虫草素(Cordycepin)，又名3'-脱氧腺苷(3'-deoxyadenosine)，1951年首次被Cunningham等从蛹虫草Cordyceps militaris发酵液中分离得到^[1]，是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗生素^[2]，因其具有抗癌^[3]、治疗白血病^[4]、免疫调节^[5]、抗肺细胞纤维化^[6]等医用价值，引起了学术界和医学临床研究的高度关注。

虫草素获取途径主要包括化学合成法和生物法，其中生物法包括两种途径：直接从天然或人工培育的蛹虫草子实体中提取，或经过液体发酵从蛹虫草菌丝体和发酵液中提取。目前，虫草素多源自蛹虫草液体发酵，但发酵周期长(15-60 d)、生产强度低，导致虫草素价格昂贵，不利于虫草素的大规模应用。中国科学院上海植物生理研究所王成树研究员团队利用比较基因组分析蛹虫草基因组，挖掘了虫草素生物合成基因簇(cns1-4)，通过基因敲除、异源表达和代谢途径分析等技术对cns1-4进行功能分析，明确了负责合成虫草素的两个关键基因：编码氧化还原酶的cns1 (CCM_04436，NCBI序列号：XM_006669584.1)和编码磷酸水解酶的cns2 (CCM_04437，NCBI序列号：XM_006669585.1)。虽然虫草素生物合成机制至今尚未完全阐明，但该团队提出了较合理的虫草素生物合成途径假设^[7]：通过cns3编码的核苷酸激酶催化腺苷磷酸化形成3'-磷酸腺苷(3'-AMP)，进一步通过cns2编码的磷酸水解酶催化3'-AMP去磷酸化生成2'-羰基-3'-脱氧腺苷，最后通过cns1编码的氧化还原酶催化还原反应产生虫草素(图 1)。虫草素生物合成关键基因的确定及代谢途径的初步解析，为基于酿酒酵母等底盘细胞构建基因工程菌株实现虫草素高效生产奠定了基础。

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae作为常用的模式真菌，具有生物安全、遗传背景清晰、发酵周期短、适于大规模工业生产等优点。目前，在酿酒酵母中已经实现了多种代谢产物的异源合成^[8]，2006年美国Keasling教授团队通过在酿酒酵母中异源表达青蒿酸合成途径的关键酶基因：紫穗槐二烯合成酶(ADS)、细胞色素P450单加氧酶及其天然氧化还原酶(CYP71AV1/CPR)，并通过过表达截短的HMG-CoA还原酶、下调ERG9基因表达等方法增强法尼焦磷酸(Farnesyl diphosphate，FPP) 代谢通量、削弱由FPP向麦角固醇转化的代谢通量、促进青蒿酸前体紫穗槐二烯的生成进而高效合成青蒿酸，最终积累超过100 mg/L青蒿酸，并通过发酵优化等手段将青蒿酸产量提高到2.5 g/L^[9]。该团队进一步通过改造酿酒酵母甲羟戊酸途径、引入合成己酰CoA的代谢途径、表达大麻酸生物合成的酶基因CsTKs和CsOAC、大麻酸酯香叶基转移酶基因CsPT4等多个外源基因等手段，提高了酿酒酵母底盘细胞香叶基焦磷酸(Geranyl pyrophosphate，GPP) 的代谢通量，最终实现了包括大麻萜酚酸(Cannabigerolic acid，CBGA)、四氢大麻酚(Δ9-tetrahydrocannabinolic acid，THCA)、大麻二酚(Cannabidiolic acid，CBDA) 在内的多种主要大麻素及其衍生物的生物全合成^[10]。

本研究拟在酿酒酵母S. cerevisiae S288C中构建虫草素生物合成途径，虫草素合成关键基因cns1和cns2经密码子优化后在酿酒酵母S. cerevisiae S288C中异源表达，成功构建产虫草素的酵母工程菌。随后在深层液体发酵体系进行了关键基因表达分析，并对碳源、氮源、前体以及金属离子等培养基组分进行优化进一步提高虫草素产量。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株

酿酒酵母S. cerevisiae S288C作为出发菌株，大肠杆菌Escherichia coli DH5α用于所有质粒的克隆。实验所用菌株详见表 1。

1.1.2 培养基

LB培养基(g/L)：氯化钠10，酵母浸粉5，胰蛋白胨10 (pH 7.0-7.2)。

YPD培养基(g/L)：葡萄糖30，酵母浸粉10，蛋白胨10。

1.2 方法 1.2.1 质粒构建

参考蛹虫草菌C. militaris CGMCC 3.14242基因组中cns1和cns2序列信息，按酿酒酵母密码子优化并合成ScCNS1和ScCNS2基因。以酿酒酵母S. cerevisiae S288C基因组为模板，分别PCR扩增TDH3和TEF1启动子序列、CYC1和ADH1终止子序列。将扩增得到的各片段按TDH3p-ScCNS1-CYC1t和TEF1p-ScCNS2-ADH1t构建基因表达盒，通过无缝克隆技术连接至带有卡那霉素抗性基因的游离表达载体pYES2-Kan上，得到重组质粒pYES2-ScCNS。本研究涉及的质粒和引物如表 1和表 2所示。

1.2.2 酵母转化和阳性克隆筛选

酿酒酵母转化采用LiAc化学转化法^[11]。向50 μL感受态细胞中加入转化混合液(250 μL PEG3350 (50%，W/V)、36 μL 1.0 mol/L LiAc、25 μL ssDNA (2 mg/mL)、50 μL ddH₂O和5 μL质粒DNA)，42 ℃水浴20-25 min，加入700 μL YPD培养基30 ℃孵育2 h，涂布于YPD固体平板(含250 μg/mL G418)，30 ℃培养2-3 d后挑选阳性克隆。液体培养后提取质粒^[11]，转化E. coli DH5α感受态细胞，纯化质粒(MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0，TaKaRa，大连) 进行PCR和酶切验证。

1.2.3 摇瓶液体发酵

将-80 ℃保藏的酵母甘油液体种子接种到新鲜YPD培养基中(1%，V/V)，30 ℃、150 r/min活化培养14-16 h。按1% (V/V) 接种量转接到装液量为100 mL的250 mL三角瓶中，30 ℃、150 r/min发酵240 h，初始葡萄糖浓度为30 g/L、50 g/L或100 g/L，测定生物量、残糖、乙醇及虫草素浓度。

1.2.4 发酵罐补料分批发酵

按10% (V/V) 接种量将300 mL酵母液体活化种子接入装有2 700 mL YPD培养基(初始50 g/L葡萄糖) 的5 L搅拌发酵罐中，30 ℃、300 r/min进行深层液体发酵，通气量为1.5 L/min。采用补料策略，初始底物葡萄糖耗尽后，在第48 h进行补料(补料后葡萄糖浓度为25 g/L)，每隔24 h取样测定生物量、残糖、乙醇及虫草素浓度。

1.2.5 基因表达分析

取4 mL发酵液，12 000 r/min离心2 min，弃上清，菌体用去离子水清洗2次，液氮速冻后-80 ℃保存。样品经液氮和石英砂研磨，采用TRIZOL法提取总RNA (TaKaRa，大连)，通过反转录试剂盒(EasyScript^® One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix，北京全式金生物技术有限公司) 将其反转录成cDNA，再利用qPCR定量试剂盒(TransStart^® Top Green qPCR Super Mix，北京全式金生物技术有限公司) 进行qRT-PCR分析，检测基因表达水平。以酿酒酵母ACT1基因为内参基因，采用2^-ΔΔC_t法计算基因相对表达量^[12]，相关引物如表 2所示。

1.2.6 生物量测定

取4 mL发酵液，12 000 r/min离心2 min，经去离子水洗2次后收集菌体，80 ℃烘干至恒重，称重并计算生物量浓度。

1.2.7 葡萄糖及乙醇浓度测定

发酵液中葡萄糖及乙醇浓度采用SBA生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所) 测定。

1.2.8 发酵液中虫草素鉴定及定量分析

发酵液中虫草素鉴定及定量分析分别选用液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS) 法及高效液相色谱(HPLC) 法^[13]。色谱条件：流动相为水：甲醇(80：20) 梯度，柱温25 ℃，流速为0.5 mL/min，检测波长范围为210-400 nm，进样量5 μL。质谱条件：TSQ Quantum Ultra三重四极杆液质联用仪(Thermo Scientific，USA)，配有电喷雾离子源(Electrospray ionization，ESI)，选择反应监测扫描(Selected reaction monitoring，SRM)模式。离子源温度：380 ℃；喷雾气压0.069 MPa；辅助气体GS1 0.34 MPa，辅助气体GS2 0.52 MPa；离子喷雾电压5 000 V；碰撞能量20 V；出口电压27 V；质荷比m/z范围为50-350。

1.2.9 细胞存活率测定

酵母细胞存活率采用美蓝染色法测定。取200 μL发酵液，5 000 r/min离心2 min收集菌体，用生理盐水重悬菌体，1：1 (V/V) 加入吕氏碱性美蓝染液，染色3 min后，显微镜计数，计算细胞存活率。

2 结果与分析 2.1 产虫草素酿酒酵母工程菌的构建

蛹虫草虫草素合成关键基因的功能验证为建立基于酿酒酵母底盘细胞构建产虫草素的基因工程菌株奠定了基础^[7]。本研究构建了游离表达ScCNS1和ScCNS2的重组质粒pYES2-ScCNS (图 2A)。重组质粒经酶切及测序验证后转入酿酒酵母S288C感受态细胞，获得的阳性克隆PCR验证后经液体发酵筛选得到一株发酵性能优异的酵母工程菌株SHC16 (图 2B，D)。工程菌SHC16发酵液经过LC-MS/MS分析(图 2C)，存在与虫草素标准品出峰时间及质荷比(m/z)一致的代谢物，由此确认工程菌SHC16能发酵生产虫草素。

为考察ScCNS1和ScCNS2表达对酵母细胞的影响，本研究比较了原始宿主S288C、工程菌SHC01 (含空白质粒pYES2-Kan) 以及SHC16 (含重组质粒pYES2-ScCNS) 的发酵特性。

如图 3所示，发酵12 h，S288C、SHC01及SHC16发酵体系的残糖浓度分别为(16.14±0.14) g/L、(18.98±0.19) g/L和(23.12±0.44) g/L，生物量浓度分别为(1.88±0.033) g/L、(1.38±0.044) g/L和(0.38±0.15) g/L。发酵48 h后S288C和SHC01的生物量浓度基本一致，但SHC16生物量浓度仅为(4.08±0.13) g/L，较S288C降低15.53%。实验结果表明，外源基因ScCNS1和ScCNS2的表达增加了酵母细胞的代谢负担，同时胞内虫草素积累增大了细胞毒性，从而导致细胞生长及底物消耗速率降低。

2.2 液体发酵体系酵母工程菌基因表达分析

如图 1所示，磷酸戊糖途径(PPP) 及嘌呤代谢与虫草素代谢密切相关，葡萄糖进入细胞后，经PPP途径合成核糖-5-磷酸(R5P)，R5P可反应生成为5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP) 进入嘌呤代谢，参与合成腺苷等虫草素生物合成前体代谢物。ZWF1编码的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化葡萄糖-6-磷酸(G6P) 生成6-磷酸葡糖酸(6PG)，是PPP途径的关键酶；PRS4和ADE4编码的PRPP合成酶和酰胺转移酶是嘌呤代谢的两个关键酶，催化合成嘌呤代谢的重要中间产物PRPP和5-磷酸核糖胺(PRA)^[14-15]。

外源基因ScCNS1和ScCNS2的引入使得酵母工程菌SHC16能够代谢合成虫草素，本研究以SHC01为对照体系，分析了深层液体发酵体系SHC16的PPP途径、嘌呤代谢及虫草素合成途径关键基因ZWF1、PRS4、ADE4、ScCNS1及ScCNS2的表达情况。

如图 4所示，发酵过程中SHC16发酵液中虫草素持续积累，而SHC01由于缺少虫草素合成关键基因ScCNS1和ScCNS2而不合成虫草素。随着虫草素持续积累，SHC16中ScCNS1和ScCNS2基因表达不断上调，168 h后基因表达上调显著，240 h时基因表达量分别是30 h的26.86倍和9.14倍。推测可能随着发酵的进行底物葡萄糖耗尽，乙醇、有机酸等高浓度初级代谢产物被细胞吸收利用，使其对ScCNS1和ScCNS2基因表达的抑制得以解除。

图 4D-F显示，发酵后期SHC16与SHC01中PPP和嘌呤代谢途径关键酶编码基因ZWF1、PRS4和ADE4表达水平显著上调，168 h时SHC16中三者表达水平分别是SHC01的1.61倍、7.08倍和1.55倍。ZWF1、PRS4及ADE4基因表达水平上调表明PPP和嘌呤代谢途径通量可能增大，腺苷、腺嘌呤等参与虫草素合成的前体代谢物因此得到积累，进而有助于虫草素合成。PRS4编码的PRPP合成酶催化R5P合成PRPP，是嘌呤代谢第一步反应，发酵后期SHC16中PRS4的高水平表达显示PRPP的供给可能与虫草素代谢调控相关。

2.3 碳源对酵母工程菌虫草素代谢的影响

碳源作为培养基的主要成分，其选择对细胞生长和产物代谢有较大影响，研究表明在蛹虫草C. militaris液体发酵体系中虫草素积累的最适碳源为葡萄糖^[16]。本研究以酵母工程菌SHC16深层液体发酵体系为研究对象，探究了葡萄糖浓度以及添加方式对虫草素代谢的影响。初始葡萄糖浓度分别为30 g/L、50 g/L和100 g/L，此外在30 g/L和50 g/L葡萄糖发酵体系分别进行两次补料，补料时间分别为(30 h、60 h) 和(60 h、96 h)，补料后葡萄糖浓度分别为10 g/L和25 g/L。

如图 5A所示，30 g/L、50 g/L和100 g/L葡萄糖体系发酵240 h虫草素产量分别为(67.32±2.32) mg/L、(63.59±0.96) mg/L和(53.37±0.41) mg/L，较60 h分别提高206.69%、119.81%和25.31%。在60-240 h发酵期间，30 g/L和50 g/L葡萄糖发酵体系中虫草素产量持续积累，而100 g/L葡萄糖发酵体系中虫草素积累较缓慢。

比较30 g/L和50 g/L葡萄糖补料体系发现，补料后虫草素浓度明显升高(图 5A)，第一次补料后虫草素产量较无补料体系分别提高46.01% (60 h vs 30 h) 和57.78% (96 h vs 60 h)，表明碳源补料有利于虫草素积累。第二次补料后30 g/L葡萄糖补料体系虫草素继续积累，而50 g/L葡萄糖补料体系虫草素产量基本不变。50 g/L葡萄糖补料体系和100 g/L葡萄糖体系发酵终点酵母细胞存活率仅为71.37%和87.27% (图 5C)，较其他低糖发酵体系显著降低，可能是高糖厌氧发酵产生高浓度乙醇导致细胞活性降低，进而降低虫草素合成代谢通量。

进一步地，本研究以30 g/L葡萄糖为基础碳源设计了添加1%、3%和5% (V/V) 乙醇的发酵体系，以考察乙醇浓度对虫草素代谢的影响。由图 5B可知，随着乙醇添加量增大，发酵终点虫草素产量逐渐降低，同时细胞存活率也随之降低(图 5D)，当乙醇添加量为5% (V/V) 时，发酵240 h虫草素产量仅为(49.33±2.79) mg/L，较无乙醇添加组降低了26.72%。实验结果表明，底物补料有利于产物虫草素积累，但高浓度乙醇会降低细胞存活率，不利于虫草素积累。因此，在酵母细胞乙醇耐受范围内进行底物补料能够有效提高虫草素产量。

虽然30 g/L葡萄糖体系发酵240 h虫草素产量达到(67.32±2.32) mg/L，高于其他发酵体系，然而50 g/L葡萄糖补料发酵体系第一次补料后，96 h虫草素产量就达到了(60.76±1.83) mg/L，生产强度达到0.63 mg/(L·h)，较30 g/L葡萄糖发酵体系的0.28 mg/(L·h) 提高了124.60%。因此，将50 g/L初始葡萄糖并结合一次补料(在60 h补料至25 g/L葡萄糖) 确定为最适碳源策略。

2.4 氮源对酵母工程菌虫草素代谢的影响

本研究利用酵母工程菌SHC16开展深层液体发酵，在发酵培养基中添加5 mmol/L、10 mmol/L或15 mmol/L无机氮源(NH₄)₂SO₄或NaNO₃，以考察氮源对虫草素代谢的影响(图 6)。

如图 6所示，添加(NH₄)₂SO₄和NaNO₃后对菌体生长没有显著影响，生物量浓度均在4.93-5.17 g/L范围内。然而随着添加量增大，虫草素产量随之下降，其中添加15 mmol/L (NH₄)₂SO₄抑制较明显，240 h虫草素产量仅为(45.17±4.73) mg/L，较对照组降低了32.90%。虽然氮是虫草素的基本组成元素，且流加铵盐能够有效提高蛹虫草发酵体系的虫草素产量^[17-18]，然而在酵母工程菌SHC16发酵体系中高浓度氮源明显抑制了其虫草素代谢，表明NH₄⁺和NO₃^-不直接参与虫草素合成，而可能通过其他代谢途径影响虫草素合成。NH₄⁺作为糖酵解途径关键酶磷酸果糖激酶的激活剂，其浓度升高可以提高糖酵解途径通量^[19]，致使PPP途径代谢通量降低，进而降低虫草素产量。

2.5 前体对酵母工程菌虫草素代谢的影响

微生物代谢过程中前体物质能直接被结合到产物分子中，添加合适的前体物质能够有效提高产物的产量。在蛹虫草液体发酵体系，Sari等向发酵培养基中添加6.75 g/L腺嘌呤，虫草素产量提高了360.13%，达到6.24 g/L^[20]；Masuda等组合添加1 g/L腺嘌呤和16 g/L甘氨酸后，虫草素产量提高了309.84%，达到2.50 g/L^[21]。基于此，本研究选择了腺嘌呤(0.5 g/L、1 g/L和2 g/L) 和甘氨酸(8 g/L、16 g/L和20 g/L) 两种前体物质，考察其对SHC16发酵生产虫草素的影响。

随着腺嘌呤添加量增大，生物量浓度逐渐升高，当添加2 g/L腺嘌呤时，240 h生物量浓度达到(6.83±0.25) g/L，较对照组提高35.25%；虫草素产量在添加1 g/L腺嘌呤时达到峰值，为(121.46±1.61) mg/L，较对照组提高80.42% (图 7A)。添加甘氨酸对细胞生长没有显著影响，但明显影响虫草素合成，当添加20 g/L甘氨酸时，240 h虫草素发酵产量仅为(40.77±0.25) mg/L，较对照组降低了39.44% (图 7B)。研究表明，腺嘌呤作为虫草素合成的前体物质，对酵母工程菌SHC16中虫草素积累有明显的促进作用。

2.6 金属离子对酵母工程菌虫草素代谢的影响

金属离子与细胞的生长和代谢有着密切的关系，其过量或缺乏都会对细胞功能造成影响。本研究在YPD培养基中分别添加5 mmol/L Zn²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺和Cu²⁺，以探究其对酵母工程菌SHC16液体发酵生产虫草素的影响(图 8)。

由图 8可知，当添加5 mmol/L Cu²⁺时，生物量无显著变化，但对虫草素合成有积极影响，发酵240 h产量可达(96.56±2.74) mg/L，较对照组提高43.43%；添加Fe²⁺和Mg²⁺虽有利于细胞生长，但虫草素产量明显降低，Fe²⁺添加组虫草素产量仅为(9.97±1.36) mg/L，较对照组降低了85.19%。在蛹虫草深层液体发酵体系中，添加10 mmol/L Zn²⁺或6.58 mmol/L Fe²⁺能将虫草素发酵产量分别提高588.30%和70.45%^{[16, 22]}，然而在酵母工程菌SHC16中Fe²⁺和Zn²⁺却未表现出促进虫草素合成的能力，表明Fe²⁺和Zn²⁺不直接参与虫草素合成关键酶活性调节，推测可能是蛹虫草富集胞外金属离子诱发胞内氧化应激，进而调控虫草素合成途径关键基因表达。

2.7 酵母工程菌补料分批发酵生产虫草素

通过对碳源、氮源、金属离子及前体物质的优化，初步确定酵母工程菌SHC16液体发酵生产虫草素的培养基组成：50 g/L初始葡萄糖结合一次补料，并在培养基中添加1 g/L腺嘌呤和5 mmol/L Cu²⁺，其他成分与YPD培养基一致。为进一步提高虫草素发酵产量，本研究在5 L搅拌式发酵罐中利用酵母工程菌SHC16开展了补料分批发酵，在48 h进行补料(补料后糖浓度为25 g/L)，生物量、残糖、乙醇、虫草素浓度等参数如图 9所示。

如图 9所示，发酵24 h底物已基本耗尽，补料后生物量积累不明显，然而虫草素产量明显增加，144 h虫草素产量达到137.27 mg/L，生产强度达到0.95 mg/(L·h)，较未优化培养基的摇瓶发酵体系提高239.85%。乙醇浓度在96 h后逐渐降低，144 h乙醇浓度降到5.07 g/L，与此同时虫草素浓度逐渐升高，推测发酵后期由于底物葡萄糖耗尽，碳源供应不足，代谢产物乙醇作为碳源进入细胞代谢，乙醇消耗有助于恢复细胞活性，促进虫草素代谢。

3 讨论

虫草素作为一种核苷类抗生素，具有重要的医用价值和应用前景，构建基因工程菌株高效生产虫草素具有重要意义。本研究在酿酒酵母S. cerevisiae S288C中表达虫草素合成关键基因ScCNS1和ScCNS2，成功获得产虫草素的酵母工程菌SHC16。基因表达分析显示，发酵后期ScCNS1、ScCNS2、ZWF1、PRS4及ADE4基因表达显著上调，有助于增加PPP途径、嘌呤代谢及虫草素合成途径的代谢通量。通过优化发酵培养基中碳源、氮源、前体物质及金属离子发现：50 g/L初始葡萄糖并结合一次补料发酵96 h虫草素产量达到(60.76±1.83) mg/L，生产强度达到0.63 mg/(L·h)，较30 g/L葡萄糖发酵体系提高124.60%；添加1.0 g/L腺嘌呤或5 mmol/L Cu²⁺发酵体系240 h虫草素产量分别达到(121.46±1.59) mg/L和(96.56±2.74) mg/L，较对照组分别提高80.42%和43.43%。进一步地，在5 L搅拌式发酵罐中开展了补料分批发酵，144 h虫草素产量达到137.27 mg/L，生产强度达0.95 mg/(L·h)，较未优化培养基的摇瓶发酵体系提高了239.85%。

现阶段虫草素主要通过蛹虫草液体发酵液获得，包括静态液体发酵和深层液体发酵(表 3)。通过蛹虫草静态液体发酵可以获得较高产量的虫草素^{[20, 23-24]}，但发酵周期长、空间利用率低、生产强度低等劣势限制了其广泛应用。深层液体发酵技术具有生产强度高、空间利用率高、易大规模生产等优点，适合于目标产物的高效生产，但在蛹虫草深层液体发酵体系中，虫草素产量较低且发酵周期长^{[22, 25-26]}，难以实现工业化生产。因此，构建高产量、高强度的基因工程菌是实现虫草素高效生产的重要途径。

虽然本研究构建的产虫草素的酿酒酵母工程菌SHC16发酵产量暂不及蛹虫草发酵体系，但SHC16的发酵周期明显缩短，且虫草素生产强度已超过部分蛹虫草深层液体发酵体系(表 3)。酵母工程菌SHC16仍然具有巨大的提升空间，可基于代谢工程改造、过程工程优化等策略进一步提高虫草素产量或生产强度，如强化虫草素前体供应(过表达ZWF1、PRS4及ADE4基因等)、弱化虫草素分解途径(调控腺苷脱氨酶表达)、发酵分离耦合(降低虫草素的细胞毒性) 等，酵母工程菌深层液体发酵有望成为虫草素的主要供给途径。