提高最为明显的RFP40-6-8中发生了Gln424Leu突变，与经过5轮抗性筛选(一次PRM抗性突变、3次STR抗性突变、一次RFP抗性突变) 的高产四烯类突变株G5-59[31]发生在rpoB基因上的突变位点相同。结果表明，本次实验所得的RFP抗性突变株除Ser576Ala突变外，其他突变位点均位于rpoB基因RFP抗性突变易发生区域。并且rpoB基因不同的突变位点会导致CAM产量的不同，通过RFP抗性筛选能够快速有效地获得CAM高产菌株。进一步研究rpoB基因突变与CAM产量之间的关系，将为CAM工程菌株的优化指明方向。
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