2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 杨小涵, 伍国强, 魏明, 王北辰
- YANG Xiaohan, WU Guoqiang, WEI Ming, WANG Beichen
- 甜菜BvHAK基因家族全基因组鉴定及其在盐处理下的表达分析
- Genome-wide identification of BvHAK gene family in sugar beet (Beta vulgaris) and their expression analysis under salt treatments
- 生物工程学报, 2022, 38(10): 3773-3789
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(10): 3773-3789
- 10.13345/j.cjb.220257
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文章历史
- Received: April 5, 2022
- Accepted: July 18, 2022
引用本文
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盐胁迫是制约全球农作物生长和产量的主要环境因素之一[1]。全球盐碱地面积多达9.5亿hm2，约占陆地总面积的7%[2]。我国是世界上土壤盐碱化最为严重的国家之一，盐渍化土地面积多达0.99亿hm2，约占全国土地面积的1/10，主要分布在西北、华北、东北及沿海地区[3]。绝大多数农作物、尤其是甜土植物(glycophytes) 对盐分很敏感[4]。土壤中高浓度盐分会扰乱植物对N、P、K等元素的吸收，产生离子毒害及渗透胁迫并诱发氧化胁迫，从而抑制生长、甚至导致作物的绝产[5-6]。当植物遭受盐胁迫时，介质中的Na+将通过根系非选择性阳离子通道(non-selective cation channels, NSCCs) 和高亲和性K+转运蛋白(high-affinity K+ transporters, HKTs) 进入细胞，高浓度Na+会紊乱离子的稳态平衡[7-8]。因此，维持或重建离子平衡对植物应答盐胁迫至关重要。
植物主要通过大量吸收K+和外排Na+来维持体内离子稳态平衡，以抵御盐胁迫[9]。HAK/KUP/KT (high-affinity K+ transporter/K+ uptake permease/K+ transporter) 家族是植物中最大的K+转运蛋白家族之一，其在盐胁迫下通过电化学梯度介导高亲和性K+吸收，从而维持植物体内K+/Na+稳态平衡，增强植物的耐盐性[10]。在拟南芥(Arabidopsis thaliana) 中，AtKUP6和AtKUP11受盐胁迫的诱导并上调表达[11]。研究表明，过量表达水稻(Oryza sativa) OsHAK5使转基因烟草植株体内K+积累显著增加，从而提高植株的耐盐性[12]。目前，HAK基因家族已在许多物种中被鉴定，包括大豆(Glycine max)[13]、葡萄(Vitis vinifera)[14]、橡胶树(Hevea brasliensis)[15]、马铃薯(Solanum tuberosum)[16]、香蕉(Musa acuminata)[17]、油菜(Brassica napus)[18]、小麦(Triticum aestivum)[19]等。然而，在糖料作物中尚未见HAK基因家族研究的报道。
在我国北方地区广为种植的糖料作物甜菜(Beta vulgaris L.) 为藜科(Chenopodiaceae) 甜菜属(Beta) 二年生草本植物，属于典型的嗜盐作物，具有很强的耐盐碱性和出色的耐贫瘠性，是盐碱地轮作和改良的重要作物[20]。研究表明，添加适量NaCl (15−100 mmol/L) 不仅能够显著促进甜菜幼苗生长，而且还能明显减缓渗透胁迫对其造成的不利影响；即使在未添加NaCl的条件下，渗透胁迫后的甜菜叶中仍能够维持K+/Na+稳态平衡[21]。本课题组前期基于甜菜基因组数据库[22]，采用生物信息学手段，挖掘和鉴定出BvNHX[23]、BvWKRY[24]、BvSnRK2[25]和BvCIPK[26]基因家族成员，并阐明了它们在甜菜响应盐胁迫中的作用机制。然而，目前尚未见对甜菜BvHAK基因家族成员鉴定及其盐处理下表达分析的报道。
鉴于此，本研究对甜菜BvHAK基因家族进行全基因组鉴定及表达模式分析，探究BvHAK在甜菜响应盐胁迫中的作用，以期为农作物抗逆性遗传改良提供基因资源和理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料供试甜菜(B. vulgaris L.) 品种为“甘糖7号”，种子购自甘肃省威武三农种业科技有限公司。挑选籽粒饱满的种子，播种至装满蛭石的育苗盘(5 cm×5 cm×5 cm; 32孔)，每孔播3粒种子。用蒸馏水浇灌，待种子萌发后，使用改良的1/2 Hoagland营养液浇灌。待出苗两周后，进行间苗，每孔留1株生长均匀一致的幼苗。幼苗培养条件：温度25 ℃/20 ℃ (昼/夜)，光周期16 h/8 h (昼/夜)，光照强度550−600 μmol/(m2·s)，空气相对湿度65%−75%。培养至4周龄的甜菜幼苗，分别用0 (对照)、50、100和150 mmol/L NaCl处理72 h后，地上部和根分开取样，3次生物学重复，经液氮速冻后置于–80 ℃冰箱保存备用[27]。
1.2 甜菜BvHAK基因家族成员的鉴定利用拟南芥基因组数据库TAIR (http://wwwarabidopsis.org) 获得13个AtHAK基因的氨基酸序列[28]。然后利用NCBI基因组数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov) 和甜菜基因组数据库(http://bvseq.boku.ac.at/index.shtml)，通过BLAST在线搜索BvHAK基因家族成员序列[29]。BvHAK预选蛋白的所有同源蛋白序列均满足期望值(E) < 10–40。
通过ExPASy (http://web.expasy.org/) 在线数据库计算BvHAK基因家族成员的等电点(isoelectric point, pI) 和分子量(molecular weight, MW)[30]。通过在线软件Plant-mPLoc (http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/) 预测BvHAK基因家族成员的亚细胞定位[31]。采用TMHMM 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/serbices/TMHMM) 鉴定BvHAK基因家族编码蛋白的跨膜结构域(transmembrane domain, TM)[32]。
1.3 甜菜BvHAK染色体分布分析利用甜菜基因组数据库确定BvHAK基因家族成员在染色体上的定位，并通过MapInspect 1.0软件(http://mapinspect.software.informer.com/) 绘制BvHAK基因家族成员在染色体上的分布图[33]。
1.4 HAK家族系统进化关系及dN/dS分析为探究HAK基因家族进化及系统发育关系，采用MEGA X软件(http://www.megasoftware.net/) 对拟南芥、水稻、玉米(Zea mays)[34]、大麦(Hordeum vulgare)[35]、小麦[36]、白杨(Populus alba)、菠菜(Spinacia oleracea) 和甜菜等9个物种111个HAK基因家族蛋白序列进行系统进化分析，并通过邻接比对(neighbor-joining, NJ) 法以1 000重复算法构建系统进化树[37]。采用PAL2NAL在线软件(
利用在线工具MEME 5.4.1 (https://meme-suite.org/meme/) 预测BvHAK基因家族成员的蛋白质保守基序(motif)，基序的最大数目为10，宽度设置为6−50。采用GSDS在线网站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) 分析BvHAK基因家族成员的基因结构[39]。通过将编码区序列(coding domain sequence, CDS) 与相应基因组序列(http://bvseq.boku.ac.at) 进行比对，生成BvHAK基因家族成员的外显子/内含子结构图。
1.6 甜菜BvHAK家族蛋白三维结构和互作网络分析利用SWISS-MODEL在线软件(https://swissmodel.expasy.org/interactive) 预测了BvHAK蛋白的三维结构(three-dimensional structure, 3-D) 模型[40]。利用STRING在线数据库(http://string-db.org) 进行蛋白与蛋白相互作用预测。
1.7 甜菜BvHAK基因家族成员顺式作用元件和基因表达模式分析利用plantCARE在线软件(http://bioinformation.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html) 预测BvHAK基因家族成员启动子中可能存在的各种顺式作用调控元件[41]。
采用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海) 股份有限公司) 对不同浓度NaCl处理的甜菜根和叶进行总RNA提取，利用cDNA第一链合成试剂盒(PrimeScriptTM RT Master Mix, TaKaRa) 合成cDNA第一链。采用Primer Premier 5.0和Oligo7.0软件设计用于qRT-PCR分析的基因特异性引物(表 1)[42]。按照荧光实时定量PCR试剂盒(TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ, TaKaRa) 进行qRT-PCR反应[43]。BvACTIN作为内参基因。通过2–ΔΔCt方法进行计算BvHAK基因的相对表达水平。所有的结果均以3个生物学重复的平均值±SE表示，每个生物学重复由3个技术重复组成。采用SPSS 22.0软件分析显著性差异水平(P < 0.05)，并用Excel 2010作图[44]。
| Gene name | Forward primer (5′→3′) | Reverse primer (5′→3′) |
| BvHAK1 | CTACAAACACGAATTAATGGCTTCT | AAAGCCAACCGCAGAAGCAATAG |
| BvHAK2 | GCACAATGGATTTATCAACTCACCC | CAGAATACCAAAGAAAGAACACCAAA |
| BvHAK3 | AATGTAAGCAGTAACAATGAGCAAGA | GCGGAATGACCACCACCTACAT |
| BvHAK4 | AACAATAAGGAGAAATCATGGAGGAC | AACACATACAAAGGGGATATACTCA |
| BvHAK5 | TTAGCTTATCAGAGTCTTGGAATAGT | AAACAGTGAGGCTCCAAAAGATCAA |
| BvHAK6 | TGTGGGTGAAAAAATGGTAGGAAAAG | ACTCACTTCACTTCCATCTACCCA |
| BvHAK7 | TGTGCCCTTTTTGAGTGAGTCTATG | GCTTAAATCTCCATACACTACTCCT |
| BvHAK8 | GTGTCGGTATCGTTTATGGGGATT | CCCATTATCATCTGCGCTCAATAC |
| BvHAK9 | GGATGATGGCGAGGAGAGAGAAAG | ACCTATCTTCAATTCCGAAACTTCA |
| BvHAK10 | CTAACATGGATCTGGAAAACAACAA | AAAACAAAGGACAAAACCCCATAAAT |
| BvACTIN | ACTGGTATTGTGCTTGACTC | ATGAGATAATCAGTGAGATC |
在甜菜基因组中共鉴定到10个BvHAK基因家族成员，并根据其所对应的染色体上的位置信息，依此对鉴定的基因命名为BvHAK1− BvHAK10 (表 2)。序列分析表明，BvHAK基因家族成员的CDS范围为2 004−2 541 bp，编码氨基酸的个数在668−847 aa不等，平均值为778.3 aa；分子量为81.76−95.16 kDa，平均值为88.31 kDa。亚细胞定位预测结果显示，BvHAK1、-4、-6、-7、-9和-10等6个成员定位于液泡膜(vacuole, Vac)，而BvHAK2、-3、-5和-8等4个成员定位于质膜(plasma membrane, PM) (表 2)。
| Gene name | Gene ID | Chr | Exon count | CDS (bp) | Protein length (aa) | pI | MW (kDa) | TM | Subcellular localization |
| BvHAK1 | Bv1_012350_gwcc | 1 | 9 | 2 418 | 806 | 7.30 | 89.87 | 14 | Vac |
| BvHAK2 | Bv2_038040_xuej | 2 | 10 | 2 199 | 733 | 8.96 | 81.76 | 12 | PM |
| BvHAK3 | Bv2_043210_nsir | 2 | 8 | 2 286 | 762 | 8.37 | 85.29 | 11 | PM |
| BvHAK4 | Bv2_030090_hets | 2 | 9 | 2 358 | 786 | 6.49 | 88.16 | 12 | Vac |
| BvHAK5 | Bv5_099680_qewf | 5 | 9 | 2 325 | 775 | 9.41 | 87.53 | 12 | PM |
| BvHAK6 | Bv6_149150_dnus | 6 | 9 | 2 523 | 841 | 7.19 | 93.59 | 13 | Vac |
| BvHAK7 | Bv6_149160_jraq | 6 | 8 | 2 334 | 778 | 7.59 | 87.46 | 13 | Vac |
| BvHAK8 | Bv6_146500_ndso | 6 | 9 | 2 349 | 783 | 8.76 | 87.38 | 12 | PM |
| BvHAK9 | Bv7_171890_ygwk | 7 | 10 | 2 541 | 847 | 5.38 | 95.16 | 12 | Vac |
| BvHAK10 | Bv_005060_xrpy | UN | 8 | 2 316 | 772 | 6.95 | 86.92 | 12 | Vac |
为进一步确定BvHAK基因间的结构差异，对BvHAK家族成员进行基因结构分析。如图 1A所示，10个BvHAK基因含有8−10个外显子和7−9个内含子。其中，BvHAK3、-5、-7和-10等4个成员各含有8个外显子和7个内含子；BvHAK1、-4、-6和-8等4个成员各含有9个外显子和8个内含子；BvHAK2和-9各含有10个外显子和9个内含子。另外，BvHAK基因家族成员外显子长度及内含子结构呈现出相对保守的特点(图 1A)。
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| 图 1 甜菜BvHAK家族基因结构(A) 和染色体定位(B) 分析 Fig. 1 Analysis of the gene structure (A) and chromosome location (B) of BvHAK gene family members. |
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甜菜BvHAK基因家族染色体定位分析结果表明，10个家族成员中有9个成员能够精准定位在9条甜菜基因组的1、2、5、6、7号染色体上(图 1B)。1、5和7号染色体上各有1个成员，分别是BvHAK1、-5和-9；2号染色体上有3个成员，分别是BvHAK2、-3和-4；6号染色体上也分布3个成员，分别为BvHAK6、-7和-8。然而，BvHAK10没有定位在染色体上。
2.3 HAK基因家族系统进化树构建和dN/dS分析为解析甜菜与其他物种之间HAK基因家族成员的进化关系，对甜菜10个、拟南芥13个、菠菜12个、白杨10个、大麦6个、水稻27个、玉米21个、小麦8个、大麦4个共计111个HAK基因家族成员氨基酸序列进行系统发育树构建。结果表明，HAK基因家族成员分为5簇，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅳ簇，其中Ⅱ簇成员可分为Ⅱa、Ⅱb和Ⅱc等3个亚簇(图 2)。甜菜BvHAK基因家族成员分布在前4簇中，分别为1个、6个、1个和2个成员，而第Ⅳ簇中没有BvHAK基因家族成员。其中，BvHAK3在第I簇；BvHAK5和BvHAK8在Ⅱa簇；BvHAK2在Ⅱb簇；BvHAK4、BvHAK7和BvHAK10在Ⅱc簇，BvHAK1在第Ⅲ簇；而BvHAK6和BvHAK9在第Ⅴ簇中。在同一簇中，甜菜BvHAK基因家族成员在进化树中与菠菜、拟南芥、白杨的亲缘关系距离更近，而与玉米、水稻、小麦、大麦等单子叶植物的进化关系较远(图 2)。
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| 图 2 植物HKT基因家族系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree of HKT family in plants. |
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在遗传学中，未导致氨基酸改变的核苷酸变异称为同义突变，反之则称为非同义突变。一般认为，同义突变不受自然选择，而非同义突变则受到自然选择作用。dN/dS表示异义替换(dN) 和同义替换(dS) 之间的比例。这个比例可以判断是否有选择压力作用于蛋白质编码基因。若dN/dS > 1，则认为有正选择效应。若dN/dS=1，则认为存在中性选择。若dN/dS < 1，则认为有纯化选择作用。如表 3所示，大多数BvHAKs (除BvHAK8和BvHAK10外) 与BvHAK3的dN/dS均大于1，表明BvHAK1、-2、-4、-5、-6、-7和-9与BvHAK3在进化上具有正选择作用。进一步采用PAML4.9软件对10个BvHAK基因家族的CDS序列进行选择压力分析。结果表明，BvHAK序列选择压力检测参数dN/dS小于1 (数据未显示)，可见BvHAKs基因所承受的选择压力总体趋势为纯化选择。
| Gene1 | Gene2 | dS | dN | dN/dS |
| BvHAK1 | BvHAK3 | 1.046 5 | 17.897 8 | 17.102 4 |
| BvHAK2 | BvHAK3 | 2.134 6 | 6.860 2 | 3.213 8 |
| BvHAK4 | BvHAK3 | 1.486 3 | 11.868 7 | 7.985 5 |
| BvHAK5 | BvHAK3 | 0.101 1 | 10.004 9 | 99.000 0 |
| BvHAK6 | BvHAK3 | 1.880 2 | 7.450 0 | 3.962 3 |
| BvHAK7 | BvHAK3 | 3.283 3 | 3.476 8 | 1.058 9 |
| BvHAK8 | BvHAK3 | 12.977 9 | 4.446 8 | 0.342 6 |
| BvHAK9 | BvHAK3 | 0.150 3 | 14.878 | 99.000 0 |
| BvHAK10 | BvHAK3 | 5.106 3 | 4.478 8 | 0.877 1 |
根据序列比对结果可以看出(图 3)，所有BvHAK的TM2和TM3之间有一个长的胞质环(loop)，此为高亲和性K+转运蛋白典型的结构特点。基于MEME分析设置10个基序，分析了甜菜BvHAK基因编码氨基酸序列，发现所有的BvHAK基因家族成员均含有motif1、motif2、motif3、motif4、motif5、motif6、motif7、motif8、motif9和motif10 (图 4)。另外，同一簇中，各个成员基序的位置基本上保持一致。由此可见，BvHAK基因家族具有高度保守的结构域。另外，BvHAK蛋白跨膜结构域的数量在11–14不等，等电点位于5.38−9.41之间，其中7个成员的pI大于7 (表 2)，表明绝大多数BvHAK属于碱性蛋白。
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| 图 3 甜菜BvHAK基因家族蛋白保守结构域氨基酸序列比对TM2和TM3分别代表第2和第3个跨膜区 Fig. 3 Amino acid sequence alignment of the protein conserved domains of BvHAK genes. TM2 and TM3 indicate the 2nd and 3rd transmembrane domain, respectively. |
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| 图 4 甜菜BvHAK基因家族蛋白保守基序分布及特征分析 Fig. 4 Distribution and characteristics of conserved motifs in BvHAK genes. |
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为了进一步研究BvHAK基因家族的蛋白质结构，采用SWISS-MODEL软件预测BvHAK蛋白3-D结构(图 5)，所有蛋白的3-D结构均由蛋白质数据(Protein Data Bank, PDB) 中获得的相似结构模板和晶体结构组成，所有预测的BvHAK蛋白的C得分在–1.92−1.13之间，表明预测模型的准确性较高。3-D结构进一步验证了对BvHAK基因家族蛋白质的保守基序预测的准确性。
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| 图 5 甜菜BvHAK家族的蛋白质三维结构 Fig. 5 Three-dimensional structure of BvHAK family proteins. |
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采用在线软件STRING对甜菜BvHAK基因家族成员蛋白互作网络进行预测(图 6)。结果表明，8个BvHAK (BvHAK2–BvHAK9) 均与AKT1 (XP_01681784.1) 存在互作关系。BvHAK1、-2、-6、-8和-9与TPK3 (XP_01666502.1) 存在互作。BvHAK1和BvHAK3还与CIPK23 (XP_010687109.1) 存在互作；与BvHAK4存在互作的蛋白有AHA1 (XP_010678592.1)、PME12 (XP_010687598.1)、PME22 (XP_010674080.1)、PME36 (XP_010692199.1)、AHA7 (XP_010692042.1)、BvHKT1; 1 (XP_010688439.1)、BvHKT1; 2 (XP_ 010690257.1) 和BvHKT1; 3 (XP_010690256.1) (图 6)。这些结果为深入研究BvHAK与其他蛋白质的互作及其协同调控网络提供依据。
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| 图 6 甜菜BvHAK家族蛋白互作网络预测 Fig. 6 Predication of protein-protein interaction network of BvHAK family. |
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为更全面地了解调控基因表达的诱导因素和基因功能，对甜菜BvHAK基因家族成员翻译起始位点上游1 500 bp启动子顺式作用元件进行了分析。结果表明，BvHAK基因家族成员含有与激素响应元件(如脱落酸、赤霉素、乙烯、生长素)，胁迫反应相关元件(如低温、高盐、干旱) 和生长与发育相关响应元件(如玉米醇溶蛋白代谢调节、分生组织和光响应) (表 4)。在激素相关响应元件中，只在BvHAK9中发现了1个GARE-motif；大多数BvHAK (除BvHAK2、-7和-9) 含有1−3个ERE；ABRE在BvHAK3、-4、-6、-9和-10基因的启动子中存在。在胁迫反应相关作用元件中，9个成员(除BvHAK4) 中含有1−3个ARE元件；MYB在9个成员(除BvHAK3) 的启动子中存在。另外，BvHAK1、-3、-5、-6、-9和-10启动子中含有STRE。在生长与发育相关响应元件中，光响应元件无论从类型或数量，在BvHAK基因上游调控区中都是最多的，如box4在8个BvHAK成员(除BvHAK4和BvHAK5) 启动子中均有发现。如表 4所示，BvHAK基因9个成员(除BvHAK2) 含有激素相关响应元件；而胁迫反应和生长与发育相关响应元件存在于所有成员中。特别值得一提的是，BvHAK1和-5含有所有胁迫反应相关响应元件。
| Functional class | Element name | Element function | BvHAK1 | BvHAK2 | BvHAK3 | BvHAK4 | BvHAK5 | BvHAK6 | BvHAK7 | BvHAK8 | BvHAK9 | BvHAK10 |
| Hormone | GARE-motif | Gibberellin-responsive | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 |
| ABRE | Abscisic acid responsiveness | 0 | 0 | 2 | 3 | 0 | 3 | 0 | 0 | 3 | 1 | |
| TCA-element | Salicylic acid responsiveness | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 0 | |
| TGA-element | Auxin-responsive element | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| ERE | Ethylene-responsive element | 1 | 0 | 1 | 2 | 1 | 2 | 0 | 1 | 0 | 3 | |
| Stress | LTR | Low-temperature responsiveness | 1 | 0 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| MYB | Drought related element | 5 | 1 | 0 | 2 | 1 | 3 | 2 | 2 | 3 | 1 | |
| MBS | Drought-inducibility | 1 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | |
| ARE | Anaerobic induction | 1 | 1 | 1 | 0 | 3 | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 | |
| STRE | Stress response element | 3 | 0 | 1 | 0 | 1 | 2 | 0 | 0 | 1 | 2 | |
| W-box | Salt-responsive element | 2 | 0 | 0 | 0 | 1 | 5 | 0 | 0 | 1 | 2 | |
| Development | AE-box | A module for light response | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| Box4 | Light responsiveness | 3 | 5 | 3 | 0 | 0 | 2 | 4 | 4 | 2 | 1 | |
| GCN4_motif | Endosperm expression | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | |
| CAT-box | Meristem expression | 0 | 0 | 0 | 2 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | |
| O2-site | Zein metabolism regulation | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 1 | |
| WRE3 | Wnt responsive DNA element | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 1 |
为了解甜菜BvHAK基因家族在不同浓度盐处理下表达量变化情况，采用qRT-PCR对其基因表达水平进行相对定量检测。结果显示，与对照(0 mmol/L NaCl) 相比，50和100 mmol/L NaCl显著增加了甜菜叶和根中BvHAK1、BvHAK2、BvHAK4、BvHAK7和BvHAK9表达量(图 7)。在50和100 mmol/L NaCl处理下，叶中的BvHAK2表达量比根中的表达量分别高87.1%和182.9%，BvHAK4在叶中的表达水平比根中的分别高147.5%和53.9%；然而，BvHAK9在叶中的表达量则显著低于根，分别低26.9%和27.7%。在50 mmol/L NaCl处理下，BvHAK7在根中的表达量高于叶；而在100 mmol/L处理下，BvHAK7在叶中的表达量显著高于根。与对照相比，高盐(150 mmol/L NaCl) 处理显著降低了叶和根中BvHAK1和BvHAK7的表达量。另外，高盐处理显著降低了BvHAK6、BvHAK8和BvHAK9在叶中的表达量，而对根中的表达量影响差异不显著。这些结果表明，50和100 mmol/L NaCl不同程度地诱导甜菜叶和根中BvHAK基因家族成员的表达；高盐则下调了BvHAK在叶中的表达水平，而对根中的表达量没有影响。
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| 图 7 甜菜BvHAK基因家族成员在不同浓度NaCl处理下的相对表达水平 Fig. 7 Relative expression levels of BvHAK gene family members under various concentrations of NaCl. (A) Relative expression levels of BvHAK1 in shoots and roots under different concentrations of NaCl. (B): Relative expression levels of BvHAK2 in shoots and roots under different concentrations of NaCl. (C): Relative expression levels of BvHAK3 in shoots and roots under different concentrations of NaCl. (D): Relative expression levels of BvHAK4 in shoots and roots under different concentrations of NaCl; (E): Relative expression levels of BvHAK5 in shoots and roots under different concentrations of NaCl. (F): Relative expression levels of BvHAK6 in shoots and roots under different concentrations of NaCl. (G): Relative expression levels of BvHAK7 in shoots and roots under different concentrations of NaCl. (H): Relative expression levels of BvHAK8 in shoots and roots under different concentrations of NaCl. (I): Relative expression levels of BvHAK9 in shoots and roots under different concentrations of NaCl. (J): Relative expression levels of BvHAK10 in shoots and roots under different concentrations of NaCl. Different letters mean significant difference (P < 0.05). A：不同浓度NaCl处理下BvHAK1在叶和根中的相对表达水平；B：不同浓度NaCl处理下BvHAK2在叶和根中的相对表达水平；C：不同浓度NaCl处理下BvHAK3在叶和根中的相对表达水平；D：不同浓度NaCl处理下BvHAK4在叶和根中的相对表达水平；E：不同浓度NaCl处理下BvHAK5在叶和根中的相对表达水平；F：不同浓度NaCl处理下BvHAK6在叶和根中的相对表达水平；G：不同浓度NaCl处理下BvHAK7在叶和根中的相对表达水平；H：不同浓度NaCl处理下BvHAK8在叶和根中的相对表达水平；I：不同浓度NaCl处理下BvHAK9在叶和根中的相对表达水平；J：不同浓度NaCl处理下BvHAK10在叶和根中的相对表达水平。不同字母表示差异显著(P < 0.05) |
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在本研究中，甜菜基因组数据库中共鉴定出10个BvHAK基因(表 2)，与其他物种的HAK基因家族成员数量不尽相同，如拟南芥中有13个[28]，玉米27个、马铃薯15个、水稻27个[45]，桃(Prunus persica) 15个，葡萄18个[46]、红皮柳(Salix purpurea) 22个[47]、茶树(Camellia sinensis) 21个[48]。可能是由于在进化过程中HAK家族不同亚科的特定基因复制和损失，造成了植物中HAK家族基因数量上的差异。
根据亚细胞定位预测，6个BvHAK基因家族成员定位在液泡膜(BvHAK1、-4、-6、-7、-9和-10)，而4个成员定位在质膜(BvHAK2、-3、-5和-8)。已有研究表明，绝大多数植物HAK基因家族成员定位于质膜上[49]。在水稻中，OsHAK10定位于液泡膜上，也有部分HAK家族成员如小立碗藓(Physcomitrella patens) PpHAK2定位于内膜，PpHAK3定位于高尔基体[50]。内含子与外显子的数目和结构也是基因家族进化中的一项重要指标。在本研究中，3个BvHAK基因家族成员(BvHAK3、-7和-10) 含有8个外显子，5个成员(BvHAK1、-4、-5、-6和-8) 含有9个外显子，其余BvHAK家族成员含有10个外显子(图 1A)。红皮柳SpuHAK13含有6个外显子，梨(Pyrus bretschneideri) PbrHAK11中有7个外显子，PbrHAK7中有6个外显子[51]。高等植物中的大部分KT/HAK/KUP基因包含8−10个外显子(少于绿藻中的外显子)[52]。对于HAK蛋白家族成员，K+转运蛋白结构域存在于所有物种中，具有高度的相似性。这些结果表明，高等植物HAK基因家族序列相对保守。
顺式作用元件参与基因活性调控，是转录调控的关键分子开关[53]。在植物中，生长素ABA、乙烯等激素在植物的生长发育与逆境胁迫响应过程中起着重要作用[54]。在BvHAK基因家族成员中，鉴定出39个顺式作用调控元件，其中激素响应元件7个，胁迫响应元件8个，生长发育元件24个(表 4)。在互作网络预测研究中，除BvHAK2与BvHAK9外，其余BvHAK蛋白均与向内整流通道AKT1互作[55]。另外，BvHAK家族成员与K+通道TPK3互作[56]。在本研究中，BvHAK3还与CIPK23相互作用(图 6)。在辣椒(Capsicum annuum) 和番茄中，HAK5及同源蛋白可被CBL1/CIPK23复合物激活[57-58]。在甘蔗(Saccharum officinarum) 中，SsHAK1可能被CBL1-CIPK23复合物或RUPO磷酸化和激活[59]。这些研究结果为进一步揭示HAK调控机制奠定基础。
3.2 甜菜BvHAK在盐处理下的表达模式分析在本研究中，盐处理显著诱导了BvHAK4在叶和根中的表达水平。研究表明，水稻OsHAK2介导Na+转运和低亲和性K+转运，大麦HvHAK2为低亲和性K+转运且对Na+敏感。棉花(Gossypium hirsutum) GhHKT2[60]、甘蔗SsHAK2、葡萄VvKUP2中也均发现有类似功能。拟南芥AtHAK5主要在根中表达，介导K+的吸收[51]。水稻OsHAK5则为Na+敏感型的高亲和性K+转运蛋白[12]。在水稻根和叶中均检测到OsHAK5表达，其通过增强根中K+的吸收和K+从根至地上部的转运，从而提高K+/Na+比，保持离子稳态，增强水稻的耐盐性[61]。芦苇(Phragmites australis) PhaHAK5具有Na+渗透性，也可提高植物的耐盐性[62]。在盐胁迫下，BvHAK3在根和叶中均有表达，但叶中的表达量显著高于根中。BvHAK3在低盐胁迫处理后，根中的表达量达到峰值；但在100 mmol/L NaCl处理后，叶中的表达量达到最高。另外，小立碗藓PpHAK13主要介导Na+转运[63]。系统发育分析表明，BvHAK6与拟南芥AtHAK12进化关系较近(图 2)，其功能可能与AtKHAK12功能相似，通过光合系统参与甜菜对盐胁迫的响应。玉米ZmHAK4在根的维管束中优先表达，编码一种新的质膜Na+选择性转运蛋白，该转运蛋白可能通过从木质部汁液中回收Na+，从而介导地上部Na+外排[64]。在水稻和小麦中，与玉米ZmHAK4的同源基因，具有相同的表达模式和离子转运特性，表明ZmHAK4及其同源基因具有相似的耐盐机制[35]。在本研究中，BvHAK4在50 mmol/L NaCl处理下地上部表达量最高(图 7D)，推测其与ZmHAK4具有相同的耐盐机理。另外，BvHAK5在50 mmol/L NaCl处理后叶表现出较高的表达水平(图 7E)，这与拟南芥中AtKUP7的表达模式一致。由此说明，BvHAK5对甜菜根系吸收K+至关重要，且可能参与K+向木质部汁液的转运[65]。
4 结论在本研究中，共鉴定10个甜菜BvHAK基因家族成员，其含有8−10个外显子、7−9个内含子不等；平均氨基酸个数为778.3，平均分子量为88.31 kDa，等电点为5.38−9.41，跨膜区为11−14个不等。系统进化分析发现，高等植物HAK可分为5个簇，分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ和Ⅳ簇，其中Ⅱ簇成员可进一步分为Ⅱa、Ⅱb和Ⅱc等3个亚簇；BvHAK家族成员则分布在前4簇，Ⅰ簇和Ⅲ簇有1个成员，Ⅱ簇有6个成员，Ⅴ簇有2个成员。进一步对BvHAK基因在盐处理下甜菜不同组织中的表达模式分析发现，50和100 mmol/L NaCl不同程度地诱导甜菜叶和根中BvHAK基因家族成员的表达；高盐(150 mmol/L) 则下调其在叶中的表达水平，而对根中的表达量没有影响。
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