2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 王寻, 冯资权, 王大儒, 韩月彭, 王小非, 沈向, 由春香
- WANG Xun, FENG Ziquan, WANG Daru, HAN Yuepeng, WANG Xiaofei, SHEN Xiang, YOU Chunxiang
- 多花海棠叶绿体基因组分析
- Chloroplast genome in Malus floribunda Siebold.
- 生物工程学报, 2022, 38(10): 3713-3727
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(10): 3713-3727
- 10.13345/j.cjb.220131
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文章历史
- Received: February 23, 2022
- Accepted: April 11, 2022
引用本文
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2. 中国科学院武汉植物园 中国科学院植物种质创新与特色农业重点实验室, 湖北 武汉 430074
2. Key Laboratory of Plant Germplasm Enhancement and Specialty Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Wuhan Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430074, Hubei, China
多花海棠(Malus floribunda Siebold.) 隶属蔷薇科(Rosaceae)、苹果亚科(Maloideae)、苹果属(Malus)[1-2]，多花海棠作为一类重要的苹果属栽培种，在世界范围内广泛栽培，因其花多且美，具有极高的观赏价值。本种叶不分裂，叶缘有锐锯齿；花蕾深紫红色，开花后颜色变浅，经由粉红色后至白色；果为深洋红色[2]。除了其优良的观赏特性[3]，多花海棠在种质评价和抗性育种中也起到重要作用[4-6]。研究发现，多花海棠中存在苹果黑星病(由苹果黑星病菌Venturia inaequalis Wint.引起) 抗性基因[7]，基于此材料的育种潜力，多国科学家先后将多花海棠抗黑星病特性通过杂交技术引入到新品种中，为苹果属抗病育种作出巨大贡献[8]。然而，多花海棠系统进化及资源分类等有关内容却不甚明晰，因此，开展遗传学、基因组学等研究对其变异检测和种质利用尤为必要。
叶绿体基因组研究作为一种手段，为植物种质资源鉴定与分类、起源演化与系统发育、遗传转化与基因工程等提供新的方向[9-10]。目前，部分苹果属植物叶绿体基因组已发布，涉及的材料包括山荆子(Malus baccata (L.) Borkh.)、湖北海棠(Malus hupehensis (Pamp.) Rehd.)、楸子(Malus prunifolia (Willd.) Borkh.)、变叶海棠(Malus toringoides (Rehd.) Hughes) 等。关于它们叶绿体基因组的比较分析也已有报道[11-13]，这极大地方便了苹果属植物的变异检测与种质利用。因此，完成叶绿体基因组图谱的构建和比较分析，对于揭示多花海棠的遗传特征和生物学地位等非常关键。
本研究基于全基因组测序数据，对多花海棠叶绿体基因组进行组装，并初步对其基因组组成、重复序列特征、密码子使用模式、序列相似性、系统进化关系等展开分析，为今后苹果属叶绿体比较基因组学研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 实验材料所用实验材料为多花海棠(Malus floribunda Siebold.)，样品取自国家苹果工程中心青岛苹果砧木研发中心。
1.2 实验方法 1.2.1 基因组建库及测序利用CTAB法提取多花海棠叶片的全基因组DNA，待质量检测后于Illumina平台建库测序，其中DNA测序文库的插入片段大小为350 bp。
1.2.2 叶绿体基因组组装与注释借助细胞器基因组组装工具GetOrganelle (https://github.com/Kinggerm/GetOrganelle)[14]获取多花海棠叶绿体基因组，选用从头组装工作流程，其中参数k值设定为21、45、65、85和125。Bandage (http://rrwick.github.io/andage/)[15]用于组装结果的确认。叶绿体基因组序列的注释在PGA (https://github.com/quxiaojian/PGA)[16]、PGAVAS2 (http://www.herbalgenomics.org/pgavas/)[17]中完成，而后人工检查并修正注释信息。使用OGDRAW软件(https://chlorobox.mpimp-golm. pg.de/OGDraw.html) 进行叶绿体基因组的可视化[18]。多花海棠叶绿体基因组已提交至NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，获得其登录号为OM115955。
1.2.3 叶绿体基因组特征及比较基因组学分析对于多花海棠叶绿体基因组GC含量、基因分类与内含子分布分别利用Perl程序等分析，MISA-web (https://webblast.ipk-gatersleben. e/misa/)[19]鉴定简单重复序列(参数保持默认)，REPuter (https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/ eputer)[20]识别叶绿体基因组中的散在重复序列(最小重复单元大小为30 bp)。CodonW (http://odonw.sourceforge.net/)[21]计算密码子使用情况。叶绿体基因组相似性比较利用Circoletto (http://tools.bat.infspire.org/circoletto/) 完成，多序列比对在mVISTA (https://genome.lbl.gov/ ista/mvista/submit.shtml)[22]中进行，叶绿体基因组区域边界比较利用IRscope (https://irscope. hinyapps.io/irapp/)[23]，使用HomBlocks (https://ithub.com/fenghen360/HomBlocks)[24]和MEGA_X (https://www.megasoftware.net/)[25]对不同物种进行系统进化分析。本文比较基因组学分析所用的叶绿体基因组来自NCBI数据库，具体信息参见表 1。
| Sample name | Family | Genus | Accession No. | Size (bp) |
| Malus baccata | Rosaceae | Malus | MK896774.1 | 160 024 |
| Malus hupehensis | Rosaceae | Malus | MK020147.1 | 160 065 |
| Malus sieboldii | Rosaceae | Malus | MT593044.1 | 160 040 |
| Malus toringoides | Rosaceae | Malus | MT483999.1 | 160 093 |
| Malus yunnanensis | Rosaceae | Malus | MH394387.1 | 160 067 |
| Malus prattii | Rosaceae | Malus | MH929090.1 | 160 239 |
| Malus prunifolia | Rosaceae | Malus | KU851961.1 | 160 041 |
| Malus floribunda | Rosaceae | Malus | OM115955 | 160 037 |
| Crataegus hupehensis | Rosaceae | Crataegus | MW201730.1 | 159 766 |
| Arabidopsis thaliana | Brassicaceae | Arabidopsis | NC_000932.1 | 154 478 |
| Oryza sativa | Poaceae | Oryza | NC_031333.1 | 134 502 |
经基因组测序并组装，获得一个完整的苹果属多花海棠叶绿体基因组，其总长为160 037 bp。根据序列与结构特征，多花海棠叶绿体基因组共分为4个区域，分别为大单拷贝区(large single-copy region, LSC, 1–88 142 bp)，反向重复区B (inverted repeat B, IRB, 88 143– 114 495 bp)，小单拷贝区(small single-copy region, SSC, 114 496–133 684 bp) 与反向重复区A (inverted repeat A, IRA, 133 685–160 037 bp)，结果见图 1。
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| 图 1 多花海棠叶绿体基因组图谱 Fig. 1 Genome map of Malus floribunda chloroplast. 箭头指示转录方向，阴影部分表示GC/AT含量 Arrows indicate the direction of transcription, and the shaded areas show GC/AT content. |
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经统计，多花海棠叶绿体基因组GC含量为36.6%，各区域GC含量组成分别为：LSC (34.2%)、IRB (42.7%)、SSC (30.4%)、IRA (42.7%)。对其序列进行注释发现，多花海棠叶绿体全基因组共129个基因(去重111个)，分别为84个蛋白编码基因(去重78个)、37个tRNA基因(去重29个) 和8个rRNA基因(去重4个)。大部分基因均为1个拷贝，其中蛋白编码基因rpl2、rpl23、ycf2、ndhB、rps12、rps7，tRNA基因trnI-CAU、trnL-CAA、trnV-GAC、trnI-GAU、trnA-UGC、trnR-ACG、trnN-GUU、trnM-CAU，rRNA基因rrn16、rrn23、rrn4.5、rrn5各有2个拷贝。由注释结果可知，蛋白编码基因依据功能可分为4类，包括参与光合作用的45个基因、用于自我复制的25个基因、其他类的5个基因以及功能未知的3个基因(表 2)。此外，对多花海棠叶绿体基因的内含子进行分析，发现大部分基因不含内含子，其中11个蛋白编码基因和8个tRNA基因分别含有1个内含子，另外4个基因rps12 (×2)、ycf3和clpP则各含有2个内含子，详细信息列于表 3。
| Gene category | Gene group | Gene name |
| Photosynthesis | Subunits of ATP synthase | atpA, atpB, atpE, atpF, atpH, atpI |
| Subunits of photosystem Ⅱ | psbA, psbB, psbC, psbD, psbE, psbF, psbH, psbI, psbJ, psbK, psbL, psbM, psbN, psbT, psbZ, ycf3 | |
| Subunits of NADH-dehydrogenase | ndhA, ndhB, ndhC, ndhD, ndhE, ndhF, ndhG, ndhH, ndhI, ndhJ, ndhK | |
| Subunits of cytochrome b/f complex | petA, petB, petD, petG, petL, petN | |
| Subunits of photosystem Ⅰ | psaA, psaB, psaC, psaI, psaJ | |
| Subunit of rubisco | rbcL | |
| Self replication | Large subunit of ribosome | rpl14, rpl16, rpl2, rpl20, rpl22, rpl23, rpl32, rpl33, rpl36 |
| DNA dependent RNA polymerase | rpoA, rpoB, rpoC1, rpoC2 | |
| Small subunit of ribosome | rps11, rps12, rps14, rps15, rps16, rps18, rps19, rps2, rps3, rps4, rps7, rps8 | |
| Others | Subunit of acetyl-CoA-carboxylase | accD |
| c-type cytochrome synthesis gene | ccsA | |
| Envelop membrane protein | cemA | |
| Protease | clpP | |
| Maturase | matK | |
| Unknown | Conserved open reading frames | ycf1, ycf2, ycf4 |
| Gene | Strand | Start | End | ExonⅠ (bp) | IntronⅠ (bp) | ExonⅡ (bp) | IntronⅡ (bp) | ExonⅢ (bp) |
| trnK-UUU | Reverse | 1 695 | 4 263 | 37 | 2 496 | 35 | ||
| rps16 | Reverse | 5 242 | 6 365 | 40 | 862 | 221 | ||
| trnG-UCC | Forward | 9 073 | 9 841 | 23 | 697 | 48 | ||
| atpF | Reverse | 12 509 | 13 796 | 144 | 732 | 411 | ||
| rpoC1 | Reverse | 21 933 | 24 719 | 435 | 740 | 1 611 | ||
| ycf3 | Reverse | 45 561 | 47 519 | 126 | 710 | 228 | 746 | 153 |
| trnL-UAA | Forward | 50 782 | 51 382 | 37 | 513 | 50 | ||
| trnV-UAC | Reverse | 54 932 | 55 599 | 39 | 591 | 37 | ||
| clpP | Reverse | 73 772 | 75 813 | 71 | 829 | 289 | 629 | 228 |
| petB | Forward | 78 751 | 80 195 | 6 | 796 | 642 | ||
| petD | Forward | 80 386 | 81 592 | 8 | 723 | 475 | ||
| rpl16 | Reverse | 85 132 | 86 528 | 9 | 988 | 399 | ||
| rpl2 | Reverse | 88 333 | 89 843 | 390 | 685 | 435 | ||
| ndhB | Reverse | 98 945 | 101 146 | 777 | 668 | 756 | ||
| rps12 | Reverse | 101 988 | 102 789 | 114 | 231 | 540 | 30 | |
| trnI-GAU | Forward | 106 586 | 107 605 | 42 | 942 | 35 | ||
| trnA-UGC | Forward | 107 670 | 108 549 | 39 | 806 | 34 | ||
| ndhA | Reverse | 124 919 | 127 143 | 552 | 1 132 | 540 | ||
| trnA-UGC | Reverse | 139 631 | 140 510 | 39 | 806 | 34 | ||
| trnI-GAU | Reverse | 140 575 | 141 594 | 42 | 942 | 35 | ||
| rps12 | Forward | 145 391 | 146 192 | 114 | 231 | 540 | 30 | |
| ndhB | Forward | 147 034 | 149 235 | 777 | 668 | 756 | ||
| rpl2 | Forward | 158 337 | 159 847 | 390 | 685 | 435 |
与其他4种苹果属相比，多花海棠叶绿体基因组大小与三叶海棠(Malus sieboldii) 的(160 040 bp) 为接近，多花海棠、山荆子、湖北海棠和三叶海棠的IR区长度基本一致，均小于变叶海棠的26 362 bp (表 1和表 4)。对于基因数目，多花海棠和山荆子叶绿体基因总数相同，而湖北海棠则多1个；多花海棠和湖北海棠具有相同的叶绿体编码基因数目；另外，5种苹果属植物都包含4个rRNA。
| Malus species | LSC length (bp) | SSC length (bp) | IR length (bp) | Gene number | CDS number | tRNA number | rRNA number |
| Malus floribunda | 88 142 | 19 189 | 26 353 | 111 | 78 | 29 | 4 |
| Malus baccata | 88 134 | 19 182 | 26 354 | 111 | 76 | 31 | 4 |
| Malus hupehensis | 88 166 | 19 193 | 26 353 | 112 | 78 | 30 | 4 |
| Malus sieboldii | 88 149 | 19 183 | 26 354 | 110 | 76 | 30 | 4 |
| Malus toringoides | 88 183 | 19 186 | 26 362 | 110 | 76 | 30 | 4 |
在多花海棠叶绿体全基因组中对简单重复序列(simple sequence repeats, SSRs) 进行鉴定，结果显示共识别73个SSR，包括27个A、4个C、39个T和3个AT重复(图 2A)。其中单核苷酸重复占到最大比重，3个二核苷酸重复分别是位于LSC区的(AT) 单元重复6次的2个SSR和位于SSC区的(AT) 重复6次的1个SSR。比较发现，三叶海棠和变叶海棠中分布的SSR数目分别为74和72，与多花海棠相类似(图 2A)。多花海棠叶绿体基因组中，SSR集中分布于LSC区和SSC区，尤以LSC区的SSR数目为最多(图 2B)。
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| 图 2 多花海棠叶绿体基因组简单重复序列 Fig. 2 SSRs of chloroplast genome in Malus floribunda. A：多花海棠和2种苹果属植物简单重复序列重复单元比较；B：多花海棠叶绿体中简单重复序列的基因组分布情况 (A) The comparison of SSRs between M. floribunda and two Malus species. (B) The distribution of SSRs in chloroplast genome of M. floribunda. |
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通过在多花海棠叶绿体基因组中搜索散在重复序列(interspersed nuclear elements, INEs) (图 3A)，识别正向重复(forward, F)、反向重复(reverse, R) 和回文序列(palindromic, P)，各28、5和24个。相比而言，变叶海棠叶绿体基因组中散在重复序列最多(58个)；而三叶海棠中则发现1个互补类型(complement, C) 的INE，其在多花海棠和变叶海棠中均不存在。对INE的序列长度分析发现(图 3B)，多花海棠叶绿体基因组中，大部分散在重复集中在30–35 bp，尤以30 bp数目为最多(17个)。
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| 图 3 多花海棠叶绿体基因组散在重复序列 Fig. 3 INEs of chloroplast genome in Malus floribunda. A：多花海棠和2种苹果属植物散在重复序列重复类型比较；B：多花海棠叶绿体基因组不同长度的散在重复数目 (A) The comparison of INE types between M. floribunda and two Malus species. (B) The numbers of different length of INEs in chloroplast genome of M. floribunda. |
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对多花海棠叶绿体基因组中密码子使用情况进行分析，通过计算相对同义密码子使用度(relative synonymous codon usage, RSCU) 得知，使用概率较高的密码子包括UUA (亮氨酸，Leu)、GCU (丙氨酸，Ala)、AGA (精氨酸，Arg)、UCU (丝氨酸，Ser)、GAU (天冬氨酸，Asp)、GGA (甘氨酸，Gly)、UAU (酪氨酸，Tyr)、ACU (苏氨酸，Thr) 等，它们的RSCU值均大于1.6。编码异亮氨酸(Ile) 的AUU、编码赖氨酸(Lys) 的AAA、编码谷氨酸(Glu) 的GAA出现次数较多，分别为1 104、1 040和1 008次；而密码子UGC (半胱氨酸，Cys) 在所有密码子中数目最少(75个)。由统计结果知(图 4)，编码Leu的密码子(共6种，即UUA、UUG、CUU、CUC、CUA和CUG) 在全部编码序列中数目最多，总计2 749个，编码Cys的密码子(UGU和UGC) 数目最少(共298个)。另外，注意到高频密码子(RSCU > 1) 共30种，而其中有29种以碱基A/T结尾，这说明多花海棠叶绿体基因组中密码子具有偏向A/T结尾的使用模式。
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| 图 4 多花海棠叶绿体基因密码子使用模式 Fig. 4 Codon usage mode of chloroplast genes in Malus floribunda. 横轴表示氨基酸及其对应密码子，纵轴代表相对同义密码子使用度 The horizontal axis represents amino acids and their corresponding codons, and the vertical axis represents relative synonymous codon usage. |
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基于多花海棠和同属叶绿体全基因组序列，通过局部比对研究了它们的同源性和相似性。由图 5可知，多花海棠与同属的山荆子、湖北海棠、三叶海棠和变叶海棠具有良好的共线性关系，比对区域基本覆盖各基因组。高相似的序列特征，表明这些苹果属植物叶绿体结构较为稳定。
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| 图 5 多花海棠叶绿体基因组相似性比较 Fig. 5 Similarity comparison of Malus floribunda chloroplast genome. 4种颜色的色带代表不同相对得分的比对区域，其中：红色 > 75%，蓝色≤25% The ribbons of four colors represent the comparison regions of different relative scores: red > 75%, blue≤25%. |
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为了比较多花海棠和苹果属的其他物种叶绿体基因组的变异热点区域，本文在NCBI数据库中获取了湖北海棠、变叶海棠、西蜀海棠(Malus prattii)、楸子、山荆子、三叶海棠、滇池海棠(Malus yunnanensis) 共7个叶绿体基因组。比对结果显示(图 6)，在叶绿体全基因组范围内，这些物种的序列较为一致，但是仍然存在部分区域差异较大，如rps16-trnK (UUU)、trnR (UCU)-atpA、atpH-atpF、trnT (GGU)-psbD、psbZ-trnG (GCC)、trnT (UGU)-trnL (UAA)、trnV (UAC)-ndhC、trnM (CAU)-atpE、accD-psaI、psaJ-rpl33、rps3-rpl16、rps19-rpl22、ndhF-trnN(GUU)、rpl32-trnL (UAG) 等。进一步暗示，苹果属植物叶绿体中这些区域为物种变异提供了基础，因此高度变异区域的比较对于研究物种进化以及鉴定具有重要的意义。
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| 图 6 多花海棠叶绿体基因组序列比对 Fig. 6 Sequence alignment of chloroplast genome in Malus floribunda. 横轴代表叶绿体基因组序列长度，纵轴表示相似性百分比 The horizontal axis represents the sequence length of chloroplast genome, and the vertical axis shows the percentage of similarity. |
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叶绿体基因组中4个边界区对于基因组的结构稳定以及基因组大小起到关键作用。对此，基于叶绿体基因组注释数据，文中比较了8个苹果属物种的SC区和IR区的边界扩张与收缩情况(以单子叶模式植物水稻和双子叶模式植物拟南芥作参考)。如图 7所示，虽然苹果属叶绿体基因组长度变化从160 024 bp (山荆子) 到160 239 bp (西蜀海棠)，但是它们的IR区大小差异较小(26 306–26 362 bp)。基因rps19在8个物种中均分布于LSC和IRB，并且在LSC- IRB边界都为159 bp (LSC) 和120 bp (IRB) 的组合方式(滇池海棠除外)。在IRB区和SSC区分界处，ycf1基因在不同植物中有所区别，除多花海棠和滇池海棠未注释到ycf1，湖北海棠、西蜀海棠、三叶海棠和变叶海棠的ycf1都位于IRB一侧，并未跨越边界，而山荆子和楸子的均有8 bp落在SSC区域。另外一个值得注意的基因是trnH，虽然它在8个苹果属植物中都位于LSC区，但是它们距离IRA和LSC边界的距离是不同的，分别有32、38、94 bp等。此外，比较分析发现，单子叶植物水稻与双子叶的拟南芥和苹果属植物相比，边界基因在长度和位置上均存在较大差异。与苹果属植物不同，拟南芥JSB连接位点的ndhF基因向IRB区偏移量更大，而水稻ndhF基因则全部位于SSC区；在拟南芥中，LSC与IRB边界的rps19更偏向IRB侧，而水稻rps19则完全落入IRB区。
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| 图 7 多花海棠叶绿体基因组边界分析 Fig. 7 Boundary analysis of chloroplast genome in Malus floribunda. JLB、JSB、JSA、JLA代表叶绿体基因组边界区域4个连接位点 JLB, JSB, JSA and JLA represent four junction sites in the boundary region of chloroplast genome. |
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多花海棠叶绿体基因组的组装对其生物学进化地位的阐释有着重要价值。以山楂属(Crataegus) 湖北山楂(Crataegus hupehensis) 作外类群，将多花海棠和其他7种苹果属植物基于叶绿体基因组构建系统进化树(图 8)。由于邻接树分支上支持值均大于60%，说明结果是较为可靠的。图中显示所有物种共聚为两大类，分别是外类的山楂属以及苹果属；苹果属又分3支，其中滇池海棠单独为一支，多花海棠、湖北海棠和变叶海棠组成一支，西蜀海棠、楸子、山荆子和三叶海棠划分为另一进化支。另外，根据进化距离可以看出，多花海棠在其所在聚类支中分化较早。本文的拓扑结构与先前高源等[9]利用叶绿体片段序列进行的苹果属遗传多样性研究结果较为相似，同时，李亚楠[11]对苹果属的划分也在本研究的进化关系中得到支持。
3 讨论与结论多花海棠是世界上种植较为普遍的苹果属栽培种，具有较高的观赏和育种价值。本研究通过DNA测序获得了完整的多花海棠叶绿体基因组，与此同时，借助生物信息学技术，对其进行基因注释、序列比对、边界分析等。利用二代短读测序数据，从头组装得到一个长度为160 037 bp具有环状结构的多花海棠叶绿体DNA，序列总长与同属的山荆子(160 024 bp)[26]、湖北海棠(160 065 bp)[27]、楸子(160 041 bp)[28]、变叶海棠(160 093 bp)[13]等相比是较为接近的。而与不同属的漆树科盐肤木属盐肤木(Rhus chinensis Mill., 158 809 bp)[29]、蔷薇科桃属长柄扁桃(Amygdalus pedunculata Pall., 157 851 bp)[30]、蔷薇科栘[木衣] 属长爪[木衣] (Docynia longiunguis Q. Luo & J. L. Liu, 158 914 bp)[31]等叶绿体基因组长度差别较大。
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| 图 8 基于叶绿体基因组的多花海棠的系统进化和聚类分析 Fig. 8 Systematic evolution and cluster analysis of Malus floribunda based on chloroplast genome. 标尺代表进化距离，多花海棠位置用黑色圆圈标出 The scale represents the evolutionary distance, and the position of M. floribunda is circled in black. |
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分析获知多花海棠叶绿体基因组包含4个保守的经典区域，分别为大单拷贝区(88 142 bp)，反向重复区B (26 353 bp)，小单拷贝区(19 189 bp) 与反向重复区A (26 353 bp)。边界分析发现，其与苹果属的其他植物在IR区域长度差别不大，进一步说明反向重复区在维持叶绿体基因组的结构稳定与功能保守等方面发挥积极作用。通过对多花海棠叶绿体基因组注释，共获得78个蛋白编码基因，与多脉铁木(79个)[32]、矮牡丹(78个)[33]中的数目是接近的。经对比，苹果属的湖北海棠叶绿体基因组也具有78个编码基因。进一步对多花海棠叶绿体编码基因的密码子使用模式进行计算，发现密码子具有偏向A/T结尾的特征，并且使用UAA作为终止密码子的概率更高(RSCU=1.71)。类似的结果在球花石斛[34]、大花君子兰[35]、杜梨[36]中也已报道。
基于叶绿体DNA比较植物种间多样性和遗传变异，一直以来都是研究热点问题。目前，在苹果属中进行了大量报道。高源等借助trnH- psbA、trnS-trnG spacer+intron、trnT-5′trnL和5′trnL-trnF这4个叶绿体基因间区对新疆野苹果[37]、山荆子[38]和楸子[39]等多态性变异位点进行了检测并对不同居群种质的系统演化展开探讨；李亚楠通过对91个叶绿体基因组构建系统发育树并结合前人分类，建议将苹果属划分为2亚属，8组，25种[11]。在本文的研究中，通过叶绿体全基因组比对，发现8个苹果属植物中存在trnV (UAC)-ndhC、trnT (GGU)-psbD和trnR (UCU)-atpA等高度变异区域，此外，系统聚类关系表明多花海棠、湖北海棠和变叶海棠在进化上较为紧密且独立。
由比较基因组学分析得知，相较于单子叶模式植物水稻和双子叶模式植物拟南芥，多花海棠与苹果属内其他种序列相似性更高。同时注意到，不同物种叶绿体基因在排列顺序和位置上不尽相同，例如禾本科水稻中SSC与IR区边界处ycf1基因发生退化缺失[40]，使得SSC区缩小、基因偏移。这一情况与拟南芥和苹果属植物等明显不同，推测可能与物种分化有关。因此，在今后的研究中，应多加关注物种间的序列差异以及变异特性。
本研究基于高通量测序获得了多花海棠叶绿体全基因组序列，对其序列特征、基因功能、全局比对等展开分析，并借助生物信息学和比较基因组学手段，在叶绿体基因组层面比较了不同的苹果属种质的遗传多样性，可为今后深入挖掘分子标记、揭示物种进化提供参考。
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