生物工程学报  2022, Vol. 38 Issue (11): 4311-4328 |
引用本文
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随着生活水平的不断提高，我国对肉类的需求越来越多，猪肉年产自1980年的1 205万t增长到了2021年的8 887万t，而且2021年我国累计肉类进口量达到938万t。肉类需求的增加推动了畜禽养殖产业的快速发展，从而导致玉米、大豆等饲用饲料用粮的需求居高不下。2020年和2021年我国分别进口大豆10 032.7万t和9 651万t，80%用于了畜禽业饲料产品。弥补大豆的进口需额外增加2.4亿hm2耕地，这样会导致我国其他粮食的短缺和温室气体的持续排放。同时，受到社会经济发展水平不平衡、人口老龄化和不健康饮食方式等影响，我们仍然面临着营养缺乏、部分人群中营养相关疾病高发等问题。在过去的40年里，全球超重和肥胖的患病率几乎增加了2倍，是21世纪最严重的未得到解决的公共卫生挑战之一[1-2]。因此，日益增长的人口数量对粮食需求的增加和社会低碳发展的需求呼唤一种可持续的食物供给模式。既能满足消费者口感需求又不额外增加热量的功能性食品，例如低卡路里与低升糖指数的功能糖、功能性蛋白等，受到了广泛的关注。
科学研究发现过量摄入蔗糖和果葡糖浆，会加重肝脏负担，引发肥胖、糖尿病、中风、心血管病、老年痴呆等疾病风险[3-4]，为此，全球多个国家发起“减糖”倡议，征收糖税。为满足人们对食品甜味及益生等功能的需求，功能性“代糖”产品在人们日常生活中扮演越来越重要的角色。依赖天然提取或者化学催化的低热量糖与糖醇制备方法，存在效率低、成本高、难以满足市场需求等问题。随着工业生物技术的发展，近年来，通过微生物发酵和生物转化技术制备功能糖备受关注，并在很多领域取得较好的研究进展，部分产品已经实现产业化应用。
微生物蛋白及其蛋白肉具有高蛋白含量、高消化吸收率、富含膳食纤维与微量营养素、较低的饱和脂肪与胆固醇含量等优点，具有降低肥胖风险、保持骨骼肌量等优势。这是一种全新的、颠覆性的、高效的、无污染的肉类生产方式，可以不通过动物养殖来生产肉类，既节省了大量土地、粮食和水资源，又可以减少温室气体排放，是实现“双碳”目标的重要途径，也是一种绿色可持续的肉类供应新模式。
随着基因编辑、代谢工程等技术的发展，合成生物技术进入了快速发展的阶段。一方面，合成生物技术能够利用微生物生产大宗的食品原料，例如蛋白质、脂肪等物质，可以用于生产人造肉、人工奶和人工脂肪等产品，重塑传统的食物生产模式，实现食物的绿色可持续供给；另一方面，合成生物技术可以生产出人体不能合成的功能性物质，包括阿洛酮糖等功能糖。因此合成生物技术的出现，对于人类食品的低碳、可持续供应、人类营养需求等具有重要的作用。本文将追踪未来食品功能糖和微生物蛋白及其人造肉关键辅配料的菌种构建、工业环境下菌种测试与过程优化和衍生产品的开发等研究的最新进展，展望未来发展趋势，为微生物制造未来食品的产业发展提供支撑。
1 功能糖生物制造技术功能糖是一类具有不能被人体肠胃消化吸收且具有甜味或促进益生菌生长等特殊功效的碳水化合物，主要包括功能性稀少糖、功能性寡糖、功能性糖醇、功能性淀粉等。这些糖可以作为功能性食品添加剂或蔗糖的替代原料，满足糖尿病、肥胖等特殊人群的需求。目前其生物合成技术主要有酶法催化转化技术和微生物发酵法技术(图 1)。随着基因组测序技术、生物信息技术、蛋白质工程技术的发展，越来越多的酶催化剂和细胞工厂被开发出来，使得功能糖的制造技术近年来取得了很大进展，基于此，本文综述了该部分相关新技术和新成果。
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| 图 1 功能糖的生物合成技术路线 Fig. 1 Biosynthesis technology route of functional sugars. |
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稀少糖作为自然界中含量非常少的一类单糖及其衍生物，甜度为蔗糖的70%−90%，具有与蔗糖相似的加工性能，可作为新一代理想的蔗糖替代品[5]。以阿洛酮糖、塔格糖为代表的稀少糖已被很多国家批准为食品原料。笔者团队长期开展生物转化制备稀少糖研究，采用数据库挖掘技术，获得了L-阿拉伯糖异构酶[6]、D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-allulose-3-epimerase, DAE) 等酶催化元件，其中来源于瘤胃菌(Ruminococcus sp.) 的DAE序列[7]具有自主知识产权，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) 为底盘菌株，开发了食品安全的糖酶表达系统，采用同工酶串联组合表达策略，实现多个不同催化特性DAE在同一宿主菌株中的高效集成表达[8]，DAE酶活性超过100 U/mL；基于DAE开展了蔗糖糖蜜、菊粉、枣汁等资源的高附加值利用转化，获得了阿果糖浆等多个富含阿洛酮糖的产品，提升了产品的应用价值，相关技术转化为企业带来良好经济效益。
尽管以单糖底物的转化策略在阿洛酮糖等稀少糖制备方面应用广泛，但是该方法基于异构转化反应，存在热力学平衡问题，产物往往是混合物，从而增加了分离成本和设备投资。近年来，研究发现构建基于磷酸化和去磷酸化反应的热力学驱动路线，为稀少糖的制备提供了新的研究策略[9]。该合成策略中磷酸酶催化的脱磷酸反应步骤是实现热力学驱动的关键，然而自然界中的磷酸酶往往具有宽泛的特异性，导致路线中目标产物转化率偏低，围绕磷酸酶底物特异性这一难题，笔者团队基于蛋白结构的酶分子设计与改造技术，成功改变磷酸酶底物宽泛性，使其专一性地聚焦到特定底物，从而获得了对甘露糖6-磷酸、果糖6-磷酸等特异性强的磷酸酶突变体，底物特异性偏转超过12 000倍[10]；基于磷酸酶元件构建了热力学驱动的多酶级联催化反应体系，实现转化淀粉、蔗糖等廉价原料制备目标产品，转化率达到93%–96%，打破了单糖转化中的反应平衡问题，也为高纯度果糖和甘露糖的生物制备提供了基础。除此之外，中国科学院天津工业生物技术研究所(以下简称“天津工业生物所”) 游淳团队通过构建热力学驱动反应，实现转化淀粉、蔗糖等廉价原料制备阿洛酮糖[11]、肌醇[12]等产品，均获得较高转化率。
单糖化合物往往具有多个手性中心，如何快速获得某一特定构象的化合物，制备结构多样性的单糖组分库，也是需要解决的问题，为了应对这一挑战，笔者团队建立了基于羟醛缩合反应的稀少糖制备体系，挖掘了不同物种来源的醛缩酶元件，实现转化合成C4–C7多种单糖、脱氧糖、支链酮糖等化合物[13-15]，丰富了稀少糖产物库，为药物筛选及功能评价奠定了良好基础。
1.1.2 功能寡糖及其衍生物功能寡糖是低聚合度的糖类物质，制备方法包括多糖水解、酶促转苷、异构等反应过程，其中多糖水解是主要制备手段[16]。海洋生物质资源如褐藻、红藻等富含多糖，是天然寡糖制备的关键原料。笔者团队从海洋环境中获得一株具有降解褐藻胶能力的微生物[17]，挖掘表征了一个新型耐碱性的双功能褐藻胶裂解酶，对褐藻胶中的多聚甘露糖醛酸(polyM) 和多聚古罗糖醛酸(polyG) 均具有较高水解活性，能够彻底降解褐藻胶，主产物为褐藻二糖、三糖和四糖，并进一步通过蛋白结构域改造，显著提高了该酶的酶活及热稳定性，进一步构建高效分泌表达褐藻胶裂解酶的B. subtilis菌株，吨级发酵液中上清液酶活高达50 000 U/mL以上，在国内外已有报道中位于前列[18-19]。联合南宁汉和生物科技股份有限公司，开发建立多酶组合联用高浓度底物投料技术，实现大型藻多糖快速脱胶降黏，有效破壁促进海藻天然活性成分的释放，定向降解获得聚合度可控的活性寡糖，有效成分提取效率达到95%以上。开发含褐藻寡糖的植物调节剂，具有促生长与抗逆作用，实现“减肥减药”，同时达到作物增产增效作用，具有良好的社会与经济效益。该团队从海洋微生物中挖掘得到新型的琼胶酶AgaA和AgaB，发现AgaA是一种热稳性高的内切型琼胶酶，具有较强降解琼脂多糖生成低聚琼寡糖作用；而AgaB是一种外切型琼胶酶，具有极高的底物特异性，生成产物为聚合度均一的新琼二糖[20]。在此基础上，建立了双酶偶联降解琼脂生产新琼二糖工艺，在60 ℃条件下对高浓度的琼脂底物进行脱胶液化，然后对产物聚合度进行均一化处理，获得新琼二糖的纯度达90%以上，原料转化率接近94%，为绿色、高效制备新琼寡糖提供新策略。
酶促水解方法获得的寡糖组分往往是多个聚合度的混合物，需要复杂的分离纯化工艺。近年，针对功能寡糖合成新方法开发，多个研究团队取得重要进展。Tian等设计了一条功能寡糖合成的技术路线[21]，并在体外构建了多酶级联反应系统，以廉价的蔗糖为原料，实现了肌醇半乳糖苷、棉子糖和水苏糖3种功能寡糖合成；提出分步级联策略，解决了多酶反应系统中酶稳定性差等问题，提高了棉子糖的产量；通过多步级联与循环转化反应，实现了肌醇半乳糖苷、棉子糖和水苏糖的产量分别达到42、129和41 g/L (表 1)，为半乳糖基寡糖的生物制备提供借鉴，打破传统依赖水解获得水苏糖的制备方式。除此之外，游淳研究员团队设计了将廉价底物淀粉和葡萄糖一步转化为昆布二糖的体外多酶催化系统[9, 22]；该体系包括α-葡聚糖磷酸化酶(α-glucan phosphorylase, α-GP)、昆布二糖磷酸化酶(laminaribiose phosphorylase, LBP)、异淀粉酶(isoamylase, IA) 和4-葡聚糖转移酶(4-glucanotransferase, 4-GT)，通过反应体系优化，昆布二糖的产率进一步提高至91.9%；进一步实现合成纤维二糖、海藻糖、槐糖等各种功能性二糖，具有较好的应用潜力。
| Process | Substrate | Product | Host strain | Titer (g/L) | References |
| Enzymatic transformation technology | Fructose | Allulose | Corynebacterium glutamicum | 150 | [8] |
| Sucrose | Raffinose/Stachyose | Escherichia coli | 129/41 | [21] | |
| Sucrose | Glycerol glucoside | E. coli | 400 | [25] | |
| Microbial fermentation technology | Glucose | Erythritol | Yarrowia lipolytica | > 200 | [30] |
| Glucose | L-fructose/L-tagatose | C. glutamicum | 20.8/10.3 | [31] | |
| Dihydroxyacetone, formaldehyde | Erythrulose | E. coli | 250 | [32] | |
| Glucose | Branched ketose | C. glutamicum | 36.3 | [33] | |
| Glucose | N-acetylglucosamine | C. glutamicum | 117.0 | [34] | |
| Glucose | Sialic acid | Bacillus subtilis | 30.1 | [35] | |
| Glucose | 2′-FL | E. coli | 79.2 | [37] | |
| Sucrose | 2′-FL | B. subtilis | 88.3 | [38] |
功能糖苷为一个或者数个单糖组分与其他含羟基分子形成的聚合物，包括萜类皂苷、黄酮皂苷、多元醇功能糖苷等化合物。典型代表甘油葡萄糖苷是非洲“不死草”的关键活性物质，具有保湿、抗衰老、促进细胞增殖等功效，在食品和化妆品领域具有较高应用价值。Nidetzky团队在生物转化法合成甘油葡萄糖苷方面开展大量研究工作，成功实现采用蔗糖磷酸化酶催化蔗糖和甘油合成甘油葡萄糖苷[23-24]。然而，由于蔗糖磷酸化酶区域选择性差，导致采用该路线获得的目标产品大都为α-1-/α-2-甘油葡萄糖苷的混合物，获得单一的α-2-甘油葡萄糖苷产品需要复杂的纯化过程。为解决这一问题，笔者团队采用磷酸化和转苷反应偶联的生物转化策略[25]，构建了“一锅”双酶反应体系，成功实现转化蔗糖和甘油合成了构型单一的α-2-甘油葡萄糖苷产品，进一步优化反应条件，目标产物得率提升至90%以上，产物浓度超过400 g/L (表 1)，为目前报道最高水平，该合成技术具有区域选择性高、产物构型专一及得率高等优势，为甘油葡萄糖苷的高效生物制备提供借鉴。
1.1.3 淀粉合成近年来，功能性淀粉作为膳食纤维在食品加工领域应用潜力越来越大，其中包括直链淀粉和高支化淀粉。淀粉蔗糖酶(amylosucrase, ASase) 的发现与表征为直链淀粉的生物制备提供了可能，该酶以蔗糖为原料，通过果糖和葡萄糖α-1, 2糖苷键断裂所产生的能量完成葡萄糖的重排，从而合成富含α-1, 4糖苷键的直链淀粉。江南大学沐万孟团队在该酶研究方面取得重要进展，但采用该酶合成直链淀粉会产生大量副产物果糖，同时由于ASase同时存在异构和水解活性，导致最终反应体系中会生成部分葡萄糖、松二糖和海藻酮糖[26]。针对直链淀粉合成，Qi等开发了多酶级联催化技术以蔗糖为原料合成直链淀粉[27]，该催化体系包含蔗糖磷酸化酶和葡聚糖磷酸化酶，前者催化蔗糖合成葡萄糖-1-磷酸(glucose-1-phosphate, G1P)，后者则催化G1P转移至寡糖链引物上，实现糖链延伸制备直链淀粉，该路线同样面临诸多挑战，例如副产物果糖生成、寡糖链添加、反应平衡等问题。
酶促淀粉改性制备高支化淀粉也是近年来淀粉加工领域的重要研究方向，其中糖原分支酶是实现天然淀粉支链提升的关键酶，Zhang等挖掘多个GH13和GH57家族糖原分支酶，表征了催化性质，分析其结构与功能特性，实现淀粉分支度从4%提升至14%，大大增加淀粉可溶性和营养价值[28-29]。
1.2 微生物发酵技术长期以来微生物发酵法是获得功能糖的一种重要方式，与生物催化技术相比，微生物发酵技术可利用胞内的氧化还原系统，辅因子调控系统等，合成一些糖醇类、糖胺类、寡糖及多糖类产物。典型的案例是微生物发酵法合成赤藓糖醇，多年来研究人员通过诱变筛选获得了高产赤藓糖醇的解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica) 菌株[30]，产量超过200 g/L (表 1)，糖醇转化率超过0.6 g/g，目前全国采用发酵法合成赤藓糖醇规模已超过40万t。除了赤藓糖醇，很多多糖天然合成菌株也同样被开发应用，例如链球菌(Streptococcus sp.) 作为工业化制备高分子量的透明质酸菌株，已被广泛使用。近年，随着合成生物学、系统生物学等技术的发展，已有很多研究着眼于突破天然微生物菌株合成效率低的瓶颈，创建新型细胞工厂合成更多结构复杂、功能多样的功能糖化合物，其底物代谢利用范围从传统的C6葡萄糖扩展至更为廉价的C1甲醇、C3甘油等原料。
1.2.1 L-稀少糖及支链酮糖自然界中单糖组分大都是D-型糖，L-型糖作为稀少糖具有更为优异的生理功效，传统L-型糖的制备方法依赖于提取或多步单糖转化反应，合成效率低。笔者团队提出采用羟醛缩合方法重构手性中心合成L-型糖的研究思路，考虑到羟醛缩合反应L-型受体醛稀有且不稳定，以C. glutamicum为出发菌，设计创建了以甘油为唯一底物合成L-型稀少糖的新途径，通过优化磷酸二羟丙酮(dihydroxyacetone phosphate, DHAP) 供体合成模块、L-甘油醛受体合成模块，利用具有底物特异性的醛缩酶催化羟醛缩合反应，获得了合成L-型稀少糖谷氨酸棒杆菌工程菌株；进一步结合丙糖磷酸异构酶的调控与发酵条件优化，高效合成了L-果糖(20.8 g/L) 和L-塔格糖(10.3 g/L) 等4种稀少糖[31]。该研究中的合成稀少糖的模块化组装策略，对利用甘油生物合成高附加值化合物具有重要借鉴意义。除此之外，该研究团队在转化C1原料合成L-山梨糖和L-赤藓酮糖等方面取得突破，尤其是建立了全细胞催化合成赤藓酮糖转化工艺路线，底物耐受性达3 mol/L，赤藓酮糖产率达126 g/(L·h) (表 1)，是目前报道的最高水平[32]。
除了L-稀少糖，该团队采用类似的思路还构建微生物细胞工厂成功合成了支链酮糖(dendroketose)，该化合物也属于稀少糖的一种，经化学脱水反应可高效制备4-羟甲基糠醛(4-hydroxymethylfurfural formaldehyde, 4-HMF)，应用于制备重要医药中间体斑蝥素，合成2, 4-二甲基呋喃(2, 4-dimethylfuran, 2, 4-DMF) 以及C9–C15支链烷烃等液体燃料。该团队发现来源于大肠杆菌(Escherichia coli) 的L-鼠李树胶糖-1-磷酸醛缩酶(L-rhamnulose-1-phosphate aldolase) 具有催化酮与酮之间羟醛缩合的功能，随后针对该酶的新功能进行分子动力学模拟和解析，揭示了该酶催化机制；构建了体外多酶级联催化体系，实现转化利用甲醛制备支链酮糖，其转化率达到86%；同时，以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，构建细胞工厂，利用葡萄糖或者甘油合成支链酮糖的产量达到36.3 g/L (表 1)[33]，促进了C1、C3和C6等廉价资源在精细化学品和能源化合物绿色生物制造领域的应用。
1.2.2 N-乙酰葡萄糖胺及唾液酸乙酰氨基葡萄糖(acetylglucosamine, GlcNAc) 已广泛应用于医药、食品、化妆品等行业，微生物发酵法合成N-乙酰葡萄糖胺是近年来通过合成生物学和代谢工程技术构建细胞工厂合成功能糖及其衍生物的一个典型案例。江南大学刘龙团队在该研究方面做了比较系统的研究工作，其细胞工厂构建过程包括合成途径中关键酶基因表达水平时空调控，葡萄糖转运和磷酸化激活，中心碳代谢以及多糖合成途径中代谢通量抑制，副产物合成途径失活，呼吸链调控及微生物形态调控等策略，成功在C. glutamicum中将GlcNAc产量提高至117 g/L (表 1)[34]。在此基础上，该团队还构建了唾液酸细胞工厂，构建了3条合成途径，分别为N-乙酰-D-氨基葡萄糖2-异构酶和葡糖胺-6-磷酸N-乙酰转移酶1 (glucosamine-6-phosphate N-acetyltransferase, Gna1) 组成的AGE途径；Gna1和N-酰基葡糖胺-6-磷酸2-异构酶(N-acyl glucosamine-6-phosphate 2-isomerase, NanE) 组成的NanE途径；以及由UDP-N-乙酰氨基葡萄糖2-表异构酶(UDP-N-acetylglucosamine-2- epimerase, NeuC) 为核心的NeuC途径。进一步比较了上述3条路线的合成效率，并对路线进行了整合，获得了高产菌株，在5 L发酵罐中分批补料发酵，产量达到30.1 g/L (表 1)，是目前使用葡萄糖作为唯一碳源的最高产量[35]。
1.2.3 人乳寡糖人乳寡糖(human milk oligosaccharides, HMO) 是存在于人乳中一类由2−10个单糖组成的寡糖，是人乳中第三大固体成分。HMO作为益生元不会被婴儿胃肠道中的消化酶水解，却可以促进肠道内的有益微生物的增殖，具有维持肠黏膜屏障和抵御病原微生物侵袭等功效。目前已经鉴定的人乳寡糖种类超过200余种，其中含量较高的包括2′-岩藻糖糖基乳糖(2′-fucosyllactose, 2′-FL)、3′-岩藻糖基乳糖、乳糖-N-四糖(lacto-N-tetraose, LNT) 以及乳糖-N-新四糖(lacto-N-neotetraose, LNnT)[36]。近年来，江南大学沐万孟团队围绕发酵法合成上述4种人乳寡糖开展了大量研究。以2′-FL为例，目前，2′-FL的合成改造策略主要围绕在以下方面，增加供体GDP-岩藻糖的合成量，GDP-岩藻糖可以通过两种途径合成，即补救途径和从头合成途径。在补救途径中，使用具有L-岩藻糖激酶和GDP-岩藻糖焦磷酸化酶的双功能酶，实现将岩藻糖转化为GDP-岩藻糖，同时为了维持胞内GDP-岩藻糖较高含量，敲除掉岩藻糖分解代谢途径；相比之下，从头合成途径更具优势，以廉价的葡萄糖为碳源，合成途径涉及5个基因，将胞内积累的果糖-6-磷酸(fructose 6-phosphate, F6P) 转化为GDP-岩藻糖。此外，通过过表达乳糖透过酶基因lacY强化细胞摄入乳糖的能力，敲除内源β-半乳糖苷酶基因lacZ削弱宿主分解乳糖的代谢途径提高乳糖的利用率；进一步表达来源于E. coli的糖外排转运蛋白SetA促进2′-FL向胞外分泌，进一步提高2′-FL的胞外比例，通过代谢调控和优化，该团队成功实现2′-FL生产浓度达到79.2 g/L[37]。除了E. coli，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、C. glutamicum和B. subtilis均有作为底盘被开发合成2′-FL的报道，江南大学刘龙团队以B. subtilis为宿主菌，开发适用于B. subtilis温度敏感性调控元件调控2′-FL合成途径中关键基因表达水平，借助代谢通量限制，显著提升了2′-FL产量，目前产量达到88.3 g/L (表 1)[38]。
1.3 协同生物催化和微生物发酵构建杂合体系生物催化技术和微生物发酵技术在功能糖制备方面各有优势和缺点，如何实现二者优势互补，构建杂合转化体系，制备高附加值化合物也是近年来关注的一个方向。孙媛霞团队结合体外多酶催化和微生物发酵优势，协同体内和体外催化转化体系，设计构建了一条“淀粉-甘露糖-甘露寡糖”生物转化合成的新技术路线[39]。首先，设计了热力学驱动路线，体外实现转化淀粉合成甘露糖，其产量超过75 g/L，转化率可达81%。微生物合成复杂化合物如寡糖和多糖，需要依赖于体内的氧化系统和糖苷转移系统，因此，进一步在C. glutamicum中构建了基于甘露糖原料合成甘露寡糖和甘露糖甘油酸合成路线，通过代谢工程改造提升了合成效率；通过级联组合体外和体内系统，首次实现转化淀粉低成本制备非天然甘露寡糖，同时也为其他功能寡糖的制备提供借鉴。
2 微生物蛋白、辅配料的生物制造及其人造肉技术微生物蛋白肉主要是采用发酵的方法来生产肉的主要原料：蛋白质、色素、风味和胶黏剂等物质，并经过复配和成型等技术生产。天津工业生物所研究团队联合开发了微生物蛋白、呈色、呈味等细胞工厂，并实现了微生物蛋白肉的规模化制造(图 2)。针对以上进展，分类介绍如下。
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| 图 2 微生物蛋白肉的制造路线 Fig. 2 Manufacturing of alternative meat made of microbial protein. |
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针对蛋白需求的日益增长和传统蛋白供给的不足，急需构建一种新的蛋白供给模式以保障肉类食品的营养价值、安全性和可持续性。当前，用于发酵生产微生物蛋白的主要工业菌种包括细菌、藻类、酵母和丝状真菌。常见的细菌包括乙醇梭菌、紫光合细菌和氢氧化细菌，它们可以将二氧化碳等气体转化为蛋白[40-41]。这类蛋白主要用于水产养殖，目前在食品领域应用较少[40]。藻类用于发酵生产微生物蛋白的消费历史悠久，主要培养的种类有7种，其中螺旋藻的生产应用最为成功，是目前生产微藻蛋白的主要菌株。但是由于藻类生长速度慢、密度低等问题，至今主要进行小规模蛋白生产[42-43]。酵母菌生长速度快，细胞密度大，所需生产设备简单，是生产微生物蛋白相对理想的菌株。然而，低细胞壁消化率和高核酸含量在一定程度上制约了酵母发酵蛋白的进一步开发[40]。镰刀菌(Fusarium) 是得到广泛应用的发酵生产微生物蛋白的丝状真菌，其生产的菌丝蛋白相比酵母、细菌等单细胞蛋白更加味美，并且具有类似肉质的组织结构，同时其含有的丰富可食性粗纤维有助于人肠胃消化，是一种能够满足于现代人营养需求的肉类代用品[44]。
威尼斯镰刀菌A3/5 (F. venenatum A3/5) 是从3 000多株真菌中筛选到的可用于发酵生产菌丝蛋白的丝状真菌，其最早由英国ICI和Rank Hovis McDougall (RHM) 合资企业进行商业开发，并于1985年被英国农业、渔业和食品部批准为菌丝蛋白Quorn作为食品出售[45]。Quorn的产品种类十分丰富，包括整切肉类、肉糜类、海鲜类等79种产品，目前已在包括英国、美国、澳大利亚在内的全球18个国家或地区上市[46]。当前，除了老牌的Quorn外，Enough (原3F Bio)、Mycorena、Nature’s Fynd等都在近两年获得了融资，其研发产品迅速成为除了植物肉和细胞培养肉外另一个代替蛋白的绝佳选择[46]。
为了获得具有自主知识产权的丝状真菌菌株，天津工业生物所科研人员从天津市滨海新区小麦地的根际土壤中分离鉴定到一株高蛋白含量的菌株，命名为威尼斯镰刀菌TB01 (F. venenatum TB01)，并对该菌株完成了全基因组测序及序列组装。经过长期积累，目前成功建立了菌丝蛋白连续发酵技术工艺，实现了10批次的连续发酵；基于氧传递系数相似和pH调控技术建立了吨级规模发酵技术工艺，形成了高活力丝状真菌种子制备技术、高产蛋白培养基和发酵条件、高产蛋白连续发酵和菌丝收集技术、丝状真菌规模化放大技术。同时，针对该菌株建立了高效的原生质体转化体系，并挖掘了不同表达强度的内源启动子PFvgpdA、PFvgla及PFvtef[47]。在此基础上，通过筛选高效内源Pol Ⅲ类启动子，并结合AMA1复制子基础的Cas9表达载体来消除Cas9对菌株的毒性，建立可以同时实现双基因编辑的高效CRISPR/Cas9编辑系统[48]。这些体系的建立为后期分析改良该菌株奠定了基础。未来，为了解决微生物蛋白存在的转化效率低、生产速率慢、成本高等问题，将通过转录组、蛋白组和代谢组等组学技术，解析蛋白、多糖和油脂代谢途径与代谢调控机理，挖掘酶功能、底物转化与胞内总蛋白平衡之间的协调机制，阐明微生物碳氮底物协同代谢的机理与调控机制；通过基于高精度代谢网络模型的计算模拟与重构，实现胞内的代谢流和能量流分布精确模拟，挖掘蛋白合成过程中的关键瓶颈代谢物、瓶颈反应；通过CRISPR/Cas9基因编辑技术实现对多个基因表达进行协同精准调控，优化微生物合成物质流和能量流合理分配，提升菌体蛋白的产量、转化率和生产强度，设计构建高效转化碳水化合物的高产蛋白细胞工厂(图 3)。
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| 图 3 微生物蛋白生物制造技术 Fig. 3 Biomanufacturing technology of microbial protein. |
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色香味形是人们评价食品感官质量的重要因素，其中色泽能刺激消费者购买欲。原料肉中的色素蛋白质主要是肌红蛋白(myoglobin, Mb) 和血红蛋白(haemoglobin, Hb)，一般情况下肌红蛋白约占70%–90%[49]。人们很自然地就会想到可以通过添加富含血红素且结构稳定的血红蛋白来模拟真实肉制品的颜色。然而利用化学试剂萃取或酶解法从动物血液及植物组织中获取血红素及血红素蛋白的方法，不仅耗时耗力、污染环境且产物纯度低，无法大规模应用于人造肉制品的生产[50]。为此，国内外已经开展了针对血红素及血红素相关蛋白的生物合成研究。
在早期的研究中，首先合成的是人血红蛋白。Natarajan等利用大肠杆菌成功合成了具有生理功能的人源血红蛋白[51]。Liu等首次在酿酒酵母中通过血红素合成途径的强化来促进重组人血红蛋白的合成，在过表达HEM3获得最高的卟啉水平的基础上，通过平衡α及β珠蛋白基因的表达[52]，获得的重组活性血红蛋白占提取的总可溶性蛋白的4%；在后续敲除HAP1转录因子后，最终合成了占胞内可溶性总蛋白含量7%的人源血红蛋白[53]。除了人源血红蛋白外，美国Impossible Foods公司开发了一种商业巴斯德毕赤酵母菌株，并为其申请了专利。Fraser等[54]将血红素途径相关基因置于甲醇诱导的AOX1启动子的调控下，以供应大量的血红素辅因子，并在毕赤酵母基因组内整合大豆血红蛋白c2基因，通过高密度发酵成功表达了大豆血红蛋白，该成分为Impossible Burger人造肉关键成分之一，目前已进入商品化生产。
2.3 呈味物质含硫氨基酸是在热处理过程中对食品风味影响较大的一类氨基酸，它们单独存在时的热分解产物，除了硫化氢、氨、乙醛、半胱氨酸等物质之外，还会生成噻唑类、噻吩类及许多含硫化合物，它们大多数是挥发性的强烈嗅感物质，许多是熟肉香气重要组分。主要包括L-甲硫氨酸、胱氨酸和半胱氨酸。
目前，甲硫氨酸主要通过化学合成的方法进行生产。随着能源和环境危机的日益严峻，利用环境友好的微生物发酵法合成L-甲硫氨酸的研究越来越受到关注。O-乙酰高丝氨酸(acetyl high serine, OAH) 是L-甲硫氨酸合成的重要前体，能够在乙酰高丝氨酸巯解酶的作用下直接与甲硫醇反应生成L-甲硫氨酸。在该工艺中，通过发酵法合成OAH是制约L-甲硫氨酸生产和降低成本的关键因素之一。天津工业生物所刘君与江会锋两个团队合作，通过结合代谢工程和蛋白质工程的方法，系统地改造大肠杆菌，实现了OAH的高效合成。在研究中，首先比较了两种不同来源的高丝氨酸乙酰转移酶MetX，然后通过敲除竞争和消耗途径基因(metA、metB和thrB) 并过表达合成途径基因(thrA、metxlm)，实现了OAH的积累，其产量达到1.68 g/L。为了进一步提高OAH的生产，该研究采用多种代谢工程策略对工程菌株进行进一步改造，包括：敲除赖氨酸竞争途径基因lysA；利用启动子工程调控ppc表达以增强草酰乙酸的供给；比较不同来源的天冬氨酸激酶，促进前体天冬氨酸的合成等，使OAH的产量提高至4.69 g/L。然而，中间代谢产物高丝氨酸的大量积累说明其下游途径关键酶高丝氨酸乙酰转移酶MetXlm的催化能力是不足的。为了解决这一问题，该研究分别采用基于进化保守性和基于结构信息的蛋白质工程策略对MetXlm进行改造，获得的突变体酶活比野生型提高了12.15倍并受到更少的反馈抑制。通过优化表达MetXlm突变体，使工程菌株OAH产量达到7.37 g/L。随后该研究通过过表达胞内乙酰CoA合成途径，调控胞内NADPH的合成，进一步提高OAH的合成能力。最终获得的工程菌株OAH-7在7.5 L发酵罐中经60 h发酵能够生产62.7 g/L的OAH[55]。
由于L-半胱氨酸复杂的代谢途径和严谨的调控作用，通过微生物发酵法生产L-半胱氨酸的产量和得率较低，无法满足工业化生产需求。刘君团队以谷氨酸棒杆菌为宿主细胞，探究了L-半胱氨酸合成瓶颈，构建了高效的L-半胱氨酸合成细胞工厂。该研究首先通过敲除半胱氨酸脱巯基酶和过表达自身的丝氨酸乙酰转移酶(serine acetyltransferase, CysE)，实现了L-半胱氨酸的积累。然后通过多种代谢工程策略进一步提高L-半胱氨酸的合成，包括增强关键酶CysE的表达强度；比较多个异源的CysE，寻找最优的候选者；过表达L-半胱氨酸合成酶增强合成通量；比较多个异源的转运蛋白，增强L-半胱氨酸的转运能力以及提高前体丝氨酸的供给等策略。最终获得的工程菌株CYS-19能够积累(947.9±46.5) mg/L L-半胱氨酸，是目前报道的利用谷氨酸棒杆菌生产L-半胱氨酸的最高水平[56]。
2.4 质构改造关键酶人造肉在复配出来后的初始状态为肉糜状，肉质疏松，口感不佳。谷氨酰胺转氨酶(glutamine aminotransferase, TGase) 能够催化蛋白质中谷氨酰胺残基的γ-酰胺基和赖氨酸的ε-氨基之间进行酰胺基转移反应，形成ε-(γ-谷酰胺)-赖氨酸的异型肽键，从而将小块肉类结合成大块，形成肉类的致密结构，提高人造肉的质构像真度。茂源链霉菌(Streptomyces mobaraensis) TGase是最早商业化的TGase[57-58]。随后，大量的研究报道了在新菌种筛选[59]、发酵优化、异源表达、酶的改性[60-61]和应用[62]等方面研究进展。目前报道的表达系统主要有链霉菌属[63]、芽孢杆菌属[64]、肠杆菌属[65]、放线菌属和酿酒酵母[66]等。江南大学未来食品科学中心刘松团队开展了一系列工作。为构建高效的TGase分子改造平台，通过N-端融合吸水链霉菌TGase酶原区、共表达活化蛋白酶和分子伴侣(DnaK、DnaJ和GrpE)、分泌信号肽理性设计及细胞壁脂蛋白缺失，首次实现了活性TGase在大肠杆菌中高效分泌表达(1.99 U/mL)[65]。基于该表达系统，开发和应用了一系列酶理性改造方法，使S. mobaraensis TGase热稳定性和催化活性得到显著提升[67]。为提高TGase发酵水平，构建了S. mobaraensis的高通量诱变选育策略，并首次实现了对该菌株的基因编辑，增加了酶基因的拷贝[68]，得到了重组菌株smY2019-3C，TGase的产量进一步提高103%，产量达到40 U/mL。目前，该团队已经开发了基于CRISPR-Cas的S. mobaraensis基因编辑方法，并将多个耐热TGase基因整合表达于S. mobaraensis，使该酶的发酵产量和应用性能均得到显著提升。
2.5 人造肉的复配与加工目前，常见的人造肉的生产方法主要是挤压法和纺丝法。挤压法是蛋白经挤压、膨化等工序，加上各类食品添加剂来加工制造人造肉的方法。纺丝法是首先将蛋白纺成类似于天然肉类质地、口感的肌肉纤维，后经过热合加工成类肉组织。
对蛋白基料、风味油脂与色素的混合定型加工是非常重要的人造肉制造环节。其中，肉类纤维高仿真模拟直接决定着人造肉产品咀嚼口感，是备受关注的人造肉定型加工工艺。高水分物料受到挤压定向流动经过设备模头时，会在高温、高压与高剪切等作用力下发生质构重组，形成纤维组织化程度高、富有弹性和韧性、能够直接食用的模拟肉制品。因此，高水分挤压技术被认为是最具工业可行性的人造肉生产工艺[69] (图 4)。除Beyond Meat等国外品牌外，以天津美康食品有限公司为代表的中国本土企业也陆续引入了高水分挤压技术及相关设备进行人造肉生产。
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| 图 4 人造肉挤压工艺 Fig. 4 Extrusion technology of alternative meat. |
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通过合成生物学技术生产的改性修饰食品用酶，可以助力成型技术与新型原料研发，推动高仿真质构的人造肉开发。不仅如此，食品用酶还可以提高人造肉的风味与食用安全性。转谷氨酰胺酶可以催化蛋白质谷氨酰胺残基侧链和赖氨酸残基侧链之间形成异肽键，其在高水分挤压工艺中的适量添加，会降低蛋白的α-螺旋含量，增加β-折叠含量，促进蛋白质分子伸展、聚集和交联，同时调节蛋白分子间的疏水作用、氢键和二硫键，提高蛋白凝胶三维结构的稳定性[70]。如转谷氨酰胺酶催化豌豆蛋白果胶交联形成的扇贝类似物，硬度、弹性与咀嚼感与真实扇贝没有差别，微观结构也具有一定的相似性[71]。
交叉领域创新技术3D食品打印将与人造肉制造技术相结合，在满足消费者对形状和营养的个性化需求方面具有巨大潜力[72]。然而，3D食品打印面临的难点问题是大多数食品材料在打印后仍处于流动状态，在后续加工过程中会发生变形。转谷氨酰胺酶在人造肉3D打印加工中的应用，有利于具有一定强度的人造肉粘弹性系统形成，提高人造肉形状保真度和稳定性[73]。漆酶可以通过单电子去除机制氧化苯酚官能团结构产生自由基，促使含有阿魏酸的果胶类黏合剂与含有酪氨酸的蛋白质进行自由基交联，形成结构性能更佳的多糖-蛋白凝胶网络。如使用甜菜果胶替代传统的人造肉黏合剂羧甲基纤维素，在漆酶作用下加工的人造汉堡肉饼成型性与黏合性能显著增加，持水/持油能力和胃肠道消化率有明显提高[74]。如磷脂酶处理可以促使人造肉重要原料大豆分离蛋白中的异味物质前体磷脂含量明显降低[75]。在高水分挤压与转谷氨酰胺酶联合的交联剪切作用下，人造植物蛋白肉原料豌豆蛋白的二级和三级结构发生显著改变，导致过敏原减少[76]。
3 展望未来食品的生物制造技术及其产品的迅猛发展，既可以有效解决持续增长的人口对食物的需求，又可以满足人类对高端营养和美好生活水平的追求，将会支撑形成绿色、低碳的新兴未来食品产业，引发传统生产模式的深刻变革，是人类文明可持续发展的重要保障，是新兴生物经济的重大战略发展方向。
尽管生物催化和微生物发酵技术在功能糖制备方面取得了较好的研究进展，但是仍有很多方面有待提升。首先，目前表征的很多酶催化剂，其催化效率、稳定性、耐受性等性能尚未达到工业化生产需求，迫切需要结合酶分子改造技术或者数据库挖矿技术获得适应大规模生产需求的工业酶制剂；其次，当前大部分研究聚焦酶催化性能本身，如何实现酶的高效制备，依然是制约生物催化转化的关键因素，迫切需要开发具有自主知识产权、高效、通用型的酶表达系统，并开发高效的酶制备和固定化工艺；再次，与生物转化技术相比，微生物发酵技术具有制备复杂功能寡糖和多糖易放大生产优势，然而受限于对微生物代谢系统认知和代谢调控技术，生产效率和产物种类偏少，随着基因编辑等技术发展，调控元件可以更加广泛地动态调控细胞代谢，从而实现产物合成和细胞生长代谢适配。
美国和欧盟等发达国家已投入数亿美元资金用于支持微生物蛋白肉产业的研发。在产业推进方面，美国阔恩公司所开发的微生物蛋白肉产品已经在美国、英国等全球18个国家获得上市许可，仅英国一个分公司2021年的销售额即达到2.254亿美元。此外，ENOUGH、Mycorena、Nature’s Fynd、Perfect day等国外初创公司也在加速开发不同的微生物蛋白肉产品，部分产品已经上市。世界范围内微生物蛋白肉相关企业在2019–2021年的融资额呈线性增长，从2019年的2.81亿美元发展到了2021年的9.85亿美元，总融资额达到了18.53亿美元。而目前我国在微生物蛋白肉技术研究方面刚刚起步，相关细胞工厂及其蛋白肉的生产技术极度缺乏，已被国外形成包夹之势。因此，我国急需加快在微生物蛋白肉方面的布局，抢占战略制高点，解决我国的燃眉之急。未来，应重点发展设计、构建和选育高效微生物细胞工厂，重构物质流再分配，创新碳氮代谢与微生物蛋白合成技术路线和微生物蛋白肉智能化复配与成形等关键技术。
此外，针对生物制造未来食品产品，制定科学合理的市场准入、安全评价和规范化管理的政策法规，加快推动合成生物技术成果的产业化应用，已经成为我国生物制造产业发展、保障生物产业链安全、参与国际市场竞争的重要课题[77]。
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表1(Table 1)
