磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PEPC) 普遍存在于各种植物中，是光合作用中极其重要的一种酶。它在HCO₃[t1] ⁻在下催化PEP发生β-羧化反应，结合Mg²⁺产生草酰乙酸(oxaloacetic acid, OAA) 和Pi^[1]，此反应步骤是C4植物和景天酸代谢植物固定和同化CO₂的重要步骤，对其光合作用有重要意义^[2]。据报道，PEPC不仅在光合作用和糖积累^[3-4]中发挥重要作用，在其他生物学过程中也处于关键地位。如通过维持植物细胞离子平衡，从而调节气孔运动^[5]，调节植物的抗逆能力^[6]，参与调控果实成熟^[7]，参与豆科固氮过程^[8]，还参与种子发育过程的营养物质代谢，控制糖类转化为脂肪或蛋白质等^[9]。

目前，PEPC基因家族在多种植物中已有研究，如在拟南芥中共鉴定出4个PEPC家族成员，水稻中共鉴定出6个PEPC家族成员^[10]。PEPC基因家族成员根据其磷酸化结构的区别，将其分为植物型PEPC (plant-type PEPC, PTPC) 和细菌型PEPC (bacterial-type PEPC, BTPC) 两类，其中细菌型PEPC序列的N端不含磷酸化结构^[11]。

苹果(Malus domestica. Borkh.) 是世界四大果树之一。目前，我国苹果栽培面积、总产量、人均占有量与出口量均居世界第一^[12]，在全世界范围内几乎各个苹果生产国都倡议采用优质多分枝苗木建园，以达到早产、丰产的目的。有研究表明植物碳水化合物影响分枝发育^[13]。Kebrom和Mullet研究发现，光合作用的叶片面积以及植物通过光合作用产生糖的相关能力对调控植物腋芽萌发有重要作用^[14]。PEPC基因在光合作用中发挥重要作用，但其影响苹果腋芽萌发的研究未见报道。本研究拟在苹果全基因组中鉴定MdPEPC家族成员，并对其理化性质、系统发育、结构特征、保守基序、顺式作用元件、表达模型等进行分析，并通过去顶和噻重氮苯基脲(thidazuron, TDZ) 处理后苹果腋芽转录组数据锁定调控苹果腋芽萌发的候选基因，为后续研究该基因在苹果腋芽萌发中的作用奠定前期基础。

本研究田间试验在河北省蠡县小陈乡小陈村进行，试验材料为嫁接在八棱海棠上的一年生苹果苗木‘SH40’，于2021年7月4日进行去除顶芽和5 mmol/L外源TDZ处理。选择顶梢下部饱满芽，自上而下连续标记6−8个腋芽，每组处理30−40株苗，处理时直接喷施试剂到腋芽上。处理后4、8、12、24、48 h进行腋芽取样，液氮速冻，–80 ℃保存待用。不同处理4–48 h的腋芽样品由天津诺禾致源生物信息科技有限公司进行转录组测序。

在NCBI网站(National Center for Biotechnology Information (nih.gov)) 下载苹果全基因组及注释信息，在pfam网站(Pfam: Home page (xfam.org)) 下载PEPC隐马尔可夫模型(PF00311)，利用TBtools软件筛选关键结构域^[15]，确定基因家族成员，于ExPASy网站(ExPASy-ProtParam tool) 分析蛋白质理化性质^[16]，Plant-mPLoc网站(Plant- mPLoc server (sjtu.edu.cn)) 进行亚细胞定位分析。

从NCBI网站下载苹果和拟南芥全基因组蛋白序列，从中提取苹果和拟南芥PEPC家族成员蛋白质序列，利用MEGA 7软件构建NJ进化树。利用DNAMAN软件进行序列对比，并利用MEME-suite (http://meme-suite.org/tools/ meme) 分析蛋白质保守基序，用TBtools绘制motif图，基序宽度为5到60，最大基序数设为10。

利用TBtools分析基因家族成员的结构并获取基因在染色体的位置进行可视化。

提取苹果MdPEPC基因5′端上游2 000 bp的序列作为启动子区域，上传至PlantCare (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/) 在线工具分析其顺式作用元件^[17]，利用TBtools进行可视化分析。

利用MCScanX进行共线性分析，并且利用TBtools进行可视化。

从苹果多维组学数据库(AppleMDO) 中获取6个MdPEPC基因的表达谱^[18]。其中包括组织/器官和不同发育阶段(中央种子、侧种子、茎、叶、花、花瓣、柱头、花柱、子房、花药、花丝、萼片、花托、花粉、4个休眠芽期、破蕾期、14个果实发育阶段) 共36个，从盛开后1周到收获、成熟果皮和果肉在数据库中，所有RNA-seq数据都已得到质量控制，并且可以从数据库中提取每千个碱基的转录每百万映射读取的碎片(fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM值)。表达热图由TBtools软件绘制。

转录组测序后，调取苹果MdPEPC基因相关的表达量数据，在Excel中对其进行处理与整理。利用TBtools对数据进行标准化并绘制热图。

在苹果全基因组(GDDH13.1-1) 中鉴定出6个MdPEPC家族成员，根据其在染色体的位置依次命名为MdPEPC1–MdPEPC6，并对其进行理化性质分析(表 1)。MdPEPC家族成员的氨基酸序列长度为967−1 041 aa。等电点范围为5.97−6.51，均小于7，表明该家族成员为酸性蛋白。相对分子质量在110.225−117.261 kDa之间。所有成员的不稳定系数均大于45，表明其为不稳定蛋白，且平均亲水系数均小于0。亚细胞预测其均定位于细胞质。

苹果中6个MdPEPC基因分布于6条染色体上，染色体号为Chr03、Chr09、Chr11、Chr13、Chr16和Chr17 (图 1)。

图 1 苹果MdPEPC家族成员的染色体分布 Fig. 1 Chromosome distribution of MdPEPC family in apple.

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为了探索苹果MdPEPC家族的系统进化关系，将苹果和拟南芥的PEPC家族蛋白序列共同构建进化树(图 2A)，以及N端和C端的序列进行比对分析(图 2B)。结果表明，苹果MdPEPC家族成员分为两大亚类(Group Ⅰ和Group Ⅱ)，其中苹果MdPEPC1–3、MdPEPC6和拟南芥AtPPC1–3的N末端都含有植物磷酸化结构域，C末端为高度保守的QNTG残基，具有植物型PEPC的特征，聚为Ⅰ组，属于植物类PEPC；而MdPEPC4和MdPEPC5的N末端不存在磷酸化结构域，并且C末端由一些细菌所含有的RNTG序列组成，属于细菌类PEPC，与拟南芥AtPPC4聚为Ⅱ组。

图 2 苹果和拟南芥PEPC家族系统进化树和序列比对分析 Fig. 2 Phylogenetic tree and sequences alignment of PEPC family members in apple and Arabidopsis. (A) Phylogenetic tree of the PEPC in apple and Arabidopsis. (B) Sequences alignment of the N terminus and C terminus of PEPC family.

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对苹果MdPEPC蛋白的保守结构域分析表明，两个亚组中MdPEPC蛋白保守基序的顺序一致，均按照motif 9-motif 5-motif 3-motif 10-motif 4-motif 8-motif 2-motif 6-motif 1-motif 7的顺序排列，且处于同组中各成员的保守基序位置相似(图 3)。

图 3 苹果MdPEPC蛋白保守基序分析 Fig. 3 Conserved motifs of MdPEPC proteins in apple.

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对苹果MdPEPC家族成员基因结构分析表明，处于Ⅱ组中的MdPEPC4和MdPEPC5基因结构相似，且外显子数量均为20个，剩余处于Ⅰ组的4个MdPEPC基因的外显子个数分别为10个或11个(图 4)。

图 4 苹果MdPEPC基因结构 Fig. 4 The gene structure of MdPEPC in apple.

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片段重复和串联重复是基因复制的重要来源。苹果MdPEPC线性分析结果显示，该家族成员中不存在串联重复基因对。相反地，片段重复则是同源基因分布于不同染色体上，共鉴定出7对片段重复(MdPEPC1/MdPEPC2, MdPEPC1/MdPEPC3, MdPEPC1/MdPEPC6, MdPEPC2/MdPEPC3, MdPEPC2/MdPEPC6, MdPEPC3/MdPEPC6, MdPEPC4/MdPEPC5)，其中MdPEPC4和MdPEPC5与苹果4个植物型PEPC均不存在片段重复(图 5)。

图 5 苹果MdPEPC基因共线性分析 Fig. 5 Gene collinearity analysis of MdPEPC genes in apple.

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为研究MdPEPC基因对各种反应的应答作用，本研究对其上游2 000 bp启动子序列中的顺式作用元件进行预测(图 6)。结果显示，MdPEPC基因的顺式作用元件数量在11 (MdPEPC6)−33 (MdPEPC3) 之间。其中，与光信号(light) 相关的响应元件最多，为55个；激素相关的响应元件共41个，其中包含生长素(auxin)、脱落酸(abscisic acid)、赤霉素(gibberellin)、茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA) 等，此外还包含一些逆境响应元件，如干旱(drought-inducibility)、低温(low-temperature) 等(图 6)，表明MdPEPC基因家族成员不仅受到光、温度等外界环境的影响，还受多种激素调控，从而参与植物体内各类生命活动从而影响苹果的生长发育。

图 6 苹果MdPEPC基因启动子顺式作用元件分析 Fig. 6 Analysis of cis-acting elements in the promoter regions of MdPEPC genes. Different numbers in the boxes of the heatmap represent the number of cis-elements.

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为分析苹果MdPEPC基因在不同组织/器官和发育阶段中的表达模式，从Apple多维组学数据库(AppleMDO) 中获得了该家族成员的表达谱(图 7)。在所有表达谱中，每百万千碱基片段数值(FPKM) 小于1的MdPEPC基因被认为几乎不表达^[19]，因此6个MdPEPC基因并没有在所有组织/器官中表达。如图 7所示，MdPEPC1在果实生长成熟过程中表达量逐渐降低，在成熟果肉中表达量较低。MdPEPC2的表达模式则与MdPEPC1相反，其在果实生长成熟过程中逐渐升高，在成熟果肉中表达量较高。MdPEPC3在检测的组织器官中均有表达，且在花器官中表达量相对较高。MdPEPC6在除花粉(pollen) 外的其他组织/器官中均有较高表达。此外，位于Ⅱ组中的MdPEPC4和MdPEPC5除在个别组织/器官中有表达外，在其他组织/器官中表达量均较低，且除MdPEPC4和MdPEPC5外，其他基因均在不同时期芽中有表达。

图 7 苹果MdPEPC在不同组织/器官和发育阶段的表达模式热图 Fig. 7 Heatmap of the expression pattern of MdPEPC genes in various tissues/organs and developmental stages.

图选项

为后期进一步探索苹果MdPEPC基因在腋芽萌发中的作用，从去顶和TDZ处理后的苹果腋芽转录组中对该家族成员在不同处理时期的表达量进行筛选和分析(图 8)。结果显示，MdPEPC1和MdPEPC3基因在去顶后不同时期上调表达，且在TDZ处理后48 h明显上调表达；MdPEPC2基因在去顶和TDZ处理后48 h明显下调表达，表明其可能参与调控苹果腋芽萌发。

图 8 苹果MdPEPC在去顶(A) 和TDZ (B) 处理后腋芽转录组中的表达水平分析 Fig. 8 MdPEPC gene expression level in transcriptome data of apple axillary buds after decapitation (A) and TDZ treatments (B). "C": control; "decap": decapitation; "4, 8, 12, 24, 48": indicated time (hours, h) after treatments.

图选项

基于苹果全基因组，本研究共鉴定出6个MdPEPC家族成员。MdPEPC蛋白的理化性质相对稳定，亚细胞定位预测均位于细胞质中，与前人在杨梅、木薯等的研究结果相似^{[11, 20]}。将苹果和拟南芥的PEPC蛋白共同构建系统发育树，并对其保守性进行分析，结果显示PEPC分为Group Ⅰ和Group Ⅱ两个亚族(图 2)。据报道，PEPC分为植物型(PTPC) 与细菌型(BTPC) 两种类型，其最显著的区别在于植物型的N端存在一个丝氨酸残基，而细菌型不存在^[21-22]，且丝氨酸残基处可发生可逆磷酸化^[23]。可逆磷酸化是C4和景天酸代谢(crassulacean acid metabolism, CAM) 光合作用中初级碳固定的关键调节机制^[24]。拟南芥PEPC家族成员AtPPC1、AtPPC2和AtPPC3为植物型(PTPC)，且都聚类在Ⅰ组，AtPPC4为细菌型(BTPC)，聚类在Ⅱ组^[10]，因此我们推测聚类在Ⅰ组中的苹果MdPEPC家族成员属于植物型PEPC，聚类在Ⅱ组中的MdPEPC4和MdPEPC5则为细菌型PEPC。保守基序分析发现所有MdPEPC蛋白预测的10个保守基序顺序和位置基本一致，但亚组之间略有差异，这可能是形成结构域差异的主要原因之一。顺式作用元件调控基因的表达^[25]，预测发现MdPEPC家族成员的顺式作用元件主要有光响应元件，这可能与其参与光合作用途径有关；其次含有多种激素响应元件，如生长素、脱落酸以及赤霉素等与分枝相关的激素作用元件^[26]，表明其可能响应相关激素参与苹果分枝发育。近些年来，一些研究也表明PEPC基因家族参与非生物胁迫反应^[27-29]。

PEPC基因在植物组织中表达具有特异性。例如木薯MePEPC1在功能叶中表达最高，MePEPC5在花中有较高表达^[20]，菠萝AcPEPC1在叶片中的表达量较高，在根和花中的表达较低，AcPEPC3同样呈现相反的趋势^[30]，杧果MiPEPC2在种子中的表达量相对较高，MiPEPC3在花穗、果皮和果肉有较高表达^[9]，榴莲DzPEPC2在茎中高表达，DzPEPC4和DzPEPC5在果肉中有较高表达^[31]，橡胶树HbPPC1在叶片具有较高表达量，HbPPC2在树皮、雄花、雌花也有较高的表达量^[32]。据报道，PEPC基因在柑橘果实成熟过程中起到两个重要作用：早期柠檬酸的合成和最后阶段或收获后NADH的再氧化^[7]。在成熟香蕉中PEPC的整体活性与NH₄⁺同化和转氨反应所需的碳骨架的生成紧密平衡^[33]。在番茄果实发育中，PEPC基因主要功能为合成有机酸，作为液泡中积累的钾离子的反离子，从而允许果实在快速生长阶段发生细胞增大，在葡萄果实发育中PEPC也参与调节有机酸和糖水平^[3-4]。同样，本研究中的表达谱分析发现苹果PTPC类基因MdPEPC1在果实生长成熟过程中表达量逐渐降低，MdPEPC2基因则与其表达模式相反(图 7)，推测这两个基因可能在果实成熟过程中有作用。此外，与PTPC型基因相比，苹果BTPC型基因MdPEPC4和MdPEPC5在所检测的组织/器官中表达量均相对较低，且4个苹果PTPC型基因在苹果芽不同时期均有表达(图 7)，表明其可能参与分枝发育。

研究发现，去除植物顶芽可降低生长素的合成，从而减少顶端优势，促进侧芽的萌发^[33]，TDZ具有很强的细胞分裂素活性，可直接促进植物腋芽萌发^[34-36]。苹果中，去顶和外源细胞分裂素处理可显著诱导其腋芽萌发^[37]，通过对去顶和TDZ处理后苹果腋芽转录组数据中苹果MdPEPC家族成员的表达量筛选和分析发现，MdPEPC1和MdPEPC3响应去顶处理上调表达，且在TDZ处理后48 h检测到明显上调表达，表明其可能具有促进腋芽萌发的功能；而MdPEPC2基因在去顶和TDZ处理后48 h表达量明显下调，表明其可能在调控腋芽萌发中与MdPEPC1和MdPEPC3具有相反作用，但仍需进一步深入地研究进行验证。

目前关于光合作用调控植物分枝发育的研究较少，且相关基因的数量和功能研究深度均不足。本研究通过分析与光合作用相关的PEPC基因家族成员，鉴定出6个苹果MdPEPC基因，其中4个为植物型PEPC，2个为细菌型PEPC，并对其进行了相关生物信息学分析以及通过调取去顶和TDZ处理的苹果腋芽转录组数据筛选出MdPEPC1、MdPEPC2和MdPEPC3作为调控腋芽萌发的候选基因，为进一步验证MdPEPC基因在调控苹果侧枝发育中的作用奠定前期基础。