2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 毕慧萍, 刘晓楠, 李清艳, 程健, 庄以彬, 王冬, 戴住波, 江会锋, 刘涛, 张学礼
- BI Huiping, LIU Xiaonan, LI Qingyan, CHENG Jian, ZHUANG Yibin, WANG Dong, DAI Zhubo, JIANG Huifeng, LIU Tao, ZHANG Xueli
- 植物天然产物微生物重组合成研究进展
- Advances in microbial synthesis of plant natural products
- 生物工程学报, 2022, 38(11): 4263-4282
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(11): 4263-4282
- 10.13345/j.cjb.220598
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文章历史
- Received: July 29, 2022
- Accepted: October 5, 2022
引用本文
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2. 国家合成生物技术创新中心, 天津 300308
2. National Center of Technology Innovation for Synthetic Biology, Tianjin 300308, China
天然产物是药物及其先导化合物的重要来源，1981–2019年间获批上市的药物中有1/4来源于天然产物及其衍生物[1]。植物天然产物是小分子药物的重要来源之一，人类将植物作为药物使用的书面记录可以追溯到公元前2600年[2]，传统中医名著《本草纲目》记载药用植物逾1 000种。植物天然产物在医药、保健品领域应用广泛，在农兽药、化妆品、香精香料等行业也具有重要应用价值[3]。青蒿素、紫杉醇、人参皂苷、吗啡、白藜芦醇及香叶醇等重要天然产物均来源于植物。传统植物天然产物的生产方式主要是植物提取。某些药用植物天然资源濒危、人工种植困难、生长周期长，且活性成分含量低、提取过程繁琐、收率低。天然产物化学合成，往往存在反应过程复杂、产率低、成本高及环境污染等问题。植物组织细胞培养中提取也是植物天然产物重要的获取方式，但植物组织细胞培养生产周期长、操作步骤复杂、成本过高，也不利于扩大生产，商业化成功的案例包括小檗碱、紫杉醇前体及紫草素等，相对较少[4]。基于合成生物学的原理，设计和创建微生物细胞工厂发酵生产植物天然产物，可以突破植物资源限制，为植物天然产物的绿色高效合成提供了新的路线。近年来，随着合成生物学的飞速发展，国内外同行在微生物异源发酵合成植物天然产物取得了重要进展，包括青蒿素、紫杉醇、大麻素、莨菪碱等诸多重要植物天然产物实现了微生物合成[5-10]。中国科学院天津工业生物技术研究所是最早开展植物天然产物微生物重组合成的单位之一，本文重点介绍研究所在“人工本草”计划框架下，在萜类、黄酮类、苯丙素类等重要植物天然产物微生物重组合成方面取得的系列进展(图 1)。
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| 图 1 植物天然产物微生物重组合成 Fig. 1 Microbial synthesis of plant natural products. |
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萜类化合物广泛存在于自然界中，目前已超过8万种的萜类化合物被发现，其中大部分是药用植物中的有效成分[11]。青蒿素、抗癌药物紫杉醇、具有保健作用人参皂苷及作为抗氧化剂的类胡萝卜素类化合物均属于萜类(图 2)。
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| 图 2 典型萜类化合物合成途径 Fig. 2 Biosynthetic pathway of typical terpenoids. |
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一线抗疟药物青蒿素(artemisinin)，是由20世纪70年代中国中医科学院中药研究所屠呦呦先生(我国在自然科学领域的第1个诺贝尔奖得主) 及其研究团队在我国传统中草药青蒿中发现的一种倍半萜类(C15) 化合物。过去的生产方式为从黄花蒿中直接提取。2013年，J.D. Keasling教授在第18届生物化学与分子工程国际大会(BME XVIII) 上介绍：其团队历时10年，实现了青蒿酸在酵母中发酵生产，产量高达25 g/L，进一步通过化学反应合成了青蒿素[7]；经过计算，其在不到100 m3发酵车间年产青蒿素能达到35 t，相当于我国近3 000 hm2耕地的种植产量。该项工作被认为是利用人工合成细胞生产植物源天然产物研究领域的里程碑[12]。2021年，研究团队进一步用易错聚合酶链反应(error-prone polymerase chain reaction, error-prone PCR) 方法对来自黄花蒿的CYP71AV1进行饱和突变，获得的8位点组合突变体使青蒿酸的发酵水平大幅提高至45 g/L[13]。
国内研究学者在萜类化合物的人工细胞合成方面也取得了喜人的进展，如中国科学院上海植物生理生态研究所，在人参和三七中挖掘了多个糖基转移酶，较全面地解析了人参和三七皂苷的生物合成途径，相关糖基转移酶的专利已经进入多个国家和地区进行审查并获得授权[14-15]。同时，该研究所在天然甜味剂甜菊糖的生物合成方面也取得重要进展[16-17]。武汉大学为了提高酵母细胞对番茄红素的承载能力，重点提高胞内脂滴的主要成分甘油三酯的代谢流，并以番茄红素多双键的特点，调控脂质合成中不饱和脂肪酸的含量以及脂滴的大小，从而提高细胞对其的承载能力，实现番茄红素在胞内的高含量存储和番茄红素的高产[18]。中国科学院天津工业生物技术研究所(以下简称“天津工业生物所”) 主要在萜类香精、人参/三七皂苷、三萜酸、类胡萝卜素和紫杉醇等生物合成上取得了进展。
1.1 萜类香精全球香精香料市场广阔，檀香醇、广藿香醇、β-榄香烯、玫瑰精油等萜类精油广泛应用于日化品、食品和药品等领域。β-榄香烯是从姜科植物温郁金、莪术等药用植物中提取的国家一类抗癌药物的有效成分。天然来源的β-榄香烯因其含量低、类似物组成复杂等原因，导致其分离成本过高。天津工业生物所与中国中医科学院中药资源中心合作，利用代谢工程与合成生物学技术提高酿酒酵母中萜类的生物合成通量和产物兼容性。在此基础上，进行吉玛烯A合成酶的蛋白质工程改造和高产吉玛烯A工程菌创建，并成功开发吉玛烯A热转化为β-榄香烯的耦合工艺，最终将高纯度β-榄香烯的获得成本降为植物提取的0.15%[19]。
玫瑰精油被认为是世界上最昂贵的精油之一，被称为“精油之后”，其主要成分为香茅醇、香叶醇和橙花醇。天津工业生物所以天然玫瑰精油的发酵生产为案例，筛选到代谢截流效果显著的ERG7启动子元件。通过ERG7启动子的应用，以及香茅醇生物合成模块的表达及优化，最终获得在5 L发酵罐中香茅醇的产量能达到6 g/L的工程菌。在此基础上，香叶醇-香茅醇合成模块和橙花醇合成模块被整合到同一底盘菌株中，创建了国际上首个同时生产天然玫瑰精油3种主要单萜组分的“玫瑰酵母”菌株rose-yeast 1.0，其组分比例为香茅醇(62%)、香叶醇(27%) 和橙花醇(10%)，与天然大马士革玫瑰精油中3种组分的比例接近，在国际标准认证ISO98422003范围内[20]。Rose-yeast 1.0在5 L发酵罐中混合精油产量能达到5 g/L，预计未来综合成本将节约90%。
1.2 人参皂苷人参皂苷是名贵中药人参和西洋参的有效成分，是原人参二醇、原人参三醇和齐墩果酸三类苷元在糖基转移酶的催化下形成的系列混合物的总称，具有抗肿瘤、降血糖、促免疫等功能[21-23]。天津工业生物所与中国中医科学院中药资源中心合作，在酿酒酵母中首次成功构建原人参二醇的生物合成途径，并且发现鲨烯环氧酶在控制三萜化合物的生物合成中起关键作用[24]。在此基础上，通过提高关键基因的表达活性，将原人参二醇的产量提高了262倍。再通过双相发酵工艺优化，最终将原人参二醇的产量提高至1 g/L[12]。2018年，合作团队公开报道了将细胞工厂三萜合成通量提高到10 g/L级别的构建方案，创建出产量能达到15 g/L人参皂苷前体的高效酵母细胞工厂[25]。另外，将齐墩果酸、原人参二醇和原人参三醇这3个功能模块导入同一底盘细胞，获得能同时合成3种人参基本皂苷元的第一代基于多组分概念的“人参酵母”细胞工厂[26]。在苷元后修饰方面，结合转录组和生物信息学分析构建了一个三七的候选糖基转移酶(UDP- glycosyltransferases, UGTs) 因元件库，并利用“即插即用”生物合成途径解析平台，成功实现了三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、Rb1和Rd等主要三七活性皂苷成分(占三七总皂苷比例的60%) 的生物合成途径高效、低成本解析[27]。2021年，团队发现原人参二醇合酶(protopanaxadiol synthase, PPDS) 定位于内质网，而底物达玛烯二醇-Ⅱ (dammarenediol Ⅱ, DD) 主要存在于脂滴，在异源工程菌中证实了反应底物与酶存在区室化分隔的推论。利用脂滴膜蛋白Pln1p将PPDS靶向DD的储存细胞器-脂滴，为该酶反应重建了新的反应区室，显著提高了原人参二醇的生产效率。进一步引入人参皂苷CK的高效合成模块，获得了在5 L发酵罐中能生产5 g/L人参皂苷CK的工程菌[28]。
1.3 三萜酸苹果、山楂、枇杷、枣和梨等水果表皮蜡质中含有微量的高值三萜酸类活性成分，包括科罗索酸、山楂酸、麦珠子酸和积雪草酸等化合物。它们在抗病毒、糖尿病控制和皮肤修复等方面有广泛用途，是一类重要的膳食补充剂[29-31]。其中，科罗索酸在抗糖尿病方面有显著作用[30]，被认为是一种天然植物胰岛素。从原植物中直接提取是目前生产这类化合物的主要方式。为了创建高效微生物细胞工厂实现这类药效化合物的发酵法生产，天津工业生物所团队开发了“即插即用”生物合成途径快速解析平台，包括植物组织培养、差异转录组测序分析和代谢物分析、候选基因在底盘细胞中的表征及化合物鉴定。利用这一平台，团队从药用植物山楂P450库中首次筛选到能催化齐墩果酸和乌索酸生成2位α-羟化产物山楂酸和科罗索酸功能的P450酶MAA45。在此基础上，创建出高效生产山楂酸和科罗索酸的酿酒酵母细胞工厂，产量分别达384 mg/L和141 mg/L[32-33]。
金铁锁皂苷为云南白药重要组方药金铁锁的活性成分，具有镇痛、抗炎和免疫调节等多重活性。在金铁锁转录组文库构建的基础上，结合“即插即用”生物合成途径快速解析平台，解析了2个参与金铁锁皂苷生物合成的CYP基因，CYP716A262和CYP72A567。将CYP716A262和CYP72A567转化底盘菌BY-bAS，在酵母中重构了金铁锁皂苷元生物合成途径，获得的工程菌在5 L的生物反应器中生产的丝石竹皂苷元和皂皮酸的产量分别达到了146.84和314.01 mg/L[34]。
1.4 类胡萝卜素类胡萝卜素在医药、营养品、化妆品以及食品领域具有重要用途。β-胡萝卜素、番茄红素、虾青素是代表性的类胡萝卜素。天津工业生物所以类胡萝卜素为研究对象，从物质代谢调控、能量代谢调控和细胞生理调控这3个方面开展研究，较为系统地解析了微生物高效合成萜类化合物的调控机制[35-41]。
在物质代谢方面，发现IspG和IspH是重要的限速步骤，并且这两个酶需要协同表达才能发挥作用。IspG的单独过表达会导致有毒中间代谢物1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基4-二磷酸(1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate, HMBPP) 积累，严重抑制细胞生长代谢[35]；开发了分子装置dCas9-Lag，将Crt基因拉到细胞膜附近进行表达，增加了膜组分中类胡萝卜素转化酶的表达量，进一步提高了虾青素产量[36]；利用定向进化技术对CrtW进行突变，并精细调控CrtW和CrtZ表达，虾青素的含量占到总类胡萝卜素产量的99%，最终使用Cre-loxP技术增加CrtW、CrtZ基因拷贝数，获得的工程菌虾青素在5 L发酵罐中产量达0.88 g/L[37]，进一步工作中，虾青素的产量达1.82 g/L[38]。
在能量代谢方面，通过对中央代谢途径(磷酸戊糖和三羧酸循环的多尺度模块化调控，发现三羧酸循环的代谢通量是大肠杆菌好氧合成NADPH的最主要限制因素，解决了萜类化合物合成代谢中的还原力不平衡问题[39]。
在细胞生理调控方面，系统研究了大肠杆菌细胞膜存储能力的限制因素，发现细胞膜形态和细胞膜组分合成能力是制约大肠杆菌细胞膜存储能力的关键因素。引入外源的膜折叠蛋白，能改变大肠杆菌的细胞膜形态，形成细胞膜向内的褶皱。增强甘油磷脂合成能力可以进一步增加细胞膜向内的褶皱，从而进一步增强细胞膜存储能力并显著提高萜类化合物的产量[40]。进一步工作中，通过同时敲除大肠杆菌中基因tolR和nlpI，开发了一种新型的人工膜囊泡转运系统(artificial membrane vesicle trafficking system, AMVTS) 用于转运胡萝卜素。为了弥补因囊泡转运导致的膜成分损失，设计了磷脂乙醇胺的合成途径，最终建立了一种不同于基于天然蛋白的细胞运输系统的新型人工运输机制，为大肠杆菌转运各种疏水化合物提供可能[41]。
1.5 紫杉醇紫杉醇作为目前已发现的最优秀的天然抗癌药物之一，其生产方式主要依赖于从珍稀植物红豆杉中进行分离提取，但因含量稀少，生产能力受到极大限制[42]。为了解决巨大的供需矛盾，科学家数十年深入的研究，寻求利用合成生物学方法来生产此类药物。前期研究表明紫杉醇的生物合成从香叶基香叶基焦磷酸(geranylgeranyl diphosphate, GGPP) 开始需经历19步酶催化反应，其中大约一半反应为细胞色素P450酶介导[43]。虽然历经数十年研究，但是紫杉醇生物合成途径至今尚未完全解析。与此同时，利用微生物转化方法生产紫杉醇仍然处于起始阶段。紫杉二烯合酶(taxadiene synthase, TS) 是紫杉醇合成途径中第一个关键酶，它催化GGPP环化生产紫杉二烯母核[44]。目前大肠杆菌、酿酒酵母、烟草细胞都已经被成功开发为生产紫杉烯的底盘细胞[45-46]。随后，经过紫杉烯-5α-羟化酶(CYP725A4) 的作用生成少量紫杉二烯-5α-醇及多种副产物[47-48]。在发酵产物中仅10%的紫杉二烯被转化成为目的产物紫杉二烯-5α-醇，即使利用通过开发表达紫杉二烯的大肠杆菌和表达P450基因的酿酒酵母双系统共培养系统以及酵母生产体系的优化后，羟基化产物产量也都只有毫克级[46, 49]。其生物合成途径研究历经几十载，但依然进展缓慢。红豆杉超大的基因组和紫杉醇复杂的代谢路线是其途径解析的主要限制因素。2021年，天津工业生物所与西北工业大学等单位合作完成了喜马拉雅红豆杉(Taxus wallichiana) 超10 Gb的染色体水平的全基因组测序，并通过复杂基因组组装与分析，解析了红豆杉中生物合成紫杉醇的关键基因簇。通过对紫杉醇合成途径的起源与进化机制进行研究，发现红豆杉几乎没有经历过明显的全基因组倍增事件，而是发生了大量的基因串联重复事件。与紫杉醇合成密切相关的细胞色素P450酶家族与酰基转移酶家族，通过串联复制都产生了超过50份基因拷贝。随着家族冗余基因的功能分化，红豆杉进化出了非常复杂的代谢物合成和转录调控网络，这为红豆杉进化出极其复杂的紫杉醇合成途径提供了遗传基础[50]。与此同时，中国农业科学院农业基因组研究所黄三文与闫建斌团队通过对南方红豆杉(Taxuschinensis var. mairei) 进行了全基因组测序，成功组装了染色体级别的高质量参考基因组。该研究系统分析了紫杉醇合成相关基因的基因组定位与协同表达调控，绘制了多个相关基因家族的基因组位置图谱，特别揭示了细胞色素P450家族的基因组分布和调控规律[51]。中国中医科学院中药研究所陈士林团队也报道了云南红豆杉(Taxus yunnanensis) 基于10.7 Gb序列组装成12条染色体的高质量基因组，同样也发现了紫杉醇合成途径中的羟化酶基因家族呈现出显著的扩张趋势[52]。红豆杉复杂基因组的成功组装和遗传学分析的突破将进一步推动紫杉醇合成途径的解析及其微生物异源合成的进步。
2 黄酮类化合物微生物重组合成黄酮类化合物是一类广泛存在于植物中的重要次生代谢产物，有抗菌、抗炎、抗癌、抗病毒等多种生理活性，在人类健康与医疗领域具有广阔的应用前景[53-55]。黄酮类的生物合成途径已经比较清晰：首先苯丙氨酸经过苯丙氨酸裂解酶(phenylalanine lyase, PAL) 催化生成肉桂酸；肉桂酸经过肉桂酸4-羟化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase, C4H) 的催化生成对-香豆酸，对-香豆酸也可以由酪氨酸直接脱氨基生成；然后，在对-香豆酸辅酶A连接酶(p-coumaroyl-CoA ligase, 4CL) 的作用下，将肉桂酸或香豆酸转化为相应的辅酶A酯；在查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS) 的作用下，辅酶A酯与丙二酰辅酶A以1:3的比例缩合生成查尔酮，查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI) 催化查尔酮异构化生成柚皮素或松属素等黄酮母核[56-57]；这些母核可进一步修饰为各式各样的黄酮结构[58]。近年来，随着微生物代谢工程与合成生物学研究的不断深入，构建微生物底盘合成黄酮类化合物的生产方式可以提供一种高效低廉的替代方案。目前，多种模式微生物包括大肠杆菌、酵母菌、链霉菌、谷氨酸棒杆菌等正逐渐被应用于黄酮类化合物的生物合成[58]。为了优化工业化生产黄酮的微生物细胞工厂，研究人员进行了多层次的尝试，包括关键酶挖掘、改造；增加前体物质如苯丙氨酸、丙二酰辅酶A的供应；动态调控；微生物共培养技术开发；生物合成的底盘细胞范围扩展；开发高通量筛选与动态调节检测技术等[56-57, 59-61]。但是，目前大多数黄酮类化合物的微生物发酵产量保持在毫克级别[59]。与此同时，异源基因与工程菌的适配性、合成过程中产物得率、关键酶活性提升、中间代谢产物毒性、发酵生产工艺的优化等仍然是微生物生产黄酮类化合物亟待解决的关键问题[59-61]。天津工业生物所团队也在灯盏乙素、虎杖苷及根皮素等黄酮类化合物微生物重组合成方面取得了一些进展(图 3)。
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| 图 3 黄酮类化合物微生物重组合成 Fig. 3 Microbial synthesis of flavonoids. |
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灯盏乙素是菊科植物灯盏花的主要活性成分，作为治疗心脑血管疾病的特效药物已被制成各种剂型应用于临床。灯盏乙素主要结构特征是6位的羟基化和7位的糖基化修饰。2018年天津工业生物所研究人员首先根据灯盏花基因组和转录组的测序数据对灯盏花基因进行了重注释，通过近缘物种代谢物分析和P450基因的家族进化及表达分析，获取在灯盏花中高表达的、菊科植物特有的P450酶，并通过构建穿梭质粒表达载体进行高通量筛选，筛选出可以将芹菜素转化成野黄芩素的黄酮6-羟化酶。研究团队开发了基于Golden gate组装和酿酒酵母本身高效的同源重组相结合的M2S的构建策略，随后在产芹菜素底盘菌中导入灯盏花来源的黄酮6-羟化酶、P450还原酶、黄酮7-糖基转移酶以及UDP-葡萄糖脱氢酶等基因，成功构建了可以产灯盏乙素的酿酒酵母工程菌株，从而实现灯盏乙素的从头合成。该研究不仅为灯盏乙素提供了新的来源，而且为天然产物代谢工程研究提供了一个整合基因组学和合成生物学的研究范例[62]。
近年来，非模式菌株解脂耶氏酵母由于其广泛的底物谱、前体物质充足、良好的耐受性、无Crabtree效应，脱颖而出成为一个有吸引力的宿主。近期，天津工业生物所团队以敲除KU70、并且基因组中已经整合Cas9蛋白的解脂耶氏酵母W29作为出发菌株，通过对灯盏乙素合成途径的构建及模块化优化、关键基因进行组合筛选、不同物种来源的同工酶筛选降低副产物灯盏甲素的比例、代谢工程改造以及发酵优化，从而实现灯盏乙素在解脂耶氏酵母中的高效合成，产量是酿酒酵母中报道的3倍，并且灯盏乙素的生产比例从36.9%提升到80.0%以上[63]。
2.2 虎杖苷虎杖苷是传统中草药虎杖的主要活性成分之一，具有抗癌、抗氧化、抗休克、抗炎等药理活性，虎杖苷是白藜芦醇的3位糖基化产物，相比白藜芦醇具有更好的结构稳定性和生物活性。2021年天津工业生物所团队通过对虎杖植株不同组织进行代谢物分析、转录组测序和生物信息学分析，获得9个在虎杖根中高表达的糖基转移酶候选序列。将9个糖基转移酶候选基因在过表达UDP-葡萄糖供给模块的底盘菌株进行功能验证，获得了催化白藜芦醇生成虎杖苷的目标基因。研究团队将Gibson组装与M2S基因整合技术相结合应用于酿酒酵母底盘构建大大提升了底盘构建效率，实现了虎杖苷的微生物重组合成，通过代谢工程改造以及分批补料发酵优化进一步提高虎杖苷的产量，达到545 mg/L[64]。
2.3 根皮素根皮素是一种天然皮肤美白剂，然而植物中根皮素生物合成途径较长，因此目前已报道的利用天然途径合成根皮素的细胞工厂产量都很低。Jiang等在酵母中构建了高效的两步法合成根皮素的人工途径。在研究过程中，发现1/3的发酵原料都转化成了副产物，导致原料转化率较低。而副产物产生的主要原因是关键催化酶的活性不足和主要前体供给不足。为此，天津工业生物所团队从14种高产黄酮类化合物的传统植物中筛选获得了高活性的关键酶查尔酮合成酶CHS；然后又通过两种策略提高了根皮素合成核心前体丙二酰-辅酶A的产量，一是通过代谢途径优化增强了细胞内源性的丙二酰-辅酶A的生物合成效率；另一种策略是利用豆科根瘤菌中丙二酸-辅酶A转运途径将外源性的丙二酸转运到胞内，合成补充丙二酰-辅酶A。最终，研究者通过对发酵过程优化，使得根皮素产量达到619.5 mg/L。这是目前报道的最高产量的14倍，具有很高的工业化生产潜力[65]。
2.4 其他黄酮类及多酚化合物此外，通过对不同来源的黄酮醇合酶的筛选实现了山奈酚在酿酒酵母的从头合成[66]。研究人员还通过转录组测序获得了唇形科植物半枝莲来源的黄酮6-羟化酶、黄酮8-羟化酶、黄酮8-O-甲基转移酶、黄酮7-O-甲基转移酶等关键催化元件，进而完成黄芩素、汉黄芩素等活性化合物的人工生物合成[67]。研究团队通过构建产支链辅酶A大肠杆菌底盘，以及引入来自啤酒花(Humulus lupulus) 的苯丙酮合酶(valerophenone synthase, HlVPS)、来自草莓(Fragaria vesca) 的查尔酮合酶FvCHS2-1和来自贯叶连翘(Hypericum perforatum) 的查尔酮合酶HpCHS，实现了啤酒花活性成分忽布酮和蛇麻酮中间体异戊酰间苯三酚的微生物合成[68-69]。
3 苯丙素类化合物微生物重组合成苯丙素，狭义上讲，是一类含有一个或几个C6–C3单元的天然化合物，在植物中经由莽草酸通路后修饰合成(图 4)。近几年国内外在苯丙素类化合物重组合成方面也取得了很多新的进展。从含一个C6–C3单元的苯丙酸、苯丙醇类如咖啡酸[70]、香豆酸[71]、松柏醇[72]等，到含两个C6–C3单元的丹参素[73]、绿原酸[74]、迷迭香酸[75]，以及结构更为复杂的鬼臼毒素类化合物[76]，都已经实现了重组合成。天津工业生物所团队也在天麻素、红景天苷等苯丙素类化合物的微生物重组合成方面取得了系列进展(图 4)。
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| 图 4 苯丙素类化合物微生物重组合成 Fig. 4 Microbial synthesis of phenylpropanoids. |
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天麻素是我国名贵中药材天麻的主要活性成分，临床上广泛应用于神经衰弱、眩晕、头痛及癫痫的辅助治疗。天麻为我国34种名贵中药之一，作为Ⅱ级保护植物被列入中国国家重点保护野生植物名录中。天麻素的制备主要有植物提取及化学合成。天麻野生资源珍稀，功效成分含量低(约为0.4%)，而常用的提取工艺程序复杂、产率低，导致植物提取天麻素价格高昂。已报道的化学合成方法大都存在产率低、成本较高和污染严重等缺点。植物中天麻素的生物合成通路至今还未解析清楚。2016年天津工业生物所团队以大肠杆菌莽草酸通路的分支酸为前体，通过在大肠杆菌中引入来源于诺卡氏菌的羧酸还原酶(carboxylic acid reductase, CAR) 及枯草芽孢杆菌的磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(phosphopantetheinyl transferase, Sfp)，并利用大肠杆菌内源的醇脱氢酶(alcoholdehydrogenases, ADHs) 等，构建了天麻素苷元对羟基苄醇的从头合成通路，然后引入植物红景天来源的糖基转移酶UGT73B6，并对其进行了定向进化改造提高其催化专一性，创建了天麻素大肠杆菌合成通路，摇瓶发酵产量达545 mg/L[77]。通过进一步调控莽草酸通路、UDP-葡萄糖通路、NADPH还原力供给，对糖基转移酶进行突变和筛选，优化发酵条件，显著提高了天麻素产量。目前，以葡萄糖为原料的天麻素生产成本预计在500元/kg，低于植物提取成本的1/200，化学合成成本的1/2。
2020年该团队在酿酒酵母中实现天麻素的从头合成[78]。首先鉴定了一个在酿酒酵母中能实现糖基化对羟基苄醇合成天麻素的糖基转移酶AsUGT。通过在酿酒酵母中过表达来自诺卡氏菌的羧酸还原酶CAR、谷氨酸棒杆菌中的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶PPTcg-1、大肠杆菌的分支酸丙酮酸裂解酶UbiC和酿酒酵母ARO4的突变体蛋白ARO4K229L，实现了天麻素在酿酒酵母中的从头合成。进而通过在基因组rDNA和δ-位点DNA进行天麻素合成途径基因及多个前体合成途径基因的多拷贝整合，提高了天麻素产量，在简单培养基的摇瓶发酵培养中，天麻素产量达2.1 g/L，相对于起始菌株提高了175倍。
3.2 红景天苷红景天苷是我国传统藏药红景天主要活性成分之一，具有抗缺氧、抗疲劳等多种生物活性。红景天苷目前主要来源于植物提取，但红景天野生植物资源匮乏，红景天苷含量低，提取工艺复杂，难以获得大量高纯单体化合物，大大限制了其研究和应用。2014年天津工业生物所团队利用莽草酸通路后修饰，通过整合来自酿酒酵母、大肠杆菌和植物红景天的基因，设计创建人工合成通路实现大肠杆菌从头合成红景天苷[79]。通过糖基转移酶的筛选和定向进化改造结合代谢调控等工作，获得一个高产红景天苷的工程菌。经过进一步的发酵条件优化，目前大肠杆菌生产红景天产率为10 g/(d·L)，成本仅为植物提取的1/40，具备工业应用潜力。2018年该研究团队报道了酿酒酵母从头合成红景天苷，通过表达欧芹来源的芳香醛合酶PcAAS，将植物中酪醇合成通路引入酿酒酵母，提高了酿酒酵母工程菌生产酪醇的能力，并对不同来源的糖基转移酶UGTs进行了优选，实现了酿酒酵母从头合成红景天苷，通过解除反馈抑制、增强酪氨酸合成途径代谢流、染色体整合表达，5 L发酵罐红景天苷产量达732.5 mg/L[80]。2018年来自美国麻省理工学院的Weng团队解析了植物红景天中的红景天苷合成通路，并实现了酿酒酵母异源合成红景天苷[81]。2016年国内外科学家陆续报道了大肠杆菌和酿酒酵母合成红景天苷，在代谢调控、混菌培养等方面取得了重要的进展[82-86]。
3.3 络塞维类化合物络塞维是玫瑰红景天特征活性成分。络塞(Rosin) 及其衍生物络塞维(Rosavin) 和络塞琳(Rosarin)，这3种肉桂醇糖苷化合物统称为络塞维复合物，是玫瑰红景天的特有成分。其中络塞维是主要活性成分，也是常用来评价玫瑰红景天提取物质量的重要标志物，在玫瑰红景天提取物中，络塞维复合物含量要求不低于3%。络塞维具有多种有益的药理作用，如益智、抗癌、免疫调节、抗抑郁、抗辐射等。但是玫瑰红景天资源珍稀，大大限制了络塞维的药理机制研究与应用。全球市场对玫瑰红景天提取物的需求不断增高，价格逐年攀升，提取物原料价格已达1 000元/kg左右(络塞维含量3%)，且已经供不应求[87]。2006年，Patov等报道了络塞维的化学合成[88]。但是化学合成步骤较多，产率低成本高，环境污染严重。络塞维的生物合成机制至今还未解析。2017年研究人员通过引入植物、微生物来源的苯丙氨酸氨解酶、肉桂酰辅酶A连接酶、肉桂酰辅酶A还原酶，并利用大肠杆菌内源的醇脱氢酶或酮醛还原酶，在大肠杆菌中构建了一条肉桂醇合成通路。利用糖基转移酶的底物宽泛性特点，将拟南芥来源的AtUGT73C5引入上述产肉桂醇的大肠杆菌中，实现了络塞的合成[89]。2019年，该团队通过引入长春花来源的糖链延伸葡萄糖基转移酶CaUGT3，在大肠杆菌工程菌中实现了7种络塞维类化合物的从头合成，包括肉桂醇二葡萄糖苷(络塞维B) 等6种非天然化合物[90]。2022年，该团队通过理性设计将1, 6-葡萄糖基转移酶CaUGT3改造成以UDP-木糖为首选供体底物的新型糖基转移酶CaUGT3T145V/N375Q，继而在大肠杆菌中创建了UDP-木糖从头合成通路，将改造的糖基转移酶和UDP-木糖以及络塞生物合成途径组装到苯丙氨酸高产大肠杆菌菌株中，实现了天然稀少络塞维类化合物络塞维E (Rosavin E) 的从头合成[91]。
3.4 迷迭香酸类化合物迷迭香酸最早是从迷迭香中分离得到的一种水溶性天然酚酸类化合物，在唇形科、紫草科、葫芦科和伞形科等植物中分布较为广泛，尤以唇形科和紫草科中含量最高。迷迭香酸具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等活性，在制药、食品、保健品、化妆品等领域具有重要价值。迷迭香酸目前多采用提取分离技术从植物中获取，但是提取方法较烦琐、得率低，且纯度不高，难以满足市场需求。国内外研究团队报道了利用植物悬浮细胞培养及微生物重组合成来生产迷迭香酸[92-93]。2016年研究人员通过引入来自拟南芥的香豆酰辅酶A连接酶At4CL、大肠杆菌的4-羟基苯基乳酸-3-羟化酶(4-hydroxyphenylacetate 3-monooxygenase，HpaBC)、来自乳杆菌的乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase, LDH) 以及来自彩叶草的迷迭香酸合酶(rosmarinic acid synthase, RAS) CbRAS，通过在培养基中添加咖啡酸，实现了大肠杆菌发酵生产迷迭香酸，产量达130 mg/L，同时发现该重组菌株能合成55 mg/L的迷迭香酸类似物咖啡酰苯基乳酸[94]。此外，该团队还报道了利用大肠杆菌生物转化合成迷迭香酸类似物，过表达At4CL和CbRAS，并分别添加不同的At4CL的底物包括咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、4-羟基苯丙酸和3, 4-二羟基苯丙酸，以及CbRAS的底物苯基乳酸、4-羟基苯基乳酸、3, 4-二羟基苯基乳酸、扁桃酸和酪醇，检测到包括迷迭香酸在内的共21个结构类似物的生成[95]，为微生物合成新活性成分提供了参考。2019年美国MIT研究团队通过多组学分析结合体内体外基因功能验证解析了植物Phacelia campanularia中的迷迭香酸生物合成通路[96]。2020年Babaei等在酿酒酵母中表达植物迷迭香酸合成途径，并通过正交设计优化基因表达强度，利用葡萄糖合成了5.93 mg/L迷迭香酸[75]。
3.5 复杂苯乙醇苷类化合物合成通路解析植物来源的苯乙醇苷(phenylethanoid glycosides, PhGs) 类天然产物是一类重要的芳香族化合物，具有广泛的药理活性，苯乙醇苷类化合物以红景天苷为母核，中心葡萄糖基上常连有苯丙烯酸或各种糖基(包括五碳糖、六碳糖)。目前至少有572种苯乙醇苷类化合物从不同植物中分离并鉴定，仅有红景天苷的生物合成途径被解析，对复杂PhGs的合成途径知之甚少，但根据其结构特点推测这类化合物具有类似的生物合成过程，以松果菊苷为例，其合成单元包括莽草酸起源的苷元羟基酪醇和酰基辅酶A，2个UDP-葡萄糖，1个UDP-鼠李糖，在糖基转移酶和酰基转移酶BAHD的作用下组装成松果菊苷。粗壮女贞(Ligustrum robustum) 为木犀科女贞属植物，从中已分离毛蕊花糖苷、松果菊苷、紫茎女贞苷A、紫茎女贞苷B等20多种PhGs，部分化合物的最高含量达干重10%以上，且粗壮女贞在不同生长时期，叶片中PhGs组成成分会发生改变。研究团队以PhGs含量高种类多的L. robustum为研究对象，使用转录组分析、体外酶活验证的方法，解析植物主要累积PhGs的生物合成途径，鉴定了参与复杂苯乙醇苷类化合物紫茎女贞苷B生物合成的3个糖基转移酶：其中葡萄糖基转移酶UGT85AF8催化酪醇合成红景天苷；鼠李糖基转移酶UGT79G7催化桂叶苷A生成桂叶苷B；鼠李糖基转移酶UGT79A19催化桂叶苷B生成紫茎女贞苷B。此外，在多种产PhGs的植物(包括地黄、油橄榄、芝麻、肉苁蓉) 中发现了UGT79G7同源基因(一致性约80%)，经体外实验验证均具有相同催化功能，表明了UGT79G7负责的糖基化反应在植物PhGs合成过程中发挥重要作用。UGT79G7、UGT79A19等糖基转移酶的功能鉴定不仅为PhGs生物合成解析提供了参考，而且为PhGs微生物重组合成提供了功能元件[97]。
4 生物碱类化合物微生物重组合成生物碱是一类活性较强的含氮有机化合物，在中药材中广泛存在，生物碱的化学结构复杂多样，用于医药领域已经有上千年的历史。天然抗癌药物喜树碱、长春新碱及镇痛药吗啡都属于生物碱。近几年，随着生物碱类天然产物生物合成途径的解析，微生物重组合成生物碱类研究也取得了一定的进展。最近，含有7个环的咔唑类生物碱马钱子碱的生物合成通路得到解析[98]。2015年美国斯坦福大学的科学家将20多个来自细菌、植物、动物以及酵母本身的功能基因导入酿酒酵母中，实现了阿片类生物碱的从头生物合成[99]。2020年该团队又实现了托品烷生物碱莨菪碱的微生物重组合成[9]。国内科学家也在生物碱合成机制解析及重组合成方面取得了一些进展。西南大学等研究团队于2018年和2020年鉴定了托品烷生物碱关键中间体littorine利托林生物合成途径中的3个酶，苯丙酮酸还原酶(phenylpyruvic acid reductase, PPAR)、苯基乳酸糖基转移酶UGT1和利托林合酶(littorine synthase, LS)[100-101]。2021年中国科学院昆明植物研究所团队与西南大学团队合作，发现并鉴定了莨菪碱生物合成途径中催化莨菪醛生成莨菪碱的关键酶莨菪醛脱氢酶，标志着以莨菪碱为代表的药用托品烷类化合物的生物合成途径得以完整解析，为基于合成生物学的莨菪碱药物的异源生产奠定了基础[102]。川芎嗪是从广泛使用的中药川芎中提取的生物活性成分，是一类吡嗪生物碱，天津工业生物所团队在川芎嗪的微生物重组合成过程中，通过对甲醛缩合酶的定向进化、前14个密码子的优化以及引入重叠基因，将川芎嗪关键前体乙偶姻合成产量提高了40倍，通过进一步优化反应条件使得川芎嗪产量达到94 g/L[103]。
5 P450和糖基转移酶数据库建设植物细胞色素P450酶在植物天然产物多样性和功能修饰方面发挥着重要的作用[104]。已有多达1 000 000条植物P450酶序列被发现，861个植物P450酶得以鉴定功能(https://erda.Dk/public/vgrid/PlantP450/table.html)，这些P450酶主要来源于53个P450酶家族。其序列与功能相比，植物P450酶的三级结构研究更加稀少，但是目前只有7个植物P450酶的晶体结构被报道(CYP73A33、CYP74A1、CYP74A2、CYP76AH1、CYP90B1、CYP97A3、CYP97C1)，这严重地限制了P450酶的功能鉴定和修饰改造。为了解决这个问题，天津工业生物所团队开发了一种基于AlphaFold同源建模和分子动力学结构优化的方法用于构建高分辨率的P450三维结构(plant cytochrome P450 comparative modelling, PCPCM)；同时为了辅助研究人员分析P450酶底物结合及催化机理，研究人员也开发了P450酶自动化对接程序(plant cytochrome P450 ligand docking, PCPLD)，这极大地方便了研究人员对P450酶复合体作用模式的分析。此外，基于PCPCM和PCPLD，研究人员也构建了一套P450酶挖掘和筛选流程，这大大加快了天然产物合成途径中相关P450酶的挖掘和相关功能分析研究[105]。
UDP-糖基转移酶UGTs介导的糖基化是植物中最重要的后修饰之一。近些年来，许多生物活性分子合成途径中的关键UGTs成功鉴定，植物UGTs的研究获得科学家们广泛的关注。目前，已有数千种植物进行了基因组或转录组测序，研究团队通过整合不同来源的数据，开发了一个从植物基因组直接注释UGTs的方法(GMind: https://github.com/JiangLab2020/GMind)。基于该方法，构建了一个系统全面的植物UGT数据库(pUGTdb) (https://pugtdb.biodesign.ac.cn/)。应用该数据库平台首次成功挖掘出虎杖苷合成途径中的关键UGT基因PcR3GAT[64]。本研究不仅开发了针对植物UGTs的基因注释、功能注释及同源蛋白搜索的工具，而且还提供了一个系统全面的植物UGT数据库平台，极大地促进了关于植物UGT的基因挖掘、功能鉴定及重要植物天然产物的生物合成研究。
6 总结与展望植物天然产物重组合成是合成生物学的重点研究方向之一，其以工程化的设计理念，对生物体进行有目标的设计与改造，有望为人类面临的资源、环境等领域的重大挑战提供新的解决方案[106]。目前天津工业生物所已搭建起涵盖基因元件挖掘、酶设计改造、合成途径优化、发酵放大与分离纯化等的植物天然产物重组合成全链条研发平台，包括药物、营养品及香精香料等若干重要天然产物的微生物重组合成已取得突破，有望实现工业化生产。据统计，已知的植物天然产物超过20万种，我国的药用植物在1万种以上，随着人工智能、自动化及高通量等技术的不断进步及其在合成生物学领域的应用，植物天然产物的重组合成将迎来重要的机遇。
同时，植物天然产物的重组合成技术还处在发展阶段，有许多问题需要解决。首先，大多数植物天然产物生物合成途径还未解析，大大制约了其微生物重组合成。随着测序技术的飞速发展，越来越多的“本草植物”基因组得到解析，基因组、转录组数据库日渐庞大。不同于微生物，大多数植物天然产物合成途径的基因在基因组上并非成簇存在。生物合成通路解析与功能元件挖掘数据量及工作量相对庞杂，如何实现智能化挖掘与高通量筛选成为迫切需要解决的问题。尽管已经有研究人员将机器学习应用于植物基因功能预测[107]，但受限于植物天然产物合成功能元件数据库尚不完善、关键功能元件催化专一性难以预测等因素，成功案例还十分有限。借鉴化学逆合成思想，采用生物逆合成算法的生物合成途径及酶的预测及设计工具也在不断发展中[108-110]。基于组学数据，开发可靠性高的机器学习工具用于功能元件挖掘及生物合成通路设计，并结合高通量自动化平台进行筛选鉴定，有望突破未知生物合成通路的制约。
其次，如何更好地平衡异源合成途径与微生物自身生长代谢之间的关系，也是植物天然产物微生物重组合成必须解决的问题。一方面可以利用不断发展的基因编辑与代谢调控工具，实现微生物代谢流的智能调控，平衡细胞生长与产物合成，提高微生物合成植物天然产物效率。另一方面，需要考虑目标产物的存储与运输，通过区室化、外排通道等手段缓解产物合成对微生物底盘的影响。另外，针对某些植物天然产物的特性，考虑酶的亚细胞定位和不同细胞器酶的协同催化等因素，基于植物底盘的天然产物重组合成也成为新的方案之一[111]。
最后，近年来，越来越多的重要植物天然产物实现了重组合成，具有广阔的应用前景。通过合成生物学手段实现某些珍稀中药活性成分的重组合成，得到大量高纯单体，将推进其药效和药理功能研究，为后续新药研发提供重要候选化合物，为中药现代化提供有力支撑。大量的关键药物中间体的获得，将为通过化学修饰合成多样的天然产物衍生物以及新药的研发奠定基础。但是，对于某些功能明确的重要植物天然产物，其基因重组合成产物市场准入方面还存在限制。目前我国对转基因产品的界定仍然比较模糊，法规与制度建设滞后于科技发展[112]。也希望我国合理借鉴其他国家的监管经验，推进相关法律法规出台，明确各类产品的申报及审批流程，建立生物活性、安全性评价以及市场准入标准，推动微生物重组合成植物天然产物的产业应用。
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