2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 宋云洪, 吴冉冉, 魏欣蕾, 石婷, 李运杰, 游淳, 张玲玲, 朱之光, 张以恒
- SONG Yunhong, WU Ranran, WEI Xinlei, SHI Ting, LI Yunjie, YOU Chun, ZHANG Lingling, ZHU Zhiguang, ZHANG Yiheng
- 电-氢-糖循环的新能源体系研究进展
- Advances in a new energy system based on electricity-hydrogen-carbohydrate cycle
- 生物工程学报, 2022, 38(11): 4081-4100
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(11): 4081-4100
- 10.13345/j.cjb.220587
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文章历史
- Received: July 27, 2022
- Accepted: October 5, 2022
- Published: October 11, 2022
引用本文
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2. 国家合成生物技术创新中心，天津 300308
2. National Innovation Center for Synthetic Biotechnology, Tianjin 300308, China
发展绿色低碳的可再生能源体系已经成为重要的国际共识和方向，也是我国践行“双碳”目标、保障能源安全、走可持续发展的必要路径[1]。电能是最好的二次能源之一，其生产方式多样、应用广泛，已成为低碳社会不可或缺的能源形式。构建以电能为中心的新能源系统的关键挑战之一是如何高效存储电能，将电能高效转化为优质化学能进行长期储存，从而解决绿电生产与电能利用的衔接和匹配问题。氢经济是以氢为能源媒介(储存、运输和转化) 的一种未来的经济结构设想，于20世纪70年代提出的。氢经济是一个解决电能储存和应用(尤其车载动力源) 的关键技术方案，但是氢经济面临着4个挑战：(小型分布式) 绿氢生产、高密度氢储存、缺乏氢经济的基础设施、燃料电池价高和寿命短。解决电储存和氢经济的“产储运”的难题驱动了能量高效转化与储能技术的创新与不断突破[2]。
针对该关键问题，笔者团队于2012年提出了基于电-氢-糖(electricity-hydrogen-carbohydrate, EHC) (二次能源) 循环的新能源体系(图 1)[3]：糖(碳水化合物，尤其是淀粉) 所蕴含的化学能可从自然光合作用或者人造光合作用而来，再通过全新生物路线高效转化为氢能或电能；氢能或电能可从多种一次能源转化而来，再通过生物路线高效转化为糖中的化学能(即人造光合作用)；氢能和电能之间则通过现有的氢燃料电池技术(氢到电) 或电解水技术(电到氢) [t1] 实现相互转化。糖是自然界生物体选择的储能有机物，在很多生物体内，通过酶促反应被逐级分解以提供生命活动所需的能量基础。本团队提出糖(淀粉为主) 作为氢能载体和储电能介质，超越自然获取生物能的方式，具有如下优点[4-5]：糖具有较高的能量密度(17 MJ/kg)，比锂离子等金属电池高出10倍之多，是压缩氢气的2–3倍；糖可从自然界的植物、秸秆、废弃物等获得，例如我国每年生产近10亿t可利用生物质资源[6]，相当于6亿t糖；现有基础设施可以实现大规模和低成本的糖储存和运输；生物转化时反应条件温和，相对安全、小型生物制造设备投资小。更重要的是，根据理论计算，电-氢-糖循环具有很高的能量转化效率(理论和实际)，甚至可突破100%的化学能转化极限(例如，糖水到氢过程中能够实现利用低温热能转化为氢能)[7]。此外，糖与氢、糖与电的相互转化，会伴随二氧化碳的释放与利用，因此也是绿色低碳能源路线的重要组成。
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| 图 1 电-氢-糖循环示意图[3] Fig. 1 Schematic diagram of electricity-hydrogen-carbohydrate cycle[3]. Three forms of secondary energy can be converted from non-renewable energy sources or renewable energy sources. For theoretical energy efficiency of bidirectional conversion (practically achieved energy efficiency shown in brackets). 三种能源形式可由不可再生能源或可再生能源转化而来，相互转化的理论能量效率(括号里为实际获得能量效率) |
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在电-氢-糖循环的6条转化路线中，氢与电的相互转化主要利用化学催化剂通过氢燃料电池和电解水实现，均是较为成熟的技术。针对其余4条路线，笔者团队提出了基于生物催化剂的体外多酶催化系统(in vitro synthetic enzymatic biosystem, ivSEB) 来实现[8-9]。体外多酶催化系统是在体外通过模拟自然或创建全新的多酶催化途径，实现底物到产品的生物转化系统。由于该系统不涉及细胞的生长，没有细胞膜阻隔，也没有复杂的代谢调控网络，因此具有高原子经济性或能量转化效率、高反应速率、良好的传质、宽泛的反应条件(如环境耐受性高)，以及更容易过程调控和强化等优点。体外多酶催化系统是合成生物学的一个重要方向，不同于基于细胞提取物的无细胞系统：前者可通过精准设计与改造强化酶元件，显著提高酶元件性能，降低酶制造成本，可用于生产高值精细化学品、低值大宗化学品和新能源产品[10-11]。近年来，随着酶工程的快速发展，体外多酶催化系统迅速发展，实现了由葡萄糖、淀粉、木质纤维素等底物到维生素、健康糖、有机酸、高值糖磷酸化合物、生物材料、液体生物燃料、氢气、电能等产品的转化，逐渐成为一个颠覆性的新生物制造平台[12-18]。在糖与氢、电的相互转化方面，笔者团队已设计构建了多条体外多酶催化系统，获得了国际领先的能量转化效率[14, 19-23]，是合成生物学在新能源领域的典范。
本综述聚焦电-氢-糖循环的新能源体系，重点介绍了基于体外多酶催化系统的糖到氢、糖到电，以及氢或电到糖的转化，阐述体外多酶催化系统的设计原则和分子基础，讨论其特色和优缺点(表 1)，电-氢-糖循环还可以延伸出以糖为核心的体外合成生物制造，具有广阔的应用前景。希望本综述为构建绿色低碳的新能源路线提供科学参考，对体外合成生物技术的发展也具有重要指导意义。
| Metric | Advantage (+)/ challenge (–) |
Description of advantage/ solution to challenge |
Example | References |
| Pathway design | (+) flexible pathway design | Able to design unnatural synthetic pathways | An artificial in vitro pathway uses nine enzymes to stereoselectively produce islatravir from simple building blocks. It requires fewer than half the number of steps of previously reported routes | [24] |
| Enzyme | (+) a wide choice of enzyme sources | Can simultaneously use enzymes from different sources, even when they are difficult to co-express | Different enzymes from bacteria, fungi, and plants have been used in one pot to investigate the ability of the system to produce starch from methanol | [25] |
| (–) costly enzymes; (–) enzyme deactivation | To use enzymes with high total turn-over number (TTN)[26] values | Fructose-1, 6-bisphosphatase from Thermotoga maritima has an estimated TTN of 20 500 000 (mol product/mol enzyme) at 60 ℃ |
[27] | |
| To improve the recombinant protein expression levels | Expression level of soluble recombinant T. maritima 6-phosphogluconate dehydrogenase in Escherichia coli has been increased by more than 500 folds upon optimization of expression conditions | [28] | ||
| Utilization of thermostable enzymes | By using hyperthermophilic enzymes, one-step enzyme purification by heat treatment is allowed, and in vitro production of myo-inositol from starch can be operated at 70 ℃ | [12] | ||
| Protein engineering to enhance thermostability | A more than 14 ℃ increase in melting temperature (Tm) of Bacillus subtilis p-nitrobenzyl esterase has been achieved through directed evolution without compromising its activity at lower temperatures | [29] | ||
| Enzyme immobilization to enhance thermostability | Immobilized glucose isomerase can work at around 55 ℃ for up to two years | [30] | ||
| Bulk enzyme production | Recombinant protein expression by the Bacillus T7 system in high-density fermentation, decreasing its production costs to $30–40/kg enzyme | [31] | ||
| Coenzyme | (–) costly and unstable coenzymes | Coenzyme regeneration | A CO2-fixing system containing NAD(P)H, ATP and FAD regeneration modules has been designed | [32] |
| Design and utilization of biomimetic coenzymes | A hyperthermostable glucose dehydrogenase has been engineered to give enhanced activity towards a synthetic nicotinamide biomimetic coenzyme. This engineered enzyme has been used in combination with an enoate reductase for the complete conversion of 2-methylbut-2-enal | [33] | ||
| Reaction control | (+) easy-to-adjust reaction conditions | Temperature, pH, substrate and enzyme concentrations can all be adjusted with high flexibility | In vitro production of fructose 1, 6-diphosphate has been tested under different temperatures, pH values and enzyme ratios for optimal system performance | [34] |
| (–) different optimal conditions for different enzymes | Multi-stage reactions | For two-stage production of myo-inositol from cellodextrin, the temperature increases at stage 2 to speed up downstream reactions |
[35] | |
| Product yield | (+) high or even near theoretical product yield; (+) high product titer | Because there is no cell growth or metabolism | In vitro synthetic enzymatic biosystem breaks the Thauer limit of microbial fermentation (i.e. 4 H2/glucose) by theoretically producing 12 H2/glucose |
[36] |
| Due to higher system tolerability to toxins | The in vitro system can produce around 0.5 g/L cannabigerolic acid or cannabigerovarinic acid which is almost two orders of magnitude higher than microbial production by yeast | [17] | ||
| Product separation | (+) easy product separation | Due to lack of cell walls | Polyhydroxybutyrate produced in vitro precipitates and hence can be easily collected without cell lysis | [37] |
| Scale-up | (+) easy for scale-up | Similar system behavior after scale-up | In vitro synthesis of myo-inositol has been successfully manufactured in 60 000 L reactors | [12] |
自然界中氢元素储量非常丰富，多以化合物形式存在于水、碳氢化合物、碳水化合物中，可通过化学、电化学或生物过程转化成氢能(图 2)。电化学裂解水制氢技术是氢氧燃料电池的逆反应，电能可来源于太阳能、风能等可再生能源，也可来源于工业废电，但是生产成本高，受到产电的成本限制。以碳氢化合物(煤、石油及天然气) 为原料制氢多采用高温高压条件，投资大、不能小型分布式生产，需要整合碳捕获和封存技术处理二氧化碳副产物，将逐步被其他方法取代。生物质(主要是碳水化合物，简称“糖”) 制氢也是近些年被普遍关注的研究方向，这主要是因为生物质资源丰富，每年产量是消耗量的6倍[6]，而且来源和燃烧产物均为二氧化碳和水，碳净排放为零，符合绿色发展需求。
生物催化碳水化合物制氢主要分为微生物发酵法和体外多酶催化法。在微生物发酵方面，尽管代谢工程和合成生物学进行了大量的研究，但至今没有一种天然或工程微生物能产生超过4 mol氢气/mol葡萄糖的限制，即Thauer极限[39-41]。相比之下，体外多酶催化法采用多种酶将糖和水催化分解生成还原力NADPH或NADH，再通过氢化酶将还原力转化成氢气，理论产量为12 mol氢气/mol葡萄糖，远高于微生物4 mol氢气/mol葡萄糖的限制。由于反应物糖和水为液态，产物氢气和二氧化碳为气态，使得该反应成为目前首个能利用低温热能生产氢能的化学反应[19, 38, 42]。
1.1 糖产氢的高得率获得自2007年以来，笔者团队针对自然生物体利用糖产氢能效低和速率慢的科学问题，设计并验证了全新的体外多酶催化糖产氢途径，如图 3所示，该途径包含3个功能模块，分别是：(1) 底物能量激活模块，产生葡萄糖6-磷酸(G6P)；(2) 电子生成模块，将G6P的电子和质子以NADPH的形式转移，进而被氢化酶转化产生氢气；(3) 碳重排模块，将核酮糖5-磷酸生成G6P。
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| 图 3 体外多酶催化途径产氢或电示意图 Fig. 3 Schematic diagram of hydrogen or electricity production by in vitro synthetic enzymatic biosystem. The enzymes are αGP: α-glucan phosphorylase; SP: sucrose phosphorylase; Ⅺ: xylose isomerase; PPGK: polyphosphate glucokinase; PGM: phosphoglucomutase; G6PDH: glucose 6-phosphate dehydrogenase; 6PGDH: 6-phosphogluconate dehydrogenase; DI: diaphorase; H2nase: hydrogenase; XK: xylulokinase; Ru5PE: ribulose 5-phosphate epimerase; RPI: ribose 5-phosphate isomerase; TK: transketolase; TAL: transaldolase; TIM: triose phosphate isomerase; ALD: fructose-bisphosphate aldolase; FBP: fructose 1, 6-bisphosphatase; PGI: phosphoglucose isomerase. Metabolites are G1P: glucose 1-phoshpate; Pi: inorganic phosphate; G6P: glucose 6-phosphate; 6PG: 6-phosphogluconate; Ru5P: ribulose 5-phosphate; R5P: ribose 5-phosphate; Xu5P: xylulose 5-phosphate; G3P: glyceraldehyde 3-phosphate; S7P: sedoheptulose 7-phosphate; E4P: erythrose 4-phosphate; F6P: fructose 6-phosphate; DHAP: dihydroxyacetone phosphate; FBP: fructose 1, 6-bisphosphate. |
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概念验证实验是以淀粉和水为底物生产氢气[42]，途径包含：(1) 通过α-葡聚糖磷酸化酶催化淀粉和磷酸盐生成葡萄糖1-磷酸(G1P) (公式(1))；(2) 通过磷酸葡萄糖变位酶转化为G6P (公式(2))；(3) 通过2个脱氢酶将G6P生成2个NADPH (公式(3))；(4) 由氢化酶催化NADPH生成氢气(公式(4))；(5) 由碳重排模块将核酮糖5-磷酸生成G6P (公式(5))。整个化学计量反应可以写成式(6)，该反应体系既不需要昂贵的G6P，也不需要ATP，是第一个通过吸收低温废热产生氢能的化学反应。此外，通过该途径产生的氢很容易分离和收集，因为在低于水沸点的温度下，含水反应物生成气态产物。这表明利用多糖低成本的绿色制氢具有很大的潜力。具体来说，概念实验利用来源于细菌、酵母、动物、植物和古菌的13个酶，以淀粉和水为底物，生产氢气，产氢得率为5.19 mol氢气/mol葡萄糖[42]。
进一步，本团队已证实以不同糖类为底物，利用体外多酶催化途径高效产氢是完全可行的，如图 3所示，已实验验证的糖类底物包括淀粉[13, 23, 42]、纤维素[19]、木糖[20]、蔗糖[21]、生物质单糖[22]和低聚木糖的混合物[43]，为糖产氢研究奠定了坚实的基础。以纤维素材料(如纤维二糖、纤维五糖) 和水为底物，产氢得率分别达到了理论得率的93% (纤维二糖) 和68% (纤维五糖)，最大产氢速率也达到了3.92 mmol/(L·h)[19]。然而，在多糖或寡糖产氢的途径中，有一个葡萄糖单位不能转化为G-1-P，为了完全利用所有己糖单位，途径中加入了利用低成本的聚磷酸盐生产G-6-P的反应[44]，最终实现蔗糖[21]和葡萄糖[22]的所有己糖单位均可用于产氢，产氢得率接近理论值(即每mol葡萄糖可产生接近12 mol氢气)。另外，为了利用木糖(自然界最丰富的戊糖) 生产低成本氢气，本团队发现了一种新的多磷酸盐木糖激酶，通过使用这种酶和聚磷酸盐，成功从1个木糖和水中产生了近10个氢气[20]。并且，还展示了一种体外非天然的酶解途径，利用生物质低聚木糖中储存的化学能来分解水，以产生接近理论产量的氢气(达到每mol木糖可产生9.5 mol氢气)[43]。进一步地，利用5种嗜热酶，包括异淀粉酶(isoamylase, IA)、α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucan phosphorylase, αGP)、4-α-葡聚糖转移酶(4-α-glucanotransferase, 4GT)、多磷酸葡聚糖激酶(polyphosphate glucokinase, PPGK) 和磷酸葡萄糖变位酶(phosphoglucomutase, PGM)，设计了淀粉完全磷酸化为G6P的无需ATP体外多酶途径(图 4A)，使淀粉产氢的得率达到理论值，即每mol葡萄糖可产生接近12 mol氢气[23]。
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| 图 4 体外多酶催化糖产氢途径优化[13, 23, 45-46] Fig. 4 Optimization of in vitro synthetic enzymatic biosystem for hydrogen production from carbohydrate[13, 23, 45-46]. (A) Enzymatic pathway depicting the complete phosphorylation of starch to G6P without the use of ATP[23]. (B) Schematic diagram of biomimetic electron transport chain for improving hydrogen production rate[45]. (C) Surface view of wild-type 6PGDH with NADP+ and mutant A30D/R31I/T32I with NAD+[46]. (D) Schematic diagram of the NAD+-based electron transport chain comprised of NAD+-conjugated mG6PDH, NAD+-conjugated m6PGDH, and BV-conjugated DI (BCV-DI) for improving hydrogen production rate. IA: isoamylase; 4GT: 4-α-glucanotransferase; αGP: α-glucan phosphorylase; PGM: phosphoglucomutase; G6PDH: glucose 6-phosphate dehydrogenase; 6PGL: 6-phosphogluconolactonase; 6PGDH: 6-phosphogluconate dehydrogenase; NROR: NADPH rubredoxin oxidoreductase; SHI H2ase: soluble hydrogenase I; G6P: glucose 6-phosphate; BV: benzyl viologen; Ru5P: ribulose 5-phosphate. A：淀粉完全磷酸化为G6P的多酶催化途径[23]；B：利用人工电子传递链提高产氢速率的示意图[45]；C：脱氢酶6PGDH的辅助偏好性由NADP+改造为NAD+[46]；D：利用偶联NADH的脱氢酶mG6PDH和m6PGDH和偶联BV的黄递酶DI (BCV-DI) 提高产氢速率的示意图[13] |
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本团队在提升产氢速率的问题上也进行了深入地探索，通过多种策略，逐步提升产氢反应速率，相对于最初的产氢速率，将产氢速率提升了1 000倍，达到530 mmol/(L·h)[13]。其中，在体外多酶催化糖产氢体系中，利用遗传算法将非线性动力学模型参数与实验数据拟合，并通过全局灵敏度分析确定对反应速率和产率影响最大的酶，然后，使用该模型优化酶载量后，氢气生产速率提高了3倍，最高达到32 mmol/(L·h)。接着，通过提高反应温度、底物和酶浓度，生产速率进一步提高到54 mmol/(L·h)，与使用该方法的初始研究相比增加了67倍[22]。
由于H+/H2氧化还原电对的中点电位(E0’=–414 mV) 比天然电子载体NADPH (E0’=–320 mV) 更负，因此从热力学上讲，从NADPH产氢气的反应是不利的。这个反应在生物体内和体外产氢气过程中都是一个已知的限速步骤。因此，研究人员通过引入一种氧不敏感的电子介质苄基紫精(benzyl viologen, BV) 和一种NADPH红素氧还蛋白氧化还原酶(NADPH rubredoxin oxidoreductase, NROR) 来催化NADPH和BV之间的电子传递，设计了从NADPH到氢气的人工电子传递链(图 4B)。实验结果表明，与仅由SHI氢化酶催化的氢气生成速率相比，使用这种人工电子传递链的氢气生成速率增加了约5倍，最高产氢速率达到310 mmol/(L·h)[45]。
此外，为了使用更加便宜且更加稳定的辅酶NAD+替代反应中的辅酶NADP+，研究人员首先通过(半) 理性设计和定向进化的方法，对反应中的脱氢酶6PGDH进行改造，成功得到了从NADP+到NAD+的辅酶选择性逆转的脱氢酶[46-47]。随后，又成功将脱氢酶G6PDH的偏好性由NADP+改造成NAD+[13]。为了进一步加快电子传递，提升产氢速率，研究人员将辅酶NAD+分别与两个脱氢酶mG6PDH和m6PGDH进行偶联，将BV和黄递酶(diaphorase, DI) 进行偶联(图 4C)，最终，在一个由15种嗜热酶组成的体外多酶反应中，通过以NADH为辅酶的戊糖磷酸途径以及人工电子传递链，在80 ℃反应温度下，产氢速率达到530 mmol/(L·h)[13, 46]。另外，实验表明，应用这两种偶联NAD+的脱氢酶以及超嗜热酶，产氢体系可以维持9 d制氢，NAD+总周转数超过10万。这种生物制氢系统具有最高的化学能效和极高的反应速率，大部分解决了与成本效益、分布式制氢和基础设施相关的挑战[13]。
相比于微生物发酵体系，体外多酶催化体系用于生物制造此前普遍被认为难以克服成本经济性和体系稳定性的问题，特别是用于生物产氢。然而，经过本团队十余年研究，已通过热稳定性酶的过量表达部分解决了酶的成本和鲁棒性问题；验证了碳水化合物(淀粉、纤维二糖、纤维五糖、蔗糖、葡萄糖、果糖和木糖等) 产氢的普适性；并将产氢速率从最初的0.5 mmol/(L·h) 提高至530 mmol/(L·h)，实现了1 000倍的速率提升，根据目前氢能源汽车需求预测，在目前产氢速率的基础上再提高10倍即可用于车载动力示范。
2 糖到电的转化糖类物质还可用来直接发电。最早在20世纪60年代，美国NASA就提出以酶作催化剂、糖类为底物的生物燃料电池，可以将航天员在太空中产生的有机废弃物转化为清洁电能。然而，在随后的几十年里，酶燃料电池(enzymatic fuel cell, EFC) 的研究进展十分缓慢，直到步入21世纪后才进入快速发展时期。目前，EFC的发展仍面临4个重大挑战：无法完全氧化燃料、功率密度低、运行稳定性差和电压输出受限。
2.1 糖底物的完全氧化产电在构建EFC时，将能量密度和功率密度最大化是至关重要的，能够提高EFC的应用潜力。大部分燃料(如葡萄糖、乳酸、丙酮酸或乙醇等) 的完全氧化都需要几种酶的协同催化才能完成，然而，目前大多数EFC仅使用一种酶来完成燃料的部分氧化，导致电池效率和能量密度低。糖类燃料电池的主要优点之一是每重量或每体积所能储存的能量比大多数二次电池高得多，但开发这种能量储存潜力需要一系列逐步氧化燃料的级联反应。大多数以葡萄糖为燃料的EFC是利用葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GOx) 或NADH依赖性的葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase, GDH) 为催化剂，每个葡萄糖分子只产生理论24个电子中的2个。为了实现更完全的葡萄糖氧化，Sakai等和Cosnier等将吡喃糖脱氢酶(pyran sugar dehydrogenase, PDH) 和纤维二糖脱氢酶(cellobiose dehydrogenase, CDH) 结合起来，使得一个葡萄糖分子氧化可获得6个电子[48-49]。受到活细胞中葡萄糖完全氧化代谢途径的启发，Minteer等提出了一种在生物阳极上将葡萄糖氧化为二氧化碳的六酶系统。然而，该系统由于中间反应也产生二氧化碳，因此无法证实葡萄糖的完全氧化[50]。
为了实现糖类底物的完全氧化产电，本团队做了大量研究，最终构建出了基于体外多酶催化途径的EFC，可将各种糖类物质完全氧化生成二氧化碳，并产生接近理论得率的电子数(图 3)。与产氢途径类似，基于两种依赖于NAD+的脱氢酶，即G6PDH和6PGDH，我们首先设计了G6P的两步氧化产电过程。在此过程中，G6P被氧化生成二氧化碳和核酮糖5-磷酸(ribulose 5-phosphate, Ru5P)，同时NAD+被还原为NADH。还原的NADH随后被DI再氧化，每个NADH产生2个电子。这些电子通过如维生素K3 (VK3) 等电子中介体进一步转移到阳极上，即产生电能。因此，1个G6P分子可产生4个电子[51-52]。中间体Ru5P是一种C5化合物，可以重新进入再生C6化合物G6P的途径并产生电子。麦芽糖糊精的葡萄糖单元产生的G6P，经过氧化和再生模块6次，可实现完全氧化，产生近24个电子，接近理论值[14]。结果表明，当麦芽糊精浓度为15% (W/V)时，EFC的储能密度为596 Ah/kg，法拉第效率为92.3%。纤维素也可通过纤维素糊精磷酸化酶(cellulose dextrin phosphorylase, CDP) 和葡萄糖磷酸变位酶(phosphoglucomutase, PGM) 的催化作用转化为G6P，利用上述产电途径氧化产电[53]。然而，这一途径仅可利用如麦芽糊精、纤维素和淀粉等多糖，不能直接应用于葡萄糖。此后，将糖酵解和磷酸戊糖途径结合起来的体外多酶分子机器被证明能利用葡萄糖产生接近理论可用的电子产量[54]。该途径不涉及ATP、辅酶A或膜蛋白。通过引入一种新酶即6-磷酸葡萄糖内酯酶(6-phosphogluconolactonase, 6PGL) 后，反应速率提高了近1倍，法拉第效率可达98.8%，最大电流密度为6.8 mA/cm2。同样，通过在糖转化模块中加入相应的酶，设计了一个体外15种酶的多酶分子机器，可以在EFCs中利用葡萄糖、蔗糖和果糖的混合物产电[55]。3种糖底物分别经过几个糖磷酸化步骤得到G6P，然后进入上述氧化产电和中间体再生模块。该EFC实现了约95%的法拉第效率，并产生了1.08 mW/cm2的最大功率密度。这项工作首次证明了在EFCs中可使用糖混合物作为燃料，并实现了接近理论可用的能量密度。麦芽糖是一种天然的α-(1, 4) 链双糖，在食品工业和微生物发酵中有着广泛的应用。在麦芽糖磷酸化酶、β-磷酸葡萄糖激酶和多磷酸葡萄糖激酶的催化作用下，每个麦芽糖分子转化为两个G6P分子，随后进入氧化产电模块，理论上可产生48个电子，由此构建的糖电池法拉第效率为96.4%，最大功率密度为0.6 mW/cm2[56]。
除上述己糖燃料外，木糖作为植物生物量中第二大单糖和最丰富的戊糖，也是一种很有前景的糖燃料。一种体外重组的细菌戊糖磷酸途径首次被证实可在EFC中利用木糖产电，每个木糖分子可以在5次G6P再生循环中产生20个电子[57]。木糖的完全氧化为生物质中己糖和戊糖的共同利用铺平了道路，在此基础上，生物质水解物中的葡萄糖和木糖可被同步利用并完全氧化，从而实现EFC的高能量密度，法拉第效率为92%[58]。通过优化酶量和温度，并利用活性炭去除生物质水解物中的酶抑制剂后，以生物质糖为燃料的EFC最大功率密度为0.5 mW/cm2，10 d后功率密度仍为初始值的60%。
2.2 酶燃料电池的性能提升电池的输出功率，直接决定了其应用前景。例如，现在使用的氢燃料电池功率在几十到几百千瓦，功率密度可达几千瓦/L。对于以糖为底物的酶燃料电池来说，目前世界上功率密度最高的为日本索尼公司开发的糖电池，可达到10 mW/cm2。本团队创制的糖底物完全氧化技术所构建的EFC，功率密度可达2 mW/cm2。为了进一步提高功率密度，需要整合更多的生物化学、电化学、化学工程、纳米材料等一系列领域的知识。最近，基于蛋白质工程的多酶复合体可应用于EFCs中，以提升电池的能量转化效率[59-62]。多酶复合体可使多种酶在空间上相互靠近，底物或中间物从一个酶的活性中心有效地转移到另一个酶的活性中心，不仅可缩短转运和反应时间，还能减少扩散引起的中间物损失。例如，通过使用交联的己糖激酶和G6PDH的双酶复合物氧化葡萄糖，可提高EFC的功率密度[63]。此外，以支架蛋白为结构核心，根据蛋白相互作用，将多种酶元件对接而成的多酶自组装体也可应用于EFCs中[64]。本团队利用天然纤维小体中的黏连蛋白(cohesin) 和锚定蛋白(dockerin) 之间的高亲和力和高特异性相互作用，构建了纤维糊精磷酸化酶和磷酸葡萄糖变位酶的双酶复合体，通过下游酶拉动上游酶从而克服热力学瓶颈，将电流密度和功率密度分别提高了3.35倍和2.14倍(图 5A)[53]。
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| 图 5 基于体外多酶途径的糖底物酶燃料电池功率和性能提升策略[53, 65-67] Fig. 5 Power and performance enhancement strategies for sugar substrate enzyme fuel cells based on in vitro synthetic enzymatic pathway[53, 65-67]. (A) The two-enzyme complex increases the rate of cellulose dextrin oxidation and electricity generation based on in vitro synthetic enzymatic pathway[53]. (B) Double-layer screening method for the fast identification of 6PGDH mutants[65]. (C) Preparation of carbonized polypyrrole as an electrode material[66]. (D) Photo-switch working mechanism based on C-dots and TMB[67]. A：双酶复合体提高基于体外多酶途径的纤维素糊精氧化产电速度[53]；B：通过定向进化，利用双层筛选方法快速识别6PGDH突变体以提高pH耐受性[65]；C：碳化聚吡咯电极材料的制备原理图[66]；D：基于碳点和3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺(TMB) 的光开关工作机理示意图[67] |
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EFC中的电子是由电极界面上发生的氧化还原反应所产生的。因此，酶的催化性能以及酶分子内部、酶与酶之间、酶与电极之间的电子传递是影响EFC功率的关键因素。G6P氧化产电过程中的两个核心酶G6PDH和6PGDH均为NAD+依赖性脱氢酶。为促进辅因子介导的电子生成和转移过程，可将辅因子和氧化还原酶共固定化，从而使固定化的辅因子能够保持在酶的附近而不被释放到溶液中，并利用电极加速辅因子的再生[68]。利用聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG) 构建酶-辅因子/电子中介体偶联物，包括G6PDH-NAD+、6PGDH-NAD+和DI-BV2+，并应用于G6P的产电过程，研究发现在低辅因子或电子中介体浓度条件下，形成的偶联物可使电流密度和功率密度成倍增加，并大大提高了燃料电池的稳定性[69]。与其他基于固定化辅因子的EFC相比，该策略不仅避免了由于固定化而导致的辅因子浸出或失活，还实现了可设计的酶-辅因子距离和构型。此外，氧化还原酶改造也是调控界面电子传递的常用策略。酶的活性位点通常埋在蛋白质内部，难以与电极直接接触，不利于电子传递。通过删除在N端、C端或loop区域不维持蛋白质结构和功能的非必需氨基酸残基，可使酶活性位点更加靠近电极表面，从而缩短原始电子传递路径[70]。将包含4个亚基的NiFe氢酶(PfSHI) 截短为2个亚基后，由于酶与电极之间的电子传递距离缩短，其电子传递速率较野生型酶提高了约20倍[71]。
由于大多数酶易失活，且有些天然酶的活性较低，导致EFC的功率低和稳定性相对较差，可通过对氧化还原酶的蛋白质工程改造来提高酶催化活性和电子转移速度[72]。一方面，可以通过挖掘天然热稳定性高的酶；另一方面，采用定向进化、理性设计和组合策略等可改善氧化还原酶的酶学性质，如活性、稳定性、最适pH、热稳定性、对盐的耐受性以及辅酶偏好性等，从而增强电池性能。例如，在运行大功率葡萄糖EFC时，电流产生较快，葡萄糖氧化产生的酸性产物积累，导致pH值下降以及阳极酶的酸变性失活。因此，提高EFC的耐酸性能，特别是阳极酶的耐酸性能有利于电池的长期运行。本团队利用定向进化的方式筛选出了耐酸的6PGDH[65]和DI[73]突变体酶，在pH 5.4条件下的催化效率比野生型分别提高了42倍和4倍，且稳定性也有所改善(图 5B)。
除对酶的改造外，电极材料的使用也影响EFC的性能。电极材料，尤其是纳米材料，可为酶提供大量附着位点和反应微环境，其优良的导电性也可以帮助电子从酶活性中心传递到电极表面。将矩形聚吡咯(polypyrrole, RPPy) 管高温碳化后，用于构建葡萄糖EFC，开路电压可达1.16 V，最大功率密度为0.35 mW/cm2[66] (图 5C)。3个EFCs串联起来能够持续点亮一个白色LED灯超过48 h。利用一种新型氮氧共掺杂三维杂化碳气凝胶制备的集成电子皮肤，在乳酸驱动下可产生约1.3 mW/cm2的最大功率密度[74]。通过电极修饰材料或修饰官能团可以改变酶的定向固定方式。将PfSHI固定在4-甲基苄胺修饰的氨基化多壁碳纳米管上，PfSHI靠近疏水表面时会在电极上形成合适的空间构象[75]。EFCs因其可持续性和生物相容性被认为是可植入生物医学装置的可靠电源。然而，由于体内反应物浓度受限以及生物电极污染和泄漏可能性，限制了EFC的实际应用。将新型二维金属碳化物纳米材料Ti3C2金属碳化物作为一种大比表面积、高导电性的纳米薄片应用于EFC中，制备生物阳极，以5 mmol/L葡萄糖为底物，在流动条件下可获得最大功率密度0.32 mW/cm2和最大电流密度2.1 mA/cm2，能够连续放电约20 d[76]。该模型有望应用于EFC的体内植入式设备并长期运行。
由于酶反应一旦开始，EFC阳极中的燃料就会持续消耗，在不需要使用电能时会造成能量的浪费，因此，需要对EFCs的输出进行控制。除常用的反应温度和pH控制外，还可通过光照控制。例如，利用G6PDH和DI与自然光感受器“Mag”的融合蛋白所构建的EFC，其输出电流和功率密度对蓝光具有敏感和高效的响应，光照20 min后电流从5.9 μA增至10.8 μA，重回黑暗条件电流则在30 min内回落至初始水平[77]。通过设计一种可催化3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺(3, 3′, 5, 5′-tetramethylbenzidine, TMB) 光氧化的新型碳点纳米酶作为阴极的光电开关，实现了EFC的电流和功率密度的快速、灵敏和可重复调节(图 5D)[67]。蓝光照射20 min后，光电开关EFC的电流从2.3 μA增加至约9 μA，功率密度从2.8 μW/cm2增加至35.0 μW/cm2，比大多数文献报道的光电开关效果显著。
3 氢或电到糖的转化尽管利用体外多酶催化途径从糖产氢和从糖产电都已经取得了很好的效果，利用氢能或电能将二氧化碳高效转化为糖类却仍是当前研究面临的重要挑战。近年来，研究人员开发了多种化学方法，利用氢能或电能将二氧化碳高效地转化为一氧化碳[78]、甲烷[79]、甲醇[80-81]、甲酸[82-84]、乙醇[85]等小分子产品。虽然上述方法尚未能高效地将二氧化碳转化为糖类，却为我们以二氧化碳和氢能、电能等可再生能源利用化学-酶法合成糖类奠定了理论基础。
在本小节中，我们介绍了两例化学-生物法结合的最新研究成果，分别利用氢能和电能，将二氧化碳转化为糖类。此外，我们还将介绍另一种具有高能量效率的，基于氢能/电能进行二氧化碳固定的全新的体外多酶催化反应路径。
3.1 利用化学-酶法将氢气和二氧化碳转化为淀粉中国科学院天津工业生物技术研究所(以下简称“天津工业生物所”) 的马延和团队提出了一种将化学催化与生物催化结合的设计思路，在国际上首次以二氧化碳和氢气为原料实现了淀粉的从头合成[25]。由于酶催化反应通常在水溶液中进行，研究人员选择了水溶性良好的甲醇作为连接化学催化反应和体外多酶催化反应的中间体。反应路径的设计如下：首先利用已建立的化学催化法，在氧化锌-二氧化锆(ZnO-ZrO2) 催化剂作用下对二氧化碳进行加氢反应，生成甲醇[80]，之后通过计算机路径设计，构建了含有10种酶的体外多酶催化路径，将甲醇转化为直链淀粉[25]。理论上，该反应系统利用氢能生产甲醇以及将甲醇转化为淀粉的能量效率分别为85%和61%。为了提高淀粉的合成效率，研究人员采取了多种手段对上述系统进行优化，包括：(1) 通过定向进化提高了限速的甲醛酶(formolase) 的活性。(2) 通过蛋白质理性设计改造，减少了辅酶ATP和ADP对果糖1, 6-双磷酸酶(fructose-bisphosphatase) 的抑制，并提高了二磷酸腺苷葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-glucose pyrophosphorylase) 利用ATP的能力。(3) 开发了时空分离的化学-酶反应体系。上述手段使该系统利用二氧化碳合成直链淀粉的速率提升至约21.9 nmol碳原子/(min·mg总蛋白)，是玉米中通过卡尔文循环合成淀粉速率的8.5倍。在加入淀粉分支酶(starch branching enzyme) 后，该系统同样具备高效合成支链淀粉的能力。这项研究成果不仅为以二氧化碳为原料合成糖类开辟了新的技术路线，同时也展现了合成生物学，特别是体外多酶催化策略在解决瓶颈科技问题方面的巨大潜能，得到了国内外领域专家的高度评价。
3.2 利用氢/电提供还原力，通过体外多酶催化固定二氧化碳在自然界中，所有生物固定二氧化碳产糖的反应路径都需要NADPH和ATP的参与，其中NADPH为反应提供还原力，ATP作为额外的能量驱动力，有助于热力学不利反应的进行。我们提出了高效利用氢能或电能生成还原力，用于人工固定二氧化碳产淀粉的策略(图 6)。其中，利用氢能固定二氧化碳产淀粉的过程以二氧化碳和氢气为原料，通过体外多酶催化，生成淀粉、乙醇和水[86]，总反应方程式如下：
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(7) |
利用电能固定二氧化碳产淀粉的策略以二氧化碳和水为原料，生成淀粉、乙醇和氧气[86]，总反应式如下：
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(8) |
上述催化过程可分为6个步骤，包括：(1) 还原力NADH的生产，以氢气为原料在氢酶(H2ase) 和转氢酶(transhydrogenase) 的催化下进行，或通过电化学催化进行；(2) 通过甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase, FDH) 和甲醛脱氢酶(formaldehyde dehydrogenase, FADH) 的级联催化，将二氧化碳经由甲酸转化为甲醛；(3) 利用天然核酮糖单磷酸途径中的6-磷酸己酮糖合成酶(hexanose 6-phosphate synthase, HPS) 和磷酸己酮糖异构酶(hexanose phosphate isomerase, PHI)，将甲醛和Ru5P固定为果糖6-磷酸(fructose 6-phosphate, F6P)；(4) 一部分F6P用于淀粉的合成；(5) 另一部分F6P经由天然非氧化戊糖磷酸途径中的8种酶催化，重新转化为Ru5P，同时生成甘油醛3-磷酸(glyceraldehyde-3-phosphate, G3P)；(6) G3P经由糖酵解途径生成乙醇。在上述反应系统中，磷酸果糖激酶(phosphofructokinase, PFK) 和糖酵解路径中的丙酮酸激酶(pyruvate kinase, PK) 催化不可逆的反应，有助于拉动整体反应朝着所需的方向进行。此外，氢能驱动二氧化碳固定产淀粉总反应的标准吉布斯自由能变化为–54.5 kJ/mol，而利用电解水过程中再生的NADH，通过体外多酶催化固定二氧化碳的总反应标准吉布斯自由能变化为–460.4 kJ/mol，从热力学角度预示了氢/电驱动二氧化碳产淀粉的可行性[3]。我们所设计的反应系统不仅可以在温和的条件下进行反应，系统中的ATP和NADH都能够达到平衡，并且具有高能量转化效率，以氢能或电能驱动二氧化碳产淀粉的理论能量效率分别为81.4%和99.5%[3]。此外，与前述研究相比，本系统有望摆脱对化学法的依赖，在未来实现从二氧化碳到糖类的人工生物转化。
4 总结与展望过去十几年中，本团队在电-氢-糖循环新能源体系的构建与强化方面取得了一系列成果，特别是基于体外多酶催化的方式，展示了该体系在能量转化效率、反应速率、操作便捷性等方面的诸多优点。除此之外，电-氢-糖循环向外延伸以淀粉/木质纤维素等为核心的体外合成生物制造正在发挥巨大的作用，生产出更具有竞争力成本的生物基产品。肌醇(维生素B8) 是人、动物和植物生长的必需维生素，广泛应用于医药、食品、饲料和化妆品等行业。天津工业生物所张以恒研究员设计构建体外多酶催化系统，解析葡萄糖分子内C–C连接成环的酶分子机理，实现从淀粉转化高效、定向生产肌醇[12]。相比传统高温加压植酸水解的生产路线，降低能耗98%，减少空气污染99%，减少磷污染99%，降低生产成本75%，扩大肌醇生产原料来源10 000倍。生产低成本肌醇又将大大扩展它的应用场景，从现有主流维生素、药物辅剂和动物饲料添加扩展到新应用，如锂电池电解液组分、高爆炸药前体、植物叶面肥等。合作方四川博浩达生物技术有限公司建成万吨级绿色生物制造生产线，现在该公司成为全球最大的肌醇生产企业，实现新增利税超过5亿元。天津工业生物所领导整个多酶催化淀粉生产肌醇项目的全过程创新，实现从0–1和1–100的全过程突破，是全球第一个也是唯一的体外合成生物学的工业化成功范例。另外，张以恒研究员首次提出体外多酶催化系统“秸秆制淀粉”技术方案，通过100%能效留存的糖苷键定向重排将纤维素转化为淀粉，同时解决粮食安全问题以及秸秆处理和利用的问题[15]。为了进一步提高生物炼制工厂的经济可行性，笔者团队创制第一个人工酶——D-木酮糖4-差向异构酶，能将半纤维素D-木糖转化为高值健康糖——L-阿拉伯糖。体外多酶催化系统充分利用秸秆联产淀粉、单细胞蛋白和健康糖的技术，对解决人类面临的粮食短缺、蛋白质短缺、环境污染、碳中和等问题具有重大意义。
目前，电-氢-糖循环仍有些许问题亟需解决。首先，适用于相关体系的酶和辅酶元件以及电子传递、物质循环(碳重排)、辅酶再生等模块仍然有限。这些生物元件和模块在体外的活性、稳定性会影响所在体系的性能，并且相互的适配与协同仍是一大挑战。另一方面，电-氢-糖循环往往还涉及材料科学等非生物领域的交叉融合，特别是与电能产生或利用相关的体系，电极材料制备、电反应器构建、电化学过程机理等诸多问题还需解决，以形成与生物元件和模块的良性互作。此外，为了实现体系的应用，需要进一步完善其工程化，如构建标准化的元件与模块、降低总体成本、实现反应的有效控制以及能量持续稳定地输出或转化等。
为了解决上述问题，可以采取的策略包括：(1) 设计或发现更多性能优异的酶、人工酶和仿生辅酶元件，可采用最新的生物信息学工具和人工智能手段，结合现有的理性改造、定向进化等方式，实现酶的创制和性能提升。此外，通过辅酶工程实现对更稳定、成本更低的人工仿生辅酶的有效利用。(2) 创制多酶复合体、人工电子传递链、固定化酶与材料复合物等，提升系统催化活性和稳定性、电子和物质传递能力，以及降低整个体系成本。开发化学催化、纳米材料等非生物技术手段以弥补部分生物催化过程的不足，例如在电能驱动二氧化碳高效还原方面。(3) 设计创建更多更加高效的人工途径。值得注意的是，多酶途径并非是越短越好，而是针对具体的需求设计最合适最高效的方式，并形成各个步骤环节的高度协同，通过模块化的策略实现体系整体性能最优。
最后，需要指出的是，电-氢-糖循环是能源领域的理论创新，在与其他能源路线相比时，需重点考虑其能量转化效率、反应速率、经济性、生态环境效益等，以综合评价其可行性与应用前景。我们期待在未来，可以突破上述挑战，提供一种低成本、碳中性、高便捷性氢能和电能供给的生物解决方案，促进经济和社会的绿色低碳可持续发展。
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