生物工程学报  2022, Vol. 38 Issue (10): 3859-3877 |
表1(Table 1)
表2(Table 2)
表3(Table 3)
表4(Table 4) 表5(Table 5)
表6(Table 6)
引用本文
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葡萄(Vitis vinifera L.) 为多年生木质藤本植物，由于其甜美的口感和沁人的风味，深受人们的喜爱，目前已在我国南方广泛种植[1]。由于我国南方葡萄生长期间多为阴雨天气，设施栽培条件下的葡萄大多处于光照不足的环境中，一定程度上影响了葡萄的产量和品质[2]。
目前关于弱光胁迫对植物影响的研究，已在水稻[3]、辣椒[4]和花生[5]等草本植物中有所报道，主要研究其在低温弱光胁迫环境下的光合特性和各种生理生化指标的变化。在葡萄弱光胁迫研究中，研究主要集中在弱光胁迫对细胞质膜透性、葡萄各种营养器官、各类保护酶活性和叶片光合作用的影响[6-7]。近年来，对植物逆境生理响应的研究从以往的研究植物生理适应现象的表观层面发展到以微观角度研究植物生理适应的内在机制，而转录组学研究是当前生物科学领域研究的热点，但弱光胁迫下葡萄的转录组学研究却鲜有报道。
‘鄞红’葡萄为浙江万里学院等单位联合选育的优质品种，目前已在浙江省广泛种植[8]。本文研究弱光胁迫对‘鄞红’葡萄幼苗光合特性以及其他生理生化指标的影响，并结合弱光胁迫响应下的转录组学研究，筛选出与弱光胁迫下相关的抗逆基因，为全面理解葡萄耐弱光机制，进而为葡萄的光照管理以及栽培模式选择提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂2021年5月5日，选取100株生长健壮、长势一致的1年生‘鄞红’葡萄幼苗，栽于试验瓦盆中(上口径29.5 cm，下口径27.2 cm，高17.0 cm)，并采用人工基质培养(泥炭︰砻糠=3︰1，体积比)。每盆基质为1 450 g，含有机质49.3 mg/kg，碱解氮41.1 mg/kg，速效磷8.2 mg/kg，速效钾85.2 mg/kg，pH值为5.6，定植前基质中一次性施入缓释肥(N︰P︰K为17︰17︰7) 1.5 kg/m3。于2021年5月15日开始，将幼苗置于连栋大棚内，以遮阳网为覆盖材料，共设置5个处理组：对照组(CK)、处理组T1 (一层膜遮荫，遮光率为25%)、处理组T2 (二层膜遮荫，遮光率为45%)、处理组T3 (三层膜遮荫，遮光率为65%) 和处理组T4 (四层膜遮荫，遮光率为80%)。每个处理组共处理葡萄幼苗20株，试验期间基质相对湿度保持65%左右，试验期间不再另外施肥。各个处理组每隔15 d采样一次，各随机选取3株、每株随机选择功能叶片2张，用以测定葡萄叶片的一系列生理生化指标。光胁迫45 d时，每个处理随机选取3株、每株任选功能叶片2张，用于叶片组织显微结构的观测。此外选取胁迫45 d时的CK、T2和T4组叶片送至华大基因进行转录组学分析。
本试验所用的Plant Total RNA Isolation Kit试剂盒购自南京诺唯赞公司；Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix和SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒均购自上海近岸蛋白质有限公司；试验所用引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。
1.2 仪器与设备SPAD-502PULS叶绿素仪，KONICA MINOLTA公司；LA-S全能型植物图像分析，万深有限公司；OLYMPUS光学显微镜，奥林巴斯公司；EM UC7型超薄切片机，徕卡公司；HITACHI-7650型透射电镜，日立公司；NanoDrop2000微量核酸分析仪，赛默飞公司；DYCP-31BN型琼脂糖水平电泳仪，北京六一生物科技有限公司；Bio-Rad CFX96实时荧光PCR，Bio-Rad公司。
1.3 方法 1.3.1 根系和叶片生长指标的测定采用LA-S全能型植物图像分析仪测定葡萄的叶片面积、根系长、根直径、根表面积和根体积。
1.3.2 叶片叶绿素含量、可溶性蛋白和游离脯氨酸的测定采用SPAD-502PULS叶绿素仪测定叶片叶绿素含量。可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250染色法进行测定。脯氨酸含量的测定采用茚三酮显色法进行测定。
1.3.3 叶片保护酶活性和丙二醛含量的测定过氧化物酶活性(peroxidase, POD) 采用愈创木酚比色法进行测定；过氧化氢酶活性(catalase, CAT) 采用紫外吸收法进行测定；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD) 的测定采用氮蓝四唑(nitro-blue tetrazolium, NBT) 法进行；丙二醛(malondialdehyde, MDA) 采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA) 法进行测定。
1.3.4 叶片组织细胞观测从葡萄叶片中部主脉两侧取材(4 mm× 6 mm) 制作石蜡切片，用甲醛-乙酸-乙醇(formaldehyde-acetic acid-ethanol fixative, FAA) (福尔马林5 mL，冰醋酸5 mL，50%乙醇90 mL) 固定，乙醇和二甲苯脱水后，石蜡包埋，横切片厚度10 μm，用番红-固绿进行染色。在OLYMPUS光学显微镜下用测微尺测量叶表皮、栅栏组织和海绵组织厚度，各处理组选取15个典型视野照相[9]。
1.3.5 叶绿体超微结构的观测从葡萄叶片中部主脉两侧选取材料(2 mm× 4 mm)，依次利用2.5%戊二醛进行前固定，0.1 mol/L的磷酸缓冲液(pH 7.2) 冲洗，1%的锇酸进行固定，之后依次用50%、60%、70%、80%、90%和100%乙醇梯度脱水，纯丙酮置换浸透，经环氧树脂包埋，聚合后，使用EM UC7型超薄切片机中获得70−90 nm的切片，最后使用醋酸双氧铀和柠檬酸铅双染色，在HITACHI-7650型透射电镜下观察观测葡萄叶片栅栏组织细胞叶绿体超微结构，选取典型视野照相。
1.3.6 RNA-seq分析各处理组样品经液氮研磨后，使用Plant Total RNA Isolation Kit试剂盒进行总RNA的提取。RNA完整性、含量和纯度由NanoDrop2000微量核酸分析仪和DYCP-31BN型琼脂糖水平电泳仪进行检测，从而完成整个文库的制备工作。将构建好的文库进行质控检测，文库质控合格后使用Ion Proton进行测序。测序产生的原始图像数据经碱基识别(base calling) 转化后得到原始数据(raw reads)。测序完成之后，通过DEGseq软件对数据进行差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs) 分析。采用Gene Ontology数据库(http://www.geneontology.org/) 和京都基因及基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome, KEGG) 数据库对DEGs集进行GO和KEGG富集分析。
1.3.7 实时荧光PCR的测定根据测序结果得到的重要差异基因的全长序列，使用Primer Premier 5软件设计荧光定量PCR引物(表 1)。Bio-Rad CFX96实时荧光PCR和SYBR qPCR SuperMix Plus试剂盒用于基因表达量的测定，并采用2−ΔΔCt法计算目的基因的相对表达水平。
| Primer names | Primer sequences (5′→3′) | Size (bp) |
| GSVIVT01038746001-q-F | GGTTAGGGAGGAGTTTTGGCT | 21 |
| GSVIVT01038746001-q-R | CGAGCCAACATGGAAGACCT | 20 |
| GSVIVT01007123001-q-F | GAGGGGTGGATTTTTGGGAT | 20 |
| GSVIVT01007123001-q-R | AAGCATTTTCCCAGCATCTCG | 21 |
| GSVIVT01021381001-q-F | TGCTGAATGGCTCCTTACCG | 20 |
| GSVIVT01021381001-q-R | AGCAGTGTGTGACCTGAACC | 20 |
| GSVIVT01014587001-q-F | CTGCTTGGTGCATTCCCTCT | 20 |
| GSVIVT01014587001-q-R | TCCTGATCTCGTCCGGGTTA | 20 |
| Actin-F | CAAGAGAAACCATCCCTAGCTG | 22 |
| Actin-R | TCAATCTGTCTAGGAAAGGAAG | 22 |
各实验均进行3次生物学重复，并使用SPSS statistics 25软件对数据进行显著差异分析，使用GraphPad Prism 8绘制柱状图。
2 结果与分析 2.1 弱光胁迫对‘鄞红’葡萄植株及叶绿素含量的影响根据试验设计，我们对弱光胁迫后‘鄞红’葡萄植株的一系列生长指标进行测定(图 1A和表 2)。对照组CK和处理组T1植株根系和叶片的生长状况良好；处理组T2植株根系和叶片的生长状况一般，叶片表面出现少量黄斑但仍能正常生长，除叶面积增大外，其余各指标与对照相比均无显著差异。随着弱光胁迫程度加强，其对‘鄞红’葡萄的伤害逐渐增大，处理组T3叶片变薄且出现较多黄斑，少量叶片开始脱落，除叶面积与对照组相比，差异不显著，其余各指标均显著低于对照组；处理组T4植株叶片出现大量脱落，生长受阻，各指标均显著低于对照组。此外，我们对各个处理组的叶片相对叶绿素含量进行测定。结果显示，处理组T1和T2植株的叶绿素相对含量变化趋势与对照组相似，均先上升后维持在稳定状态。试验结束时，叶绿素含量与对照相比分别上升8.7%和9.7%，与对照相比，差异均不显著；处理组T3和T4叶绿素含量随着处理时间延长而下降，试验结束时，与对照相比分别下降28.5%和40.6%，与对照相比，差异均显著(图 1B)。
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| 图 1 弱光胁迫下葡萄植株的生长状态及叶片叶绿素含量 Fig. 1 Growth phenotype and chlorophyll content of the grape under weak light. |
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| Treatments | Root system | Leaves | |||||
| Length (cm) | Average diameter (mm) |
Surface area (cm2) | Volume (cm3) |
Leaf area (cm2) | Morphological characteristics | ||
| CK | 1 860.4±4.3a | 1.01±0.03a | 621.2±4.4a | 14.2±0.5a | 490.2±3.2b | Normal, deep green | |
| T1 | 1 843.2±4.3a | 0.99±0.02a | 632.3±5.2a | 14.3±0.5a | 485.0±3.6b | Normal, deep green | |
| T2 | 1 803.6±4.4ab | 0.93±0.05ab | 557.3±4.8ab | 12.5±0.6ab | 565.6±3.3a | General, a small amount of yellow spot, thin | |
| T3 | 1 462.1±3.6b | 0.76±0.05b | 428.2±3.7b | 8.4±0.4b | 523.8±2.9ab | A small amount of drop, more yellow spots, thin | |
| T4 | 953.2±3.7c | 0.61±0.04c | 315.2±3.1c | 6.4±0.4c | 365.2±3.2c | A large amount of drops and yellow spots, thin | |
| Different lowercase letters mean significant difference (P < 0.05). | |||||||
为了探究弱光胁迫对‘鄞红’葡萄渗透调节物质的影响，我们对葡萄叶片中的可溶性蛋白和游离脯氨酸含量进行了测定。观察不同处理组叶片可溶性蛋白变化趋势发现(图 2A)，处理组T1和处理组T2可溶性蛋白质含量先升高后维持在稳定状态，试验结束时，处理组T1可溶性蛋白质含量与对照相比升高3.4%，处理组T2可溶性蛋白质含量与对照相比下降6.2%，均与对照相比无明显差异；处理组T3和处理组T4可溶性蛋白质含量随着胁迫时间延长而下降，试验结束时，与对照组相比分别下降24.7%和35.3%，显著低于对照。游离脯氨酸变化趋势如图 2B所示，处理组T1和处理组T2游离脯氨酸含量的变化趋势与对照相似，试验结束时，游离脯氨酸含量与对照相比上升12.2%和11.7%，均与对照差异不显著；处理组T3和处理组T4游离脯氨酸含量随着胁迫时间延长而显著升高，试验结束时与对照相比上升了137.1%和157.3%，均显著高于对照。
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| 图 2 弱光胁迫对葡萄叶片可溶性蛋白和游离脯氨酸的影响 Fig. 2 Effect of weak light stress on the soluble protein content and free proline content of grape leaves. |
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为了探究不同时期弱光胁迫对葡萄叶片的保护酶活性和丙二醛含量的影响，我们对其进行了测定(图 3)，结果显示，处理组T1和T2植株叶片的SOD、POD和CAT活性均呈先升高后维持在稳定状态，试验结束时，与对照相比，分别下降了2.7%、2.2%、1.3%和11.0%、9.2%、11.0%，与对照相比，无明显差异；处理组T3和T4植株叶片的SOD、POD和CAT活性均呈先升高后下降的趋势，在胁迫15 d时达到最大值，随后急剧下降，试验结束时，与对照相比，T3和T4分别下降26.5%、27.0%、26.6%和45.2%、37.8%、49.4%，均显著低于对照。此外我们对氧化损伤指标丙二醛含量进行了测定，结果显示，处理组T1和T2丙二醛含量与对照相比分别上升了3.2%和2.7%，而处理组T3和T4的丙二醛含量随着处理时间的增加而显著升高，试验结束时，与对照相比，分别上升了70.8%和101.4%。以上结果表明，弱光胁迫对葡萄叶片的保护酶活性存在抑制作用，同时随着胁迫强度的增加，葡萄叶片的氧化损伤程度也逐渐增强。
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| 图 3 弱光胁迫对葡萄叶片保护酶活性和丙二醛含量的影响 Fig. 3 Effect of weak light stress on the protective enzyme activities and MDA content of grape leaves. |
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在正常条件下，栅栏组织细胞呈长柱状且排列整齐，海绵组织细胞则排列紧凑，且细胞内富含叶绿体[10]。处理组T1和T2植株叶片组织显微结构与对照相比，无显著差异。随着胁迫持续增大，处理组T3和T4植株叶片的栅栏组织细胞的沉积物大量积累，形状变得不规则，海绵组织和栅栏组织细胞数目都减少，细胞间隙也变大，叶绿体在细胞内分布不规则且数目明显变少(图 4)。此外我们对处理45 d后的不同处理组叶片解剖结构定量测定发现，处理组T1和T2的叶片表皮层、栅栏组织、海绵组织厚度与对照相比，无显著差异，而处理组T3和T4植株叶片表皮层、栅栏组织、海绵组织厚度显著减少(表 3)。
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| 图 4 弱光胁迫下葡萄叶片横切面图 Fig. 4 The cross-section of grape leaves under weak light. EP: epidermal cell; PT: palisade tissue; ST: spongy tissue. |
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| Treatments | Leaf skin thickness (µm) | Palisade tissue thickness (µm) | Spongy tissue thickness (µm) |
| CK | 15.5±1.0a | 33.2±1.3a | 45.2±2.2a |
| T1 | 15.6±0.8a | 33.7±1.2a | 44.0±1.6a |
| T2 | 14.9±0.9ab | 32.5±1.5ab | 40.6±2.5ab |
| T3 | 14.1±1.1b | 28.6±1.2b | 30.8±1.8b |
| T4 | 12.2±1.3c | 24.2±1.2c | 24.7±2.3c |
| Different lowercase letters mean significant difference (P < 0.05). | |||
正常情况下，葡萄叶片栅栏组织细胞液泡膜完整，叶绿体呈扁平状，被液泡挤在细胞边缘，叶绿体基质片层和基粒片层与叶绿体长轴近似平行排列，基质浓厚，基粒片层多，类囊体排列紧密且整齐，内含淀粉粒与嗜锇颗粒相对小且少[10]。处理组T1与对照组CK情况相似，叶绿体及其内含淀粉粒和嗜锇颗粒均表现正常；处理组T2出现异常现象，叶绿体开始肿胀、内含淀粉粒和嗜锇颗粒增多且变大，但与对照组相比，差异不显著；随着弱光强度持续增大，处理组T3和T4叶绿体明显肿胀变大，片层结构松散、基质稀薄、内含淀粉粒和嗜锇颗粒显著增多且变大(图 5)。
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| 图 5 弱光胁迫对葡萄叶片栅栏组织细胞叶绿素超微结构的影响 Fig. 5 Effects of weak light on ultrastructure in palisade tissue chloroplast of grape leaves. Chl is chloroplast; V is vacuole; S is starch grain; P is plastoglobules. |
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为了探究弱光胁迫下葡萄叶片的基因表达模式，我们对处理组T2 (二层膜遮荫，遮光率为45%)、T4 (四层膜遮荫，遮光率为65%) 和对照组CK (不做处理) 叶片进行RNA-seq分析(图 6)，我们发现T2组相比于对照组上调基因为5 954个，下调基因为7 959个；T4与对照组相比，上调基因为5 516个，下调基因为7 777个。而T4与T2之间的差异表达基因数目最多，其中上调基因为6 818个，下调基因为8 125个。弱光胁迫后，下调基因明显多于上调基因，表明弱光胁迫显著改变了葡萄叶片中的基因表达谱，对大部分基因的表达起到抑制作用。韦恩图显示CK-VS-T2和CK-VS-T4的共差异基因51个，CK-VS-T2和T2-VS-T4的共差异基因505个，CK-VS-T4和T2-VS-T4的共差异基因103个。此外CK-VS-T2、CK-VS-T4和T2-VS- T4间的共差异基因则有12 370个。
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| 图 6 CK、T2和T4组间的差异表达基因对比图 Fig. 6 Differentially expressed genes among CK, T2 and T4 treatments. |
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为了探究差异表达基因的GO功能富集，我们分别将CK与T2和T4中的差异表达基因进行基因和蛋白功能分类注释(图 7)。功能分类注释分为以下3类：生物过程分析、分子功能分析和细胞组分分析。结果显示CK和T2、CK和T4、T2和T4的差异表达基因，在参与生物过程中，差异基因均主要集中在新陈代谢过程和刺激响应过程；在分子功能上，差异基因主要集中在催化活性上；而在细胞组分中，差异基因主要集中在细胞器和各类膜组织中。
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| 图 7 差异表达基因GO富集分析 Fig. 7 GO function enrichment analysis of DEGs. |
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为了进一步了解各个处理组间DEGs所在的代谢通路和功能，我们将差异基因进行KEGG代谢通路富集分析(表 4)。结果显示病原菌互作为CK和T4、T2和T4组间的共同差异代谢途径。而在CK和T4、T2和T4组间的差异表达基因在光合作用天线蛋白、卟啉和叶绿素代谢、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸代谢和光合生物固碳作用过程中显著富集，这表明弱光胁迫能够改变叶片对光能的吸收和CO2的利用，进而影响葡萄叶片的氨基酸代谢，同时影响病原菌与植物细胞膜上的识别位点结合。
| Pair-comparison | KEGG pathway | Gene_No. | Contained | Q-value |
| CK-VS-T2 | Plant-pathogen interaction | 588 | Up & down | 1.29×10−10 |
| CK-VS-T4 | Plant-pathogen interaction | 691 | Up & down | 4.82×10−6 |
| Photosynthesis-antenna proteins | 18 | Down | 3.42×10−4 | |
| Photosynthesis | 60 | Up & down | 2.22×10−3 | |
| Porphyrin and chlorophyll metabolism | 52 | Up & down | 2.21×10−3 | |
| Glycine, serine and threonine metabolism | 62 | Up & down | 1.29×10−2 | |
| Isoflavonoid biosynthesis | 36 | Up & down | 2.92×10−2 | |
| Carbon fixation in photosynthetic organisms | 53 | Up & down | 2.92×10−2 | |
| T2-VS-T4 | Plant-pathogen interaction | 558 | Up & down | 3.53×10−5 |
| Photosynthesis-antenna proteins | 17 | Down | 1.02×10−4 | |
| Porphyrin and chlorophyll metabolism | 45 | Up & down | 1.96×10−3 | |
| Glyoxylate and dicarboxylate metabolism | 50 | Up & down | 2.58×10−3 | |
| Carbon fixation in photosynthetic organisms | 48 | Up & down | 2.58×10−3 | |
| Photosynthesis | 49 | Up & down | 5.91×10−3 | |
| Glycine, serine and threonine metabolism | 51 | Up & down | 1.99×10−2 | |
| Glutathione metabolism | 68 | Up & down | 4.71×10−2 |
通过对CK、T2和T4中的差异表达基因进行比对，初步筛选出4个可能与‘鄞红’葡萄叶片弱光胁迫相关的差异表达基因(表 5)。其中GSVIVT01038746001基因编码MYC2转录因子(Myc2 bHLH protein)、GSVIVT01007123001编码多酚氧化酶(polyphenol oxidase)、GSVIVT01021381001编码光敏色素E (phytochrome E)、GSVIVT01014587001编码h型硫氧还蛋白(thioredoxin h-type)，以上基因均与植物光合作用和逆境胁迫有关。GSVIVT01021381001和GSVIVT01014587001基因在无遮荫条件下表达量最大，二层遮荫次之，四层遮荫最小，说明随着弱光胁迫程度的加强，其表达量持续下降。而GSVIVT01007123001随着弱光胁迫的加强，该基因的表达量逐渐上升。GSVIVT01038746001随着弱光胁迫程度的加强，该基因的表达量呈先升高后小幅度下降的趋势。
| Gene ID | log2 ratio (T2/CK) | log2 ratio (T4/CK) | log2 ratio (T4/T2) | Annotation |
| GSVIVT01038746001 | 1.291 5 | 1.207 6 | –0.083 9 | Myc2 bHLH protein |
| GSVIVT01007123001 | 1.238 9 | 2.389 7 | 1.150 9 | Polyphenol oxidase |
| GSVIVT01021381001 | –1.592 6 | –7.925 1 | –6.332 5 | Phytochrome E |
| GSVIVT01014587001 | –0.346 2 | –3.831 6 | –3.485 4 | Thioredoxin h-type |
为了验证转录组数据的准确性，我们对4个筛选出来的重要差异基因进行实时荧光定量PCR检测(图 8)，结果显示RNA-seq和RT- qPCR数据的变化趋势基本一致，说明转录组数据准确可靠。
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| 图 8 重要差异基因的RT-qPCR验证 Fig. 8 RT-qPCR validation of differentially expressed genes. |
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弱光胁迫在植物整个生长发育过程中会产生许多不利影响。而葡萄在弱光胁迫条件下，根系生长往往会受到抑制[7, 11]。唐韡等[12]对番茄的研究发现，弱光胁迫下，番茄根系活力下降。葡萄的耐弱光胁迫能力和在不同的品种之间存在一定的差异，在本研究中，‘鄞红’葡萄在一层和二层遮荫下，其根系生长基本正常，表明该品种对弱光胁迫具有一定的抗性。弱光胁迫也会影响植物叶片的生长，刘慧民等[13]的研究发
现，弱光胁迫下，叶面积变大，而李静[14]研究发现，弱光胁迫下，叶面积变小。在本研究中，随着遮荫程度的增加，叶面积先增大后减小，在二层遮荫下叶面积最大，叶面积增大可能是因为植物通过增加叶片面积来捕获更多的太阳光线，从而增强叶片的光合速率，生产更多有机物，以满足其生长发育的需要；而随着遮荫程度的增加，植物的同化作用下降，从而使叶发育速度减缓导致叶面积减小。
3.2 弱光胁迫对保护酶活性和MDA的影响光是植物生长发育不可缺少的环境因子，然而植物在生长过程中经常暴露在不足的光照条件下，这对植物的生理、代谢和发育造成了一系列严重影响[15-16]。在弱光胁迫下植物细胞内部会产生大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)，而SOD、POD和CAT是细胞内清除活性氧的主要保护酶，这些保护酶与植物的抗逆性大小有着密切的关系[17]。当植物受到
逆境胁迫时，其体内超氧阴离子水平提高，这时SOD活性增加，从而对植物进行保护。POD是植物在逆境下抗氧化酶保护系统中的关键酶，参与多种生理代谢过程，具有控制细胞的生长发育以及清除H2O2等作用。CAT可以促使H2O2分解成分子氧和水，以清除体内的过氧化氢，使细胞避免遭受H2O2的毒害[10]。刘永华等[18]的研究发现，弱光胁迫下瓠瓜抗氧化酶活性、质膜透性显著升高。在本研究中，SOD、POD和CAT活性均呈先升后降的趋势，低强度弱光胁迫下(一层、二层遮荫)，活性与对照差异不显著；高强度弱光胁迫下(三层、四层遮荫)，活性显著下降。表明适当的弱光胁迫可以激发植物体内自身的抗逆体系，诱导保护酶活性升高；而随着弱光胁迫的持续和程度的加强，超过了植物抗逆体系的承受范围，导致保护酶活性下降。MDA是膜脂过氧化作用的主要产物之一，其含量可以作为判定逆境胁迫下脂质受害程度的指标[19]。在本研究中，MDA含量随着弱光程度的增加，胁迫时间的延长，MDA含量逐渐增加，表明随着弱光胁迫的持续和程度的加强，‘鄞红’葡萄的受害程度不断增加。
3.3 弱光胁迫对‘鄞红’葡萄渗透调节物质的影响叶片受到弱光胁迫后其蛋白质、脯氨酸等渗透调节物质的代谢均会发生变化。可溶性蛋白质参与调节植物细胞的渗透势，在逆境胁迫下，植物体内正常的蛋白质合成会受到抑制，但也可能会产生逆境适应蛋白[20-21]。在本研究中，低强度弱光胁迫下(一层、二层遮荫)，可溶性蛋白含量升高；高强度弱光胁迫下(三层、四层遮荫)，可溶性蛋白含量显著下降，表明‘鄞红’葡萄对弱光胁迫具有一定的适应性。脯氨酸是一种重要的渗透调节物质，它在植物细胞内累积，会降低胞内水势，从而避免细胞过度脱水，不仅可以缓解胁迫对植物的伤害，还能起到调节细胞内微环境和保障细胞内的各种代谢反应顺利进行的作用[20, 22]。在本研究中，低强度弱光胁迫下(一层、二层遮荫)，脯氨酸含量与对照差异不显著；高强度弱光胁迫下(三层、四层遮荫)，脯氨酸含量随着弱光程度的递增而逐级递增。表明随着胁迫程度的递增，‘鄞红’葡萄的受害程度不断增加，这与前人对于茄子[23]的研究一致。
3.4 弱光胁迫对组织显微结构和叶绿体超微结构的影响弱光胁迫下葡萄叶片生理生化过程的改变会影响其细胞组织结构、叶绿素的合成和光合作用能力[24]。叶绿体是植物进行光合作用的场所，完整的叶绿体结构是植物能够正常光合作用的前提，因此叶绿体是植物在弱光条件下最敏感的细胞器，其结构的变化能体现出植物对弱光胁迫的一种适应性。在本研究中，低强度弱光(一层、二层遮荫) 胁迫下，叶片组织显微、栅栏组织中叶绿体超微结构正常，表明‘鄞红’葡萄具有一定的耐弱光性，而高强度弱光胁迫下(三层、四层遮荫)，叶片组织显微、叶绿体超微结构发生显著变化，且随着胁迫程度增加，胁迫越显著，可能是由于受到弱光胁迫后，叶片细胞的超微结构、内含物和其他细胞器受到伤害。而淀粉粒的变化可能是由于叶绿体结构受到破坏，光合作用合成的糖类物质无法正常输出或输出量降低导致其迅速转化为淀粉，并在叶绿体中大量累积形成淀粉粒；而嗜锇颗粒的变化则可能是由于叶绿体类囊体膜降解从而导致脂类物质在液泡或叶绿体内大量聚集所引起的。
3.5 生物信息学注释GO功能注解包括分子功能、参与的生物过程以及细胞组件，而与抗逆性相关的功能注释信息主要有信号转导机制、能量产生与转导等。Pathway聚集分析显示，差异基因参与了包括植物与病原菌互作途径、光合作用、卟啉和叶绿素代谢等代谢途径。差异表达基因检测结果表明，遮荫诱导后相当数量的基因在弱光遮荫处理后上调或下调，且随着遮荫程度的增强，差异表达基因的数量逐渐增多。对差异表达基因的分析发现，大部分基因是未知基因，因此‘鄞红’葡萄品种中可能存在着很多与弱光胁迫应答相关的特有基因，需要后续进一步挖掘。
3.6 抗逆性相关基因分析 3.6.1 转录因子MYC2在筛选出的重要差异基因中，MYC2转录因子属于植物bHLH转录因子家族中一员，它在植物茉莉酸(jasmonic acid, JA) 信号途径中处于核心位置，在含有较低浓度JA的植物细胞中，JA早期应答基因的表达因JAZ蛋白与转录激活因子MYC2结合而受到抑制。当植物受到外界环境胁迫时，JA在植物细胞中合成并大量积累，这促使了JAZ蛋白与SCFCOII受体复合物结合并使JAZ蛋白泛素化，进而被26S蛋白酶体选择性降解[25]，从而解除JAZ蛋白对MYC2转录活性的抑制，激活JA早期应答基因的表达，最终调节植物以适应逆境环境(图 9)[25-28]。有研究发现，当拟南芥经JA处理6 h后，再用能产生超自由基的百草枯农药处理，发现大量表达MYC2的拟南芥的死亡率仅为5%，远远低于对照组的90%，说明MYC2转录因子在植物抗氧化能力中发挥重要作用[29]。在本研究中，随着弱光胁迫程度的加强，MYC2基因的表达量先升高后小幅度下降，这与氧化酶(CAT, SOD, POD) 的研究结果一致，可能是由于低强度弱光胁迫下，植物通过大量表达MYC2转录因子正调控JA达到清理体内多余ROS的目的，而随着胁迫程度的加强，植物超过了抗逆体系的承受范围，导致植物细胞受损，调控失衡而造成MYC2表达量轻微下降。
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| 图 9 植物茉莉酸信号通路 Fig. 9 The jasmonic acid signaling pathway in plants. |
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MYC2转录因子在JA为核心的调控网络中扮演开关的角色，并与其他激素间存在共调控作用。脱落酸(abscisic acid, ABA) 是改善植物非生物胁迫耐受力的重要组分。已有相关研究表明MYC2能够参与JA-ABA间的互作，ABA代谢途径中PYL家族能与ABA特异性结合进而影响ABA信号应答反应[30]，其中PYL6能与MYC2特异性结合，并且加入ABA后结合能力加强。而当ABA存在时，PYL6与MYC2紧密结合并提高其转录活性，JAZ表达增强，JA应答反应得到抑制[31]。本实验发现在弱光胁迫下，PYL相关基因GSVIVT01032747001和GSVIVT01030286001在T2和T4弱光胁迫下相比于对照组表达量显著提高，推测弱光胁迫促进了PYL相关基因的表达，增强了PYL与MYC2的结合能力。当植物受到外界环境胁迫时，ABA在植物细胞中合成并大量积累，导致PYL6与MYC2紧密结合并提高其转录活性，JAZ表达增强，导致JA应答反应受到抑制，这与在T4高强度弱光胁迫下JA早期应答基因表达量出现下降的情况相吻合。
赤霉素(gibberellin, GA) 在植物中分布广泛并参与许多植物发育过程的调控，同时在抵御众多非生物胁迫过程中发挥重要作用。DELLA蛋白属于GRAS蛋白家族，在GA信号转导通路中起负调控作用。Hou等[32]发现在低GA水平下，DELLA蛋白和JAZ互作并干扰JAZ对MYC2的抑制效应。而当GA水平达到临界值时，DELLA蛋白泛素化并释放抑制状态下的JAZ，抑制依赖MYC2的JA响应；而为了平衡该抑制效应，DELLA蛋白会增强MYC2和启动子的结合力。在T4高强度弱光胁迫下，DELLA基因的表达量相比于对照组和T2组出现明显增长，表明高强度弱光胁迫下刺激DELLA基因的表达，从而增强MYC2和启动子的结合力，从而解除抑制效应，调节JA代谢相关基因的表达以应对环境胁迫。
乙烯(ethylene, ET) 作为植物五大激素之一，能够与JA间通过拮抗作用调控创伤响应基因和次生生物合成基因的表达，而MYC2在该过程中发挥重要作用。在MYC2突变体中HSL1表达量上调，同时如ETHYLENE RESPONSE FACTOR 1 (ERF1) 等防御基因表达量也相继上调[33]。在本实验中我们发现ERF1基因在弱光胁迫下出现明显上升，因此我们推测弱光胁迫增强了MYC2的表达，从而促进ERF1等防御基因的表达，以帮助植株应对环境胁迫与修复组织创伤。
3.6.2 多酚氧化酶PPO和硫氧还原蛋白Trx多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO) 是一种末端氧化酶，在其作用下，植物体内某些有害的代谢副产物会转变为无害物质。目前对于PPO的研究还不透彻，有学者认为PPO可能参与了叶绿体内的能量转移，而且与氧结合以调节叶绿体中有害的光氧化反应速度[34]。在本研究中，随着弱光胁迫程度的加强，多酚氧化酶活性逐渐升高，可能由于弱光胁迫激发多酚氧化酶活性以应对逐渐增强的逆境胁迫。
| Gene ID | log2 ratio (T2/CK) | log2 ratio (T4/CK) | Annotation |
| GSVIVT01032747001 | 3.135 9 | 2.697 6 | PYL (ABA) |
| GSVIVT01030286001 | 2.000 5 | 2.366 5 | PYL (ABA) |
| GSVIVT01024933001 | 3.329 4 | 4.311 4 | DELLA (GA) |
| GSVIVT01014570001 | 3.039 8 | 3.917 1 | DELLA (GA) |
| GSVIVT01010007001 | 2.015 9 | 2.258 4 | DELLA (GA) |
| GSVIVT01016520001 | 1.590 7 | 1.967 7 | DELLA (GA) |
| GSVIVT01018270001 | 3.501 9 | 4.873 9 | ERF (ET) |
硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx) 是一种在植物体内广泛存在的多功能酸性蛋白，植物中的硫氧还蛋白系统作为ROS系统的重要组分，不仅本身具有抗逆境胁迫的能力，同时能够调控抗逆基因的表达，在植物的抗逆系统中发挥重要作用[35]。Laloi等[36]研究表明，Trx h过量表达促进拟南芥CAT等抗氧化酶活性升高，从而增强其对逆境胁迫的耐受能力。在本研究中，随着弱光胁迫程度的加强，Trx h表达量与CAT活性呈正相关，进一步验证了Laloi的研究结果。
3.6.3 光敏色素Phy光敏色素(phytochrome, Phy) 作为一类红光/远红光受体，广泛地存在于高等植物体内，在植物抗逆的调控网络中发挥了重要作用[37]。光敏色素包括远红光吸收型(Pfr) 和红光吸收型(Pr) 两种类型，Pfr是生理激活型，直接与光敏色素互作因子(phytochrome interacting factors, PIFs) 作用调控相关基因的表达。PIF3是bHLH转录因子家族中一员，与光敏色素协同调控茉莉酸的合成代谢和信号途径[38]。Zhai等[39]研究发现，茉莉酸信号途径介导的抗性通路和光敏色素介导的光信号途径互相拮抗。因此推测光敏色素可能通过调控茉莉酸的合成代谢或信号途径进而影响植物对逆境胁迫的响应。有研究发现光敏色素调控叶片形态和气孔开闭，从而影响蒸腾速率和气孔导度[40-41]。Phy B通过调节转录因子MYB60的表达来调控气孔开闭[42]。Liu等[43]对水稻的研究发现，过量表达Phy B的水稻单位叶片面积的蒸腾速率降低、水分的散失减少，对逆境环境有更强的适应能力。此外有研究发现在白光胁迫下，Phy B和PhyAPhyB株系不能引发局部或系统性气孔关闭，而PhyA株系仅能引发局部气孔关闭，表明PhyB是局部及系统性气孔响应所必需的[44]。Phy E与Phy B有高度的同源性，说明它们在结构上高度相似，而蛋白质的功能又是由其结构决定的，所以我们猜测Phy E可能和Phy B一样也具有调控叶片气孔开关的功能。这些基因是否确实受弱光胁迫的特异性诱导，仍需通过实验进一步验证。
4 结论本研究通过对‘鄞红’在不同弱光胁迫下的各种生理指标变化及转录组学的分析，结果表明：在低强度弱光处理条件下，‘鄞红’葡萄光合特性及其他生理生化指标与对照组相比，均无显著差异；在高强度弱光处理条件下，叶片细胞组织结构以及CAT、POD和CAT活性与对照组相比，都发生显著变化，表明‘鄞红’葡萄对弱光胁迫有一定的抗性。转录组学研究发现，随着遮荫程度的增强，差异表达基因的数量逐渐增多。通过比较不同弱光胁迫下基因的表达情况，初步筛选出了4个可能与‘鄞红’弱光胁迫相关的差异表达基因，它们与JA/MYC2途径、MAPK信号途径、多酚氧化酶和硫氧还蛋白相关基因以及光敏色素相关基因有关。
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