2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 谢运昌, 姚仕杰, 李炜, 单润润, 吴贵贵, 童图强, 陈奇
- XIE Yunchang, YAO Shijie, LI Wei, SHAN Runrun, WU Guigui, TONG Tuqiang, CHEN Qi
- 放线菌核糖体工程的发展与应用
- Development and application of ribosomal engineering in actinomycetes
- 生物工程学报, 2022, 38(2): 546-564
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(2): 546-564
- 10.13345/j.cjb.210150
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文章历史
- Received: February 21, 2021
- Accepted: June 21, 2021
- Published: July 1, 2021
引用本文
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2. 安徽医科大学 生命科学学院, 安徽 合肥 230032
2. School of Life Sciences, Anhui Medical University, Hefei 230032, Anhui, China
放线菌具有生产多种结构新颖且活性优良的次级代谢产物(secondary metabolite) 的巨大潜能，也是创新药物研发的重要源泉[1-5]。据不完全统计，临床中约70%的抗生素及其衍生物来源于放线菌[6-9]。然而这些只是放线菌次级代谢生产潜能的“冰山一角”，大量宝贵的活性分子的生物合成基因(簇) 在常规条件下都是以沉默(silent) 状态存在，无法生产相应产物；此外，大量野生型菌株具有长期进化形成的严谨调控体系，限制其次级代谢产物的生产效率[10-12]。如何有效解决上述制约，并实现菌株巨大基因资源与产物合成潜能的充分挖掘，成为当前放线菌次级代谢研究工作中亟待解决的核心问题。
在此背景下，一种新颖放线菌次级代谢产物发掘策略——核糖体工程(ribosomal engineering) 技术应运而生。该技术是由日本科学家Kozo Ochi (以下简称Ochi) 及其研究团队创建，其主要方法为利用多种作用靶点位于放线菌RNA聚合酶和核糖体等细菌转录翻译元件上的抗生素胁迫处理菌株(图 1)，促使菌株的RNA聚合酶及核糖体发生相应抗生素的抗性突变后，调控胞内基因(簇) 表达并激活菌株合成相关活性次级代谢产物[13-16]。该方法无需建立全面的菌株遗传操作体系，且可作用于几乎所有放线菌菌株；同时相较于紫外诱变、等离子体诱变和常规化学诱变剂处理等传统方法，其目标更加明确，突变效率高且突变效果好，更能够精准地激活放线菌的次级代谢生物合成途径，实现放线菌次级代谢产物的针对性开发[16-19]。作为一种简便高效的新型放线菌次级代谢产物定向发掘方法，核糖体工程具有重要的研究开发价值，且已广泛应用于包括基因组挖掘(genome mining) 在内的放线菌新颖活性次级代谢产物的发掘与生产优化[19-21]。鉴于此，本文着重从放线菌核糖体工程的起源、发展与应用方面进行系统归纳与总结，以期为核糖体工程的后续发展及放线菌源活性次级代谢产物的发掘提供详细借鉴和全面参考。
核糖体工程本质上是一种抗生素胁迫目标菌株发生定向突变的微生物育种技术[13-21]。该技术源于微生物分子遗传与育种研究的深化与拓展，特别是对细菌严谨反应(stringent response) 机理的深入研究[13-15, 19]，其创建过程大致经历了3个阶段。
1.1 技术的萌芽——放线菌严谨反应激活自身次级代谢现象的发现严谨反应是细菌面临氨基酸营养匮乏时的一种环境适应性基因表达调控机制，通过产生一类高度磷酸化的鸟苷四磷酸(ppGpp) 或鸟苷五磷酸(pppGpp) 信号分子(薄层层析中呈明显斑点，也称为魔斑)，并作用于自身的RNA聚合酶，从全局水平调控菌株的基因表达[22]。Ochi首次发现放线菌种的次级代谢产物的生物合成与胞内ppGpp的合成及含量水平呈正相关，当胞内的ppGpp合成受阻或含量骤降时，抗生素产量也同步剧减[14]。这个划时代意义的发现首次表明放线菌严谨反应极有可能正调控菌株的次级代谢。
后续研究发现以actinorhodin/Act为代表的多种次级代谢产物的生产，依赖于菌株合成ppGpp，且相关的ppGpp合成缺陷突变菌株也可以通过回补关键基因以修复并生成ppGpp，进而最终重启次级代谢产物的生物合成。这些研究结果进一步地证明了严谨反应可有效激活放线菌的次级代谢，而ppGpp则是激活通路中的信号分子(图 2)[14]。
ppGpp的作用靶点位于细菌RNA聚合酶的β亚基，且该位点又紧邻Rifampicin/Rif (2)结合区，而这个Rif结合区域中的Rif-cluserⅠ又包含在RNA聚合酶的活性位点中[23]。因此Ochi研究团队选择利用Rif处理目标放线菌菌株，诱使菌株产生相应的抗性突变，因该突变位点紧邻ppGpp的靶点且能够产生相同的次级代谢激活效应，从而以一种“迂回”方式实现了严谨反应对放线菌次级代谢的调控(图 3)[14]。抗性诱变所采用的Rif可添加于各类微生物发酵培养基中，且用量可控，诱导产生的抗性突变也可稳定遗传。这种新颖的育种策略，不仅达到了严谨反应调控次级代谢的相同效果，而且避免苛刻培养条件带来的生长限制，在放线菌的次级代谢产物发掘中应用价值巨大。
此后Ochi进一步发现放线菌中编码核糖体蛋白S12的基因rpsL因streptomycin/Str等抗生素诱导而产生的一系列抗性突变的同时，也同样激活了菌株中的次级代谢[14]。利用上述抗生素诱导菌株产生相应的基因突变后，能够在获得抗生素抗性的基础上有效激活并提升自身的次级代谢能力而获得更多目标产物，且该方法相比传统诱变育种，作用靶点更加明确，可操作性更强，在放线菌次级代谢产物开发中已有良好应用。因相关研究起源于探究放线菌严谨反应，进而筛选出Rif；并且以Str为代表的其他抗生素均是以核糖体各元件为作用靶点，于是Ochi等将该技术体系命名为ribosome engineering[13-16, 19]。
1.3 技术的成熟——抗生素抗性诱变机制的逐步揭示及新颖活性产物的发掘确立技术体系后，Ochi团队进一步解析了尚未明确的抗性突变的机制，并发现当rpsL基因突变后引起核糖体蛋白S12上88位的Lys突变为Glu (K88E) 时，参与构成的70S核糖体的结构更加稳定，能够耐受氨基酸营养匮乏和低镁离子浓度的环境胁迫，同时也增强了菌体进入生长后期时被激活次级代谢途径中功能蛋白的表达合成，从而显著提升了目标产物的生产效率[14, 24-25]。此外K88E突变也能提高翻译因子RRF (ribosome recycling factor) 的含量并最终促进次级代谢产物生物合成途径中的功能蛋白的表达与合成(图 4)[14]。
此外Ochi团队证实Str诱导放线菌往往会产生一类弱抗性(low-level) 突变株，这类突变频率(10–5–10–7) 相对较高，并导致菌株自身的16S rRNA甲基转移酶的编码基因rsmG发生了突变而失活，而S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM) 合成酶MetK的活性则显著增强并提升胞内的SAM的含量[24]。SAM是常见的酶促甲基化反应的甲基供体，同样也是一类启动放线菌次级代谢的信号分子，当胞内SAM含量上升时，一些次级代谢产物的生物合成可以被有效激活[14, 19]。
依据上述机制模型，一系列以细菌核糖体为靶标的抗生素被陆续发掘应用于核糖体工程，如同为氨基糖苷类抗生素，作用于细菌核糖体30S小亚基的gentamicin/Gen (3)、paromomycin/ Par (6)和neomycin/Neo (5)；作用于细菌核糖体50S大亚基的大环内酯类的erythromycin/Ery (4)、林可酰胺类的lincomycin/Lin (8)，以及tetracycline (11)、chloramphenicol/Chlo (10) 和二萜烯类的pleuromutilin/Ple (9)；作用于翻译延伸因子EF-G的thiostrepton/Thi (12) 和fusidic acid/Fus (7) 等(图 1)[14, 16, 19]。
随后Ochi研究团队选取Rif、Str、Gen，首次成功发掘了1组8个新颖抗菌环肽分子piperidamycin A-F/Pip A-F (14)，并证明突变后的RNA聚合酶的启动子序列识别特异性发生了变化，能够有效识别原先沉默的生物合成基因(簇) 的启动子，并激活表达而高效合成产物Pip[15]。相关分子机制的揭示，表明核糖体工程可从分子水平上“唤醒”潜在的基因资源并激活生产新颖产物稳定生产。这些新产物的发现与新机制的揭示标志着Ochi等研究开发的核糖体工程日趋成熟，既可用于已知活性产物生产效价的提升，同时也能够用于未知产物的探索发掘，应用价值巨大且前景广阔！
2 放线菌核糖体工程的应用核糖体工程的主要技术路线为，通过明确目标菌株可用抗生素的最小抑制浓度(minimum inhibition concentration, MIC)，再用不同MIC比率的抗性平板培养目标菌株，获得具有相应抗生素抗性的突变菌株(突变率约为10–9–10–10)，并用于后续的产物分析与分离鉴定[13-16, 19]。该方法简便易行，除选取抗生素对应的天然抗性菌株外，可应用于几乎所有放线菌菌株，且无需全面系统的菌株遗传操作体系支撑。因而核糖体工程广泛应用于放线菌源次级代谢产物的优化增产和新颖化合物的发掘(表 1，图 5)，并逐步形成了利用单一抗生素诱导(单位点突变和多位点突变) 或多种抗生素组合诱导的两种基本技术体系[14]。
| Antibiotics | Strains | Mutations | Significant change* | Time | References |
| Actinorhodin (13) | S. coelicolor | Str/rpsL (K88E) | 1996 | [29] | |
| Str/rpsL (K88E, K88R) | 15 folds, 2.8 g/L | 1997 | [30-31] | ||
| Par/rpsL (P91S) | 5-21 folds, 2.1 g/L | 2000 | [32] | ||
| Str/rpsL (K88E), Gen, Rif/rpoB (H437Y) | 48 folds, 6.88 g/L | 2001 | [33] | ||
| Rif/rpoB (R440H, Q424L) | > 93 folds, 2.79 g/L | 2002 | [34] | ||
| Str/rpsL (K88E) | 2006 | [35] | |||
| Str/rsmG deletion | 2007 | [36] | |||
| Str, Gen, Rif, Par, Gnt, Fus, Tsp, Lin | 180 folds, 1.63 g/L | 2008 | [37] | ||
| Str/rpsL (K88E, R86P) | 55-106 folds, (0.133 8±0.007 0) g/L | 2009 | [38] | ||
| Str/rpsL (K88E-GI92), Par | 2009 | [39] | |||
| Ery | 2012 | [40] | |||
| Rif/rpoB (S433L) | 42.0-55.5 folds, (28.7±1.3) g/L | 2013 | [27] | ||
| S. lividns | Str/rpsL (K88E) | 1996 | [29] | ||
| Rif/rpoB (R440C) | 2002 | [41] | |||
| Rif/rpoB (S433L, S433P) | 2002 | [42] | |||
| Str/rpsL (L90K, R94G) | 2003 | [43] | |||
| Str/rsmG mutation | 2007 | [36] | |||
| Ery | 6-8 folds, 3 g/L | 2012 | [40] | ||
| Actinorhodin related compounds | S. coelicolor | Rif | New compounds not detected in WT strains | 2013 | [27] |
| Actinomycin D (28) | S. antibioticus | Str | 5.2 folds, 0.063 g/L | 1998 | [44] |
| Gen | 4.1 folds, 0.05 g/L | 2008 | [45] | ||
| Str/rpsL (K88R) | 7-10 folds, (0.047 1±0.004 4) g/L | 2009 | [38] | ||
| Rif/rpoB (H437R) | 5-11 folds, (0.086±0.016) g/L | 2013 | [27] | ||
| S. parvulus | Str/rpsL (K88R) | 2-10 folds, (0.032 8±0.008 6) g/L | 2009 | [38] | |
| Rif/rpoB (D427V) | 1.0-2.2 folds, (0.010±0.001) g/L | 2013 | [27] | ||
| Avermectin (23) | S. avermitilis | frr overexpression | 3.0-3.7 folds, > 0.8 g/L | 2010 | [46] |
| Avilamycin | S. viridochromogenes | Str/rpsL (K43N) | 36.8 folds, 1.4 g/L (60Co g-ray, GS) | 2013 | [47] |
| A21978C | S. roseosporus | Str/rpsL (K43N) | 2.2 folds, > 0.12 g/L (i) | 2018 | [48] |
| Caerulomycin A (20) | Actinoalloteichus sp. | Gen | 14.6 folds, (0.011 4±0.008 0) g/L (UV, RSM, ii) | 2020 | [49] |
| Chloramphenicol (10) | S. coelicolor (HE) | Str, Rif | 20-40 folds | 2011 | [50] |
| Congocidine | S. coelicolor (HE) | Str, Rif | 20-40 folds | 2011 | [50] |
| 2-aminobenzamide derivatives | Streptomyces sp. | Rif | New compounds | 2019 | [51] |
| Daptomycin (25) | S. roseosporus | Ple/rplC (G152V) | 1.3 folds, > 0.8 g/L | 2013 | [52] |
| Par, Rif, Neo, Gen | 4 folds, 0.324 g/L (GS) | 2018 | [53] | ||
| Erythromycin (4) | Saccharopolyspora erythraea | Str/rpsL (K43N) | 2 folds, 0.15 g/L | 2009 | [38] |
| Rif/rpoB (H437R) | 4 folds, (0.163±0.034) g/L | 2013 | [27] | ||
| Formycin A (21) | S. lavendulae | Rif/rpoB (R440H) | 2.4-4.6 folds, (0.055±0.014) g/L | 2013 | [27] |
| Fredericamycin A (20) | S. chattanoogensis | Str | 26 folds, 0.26 g/L | 1998 | [44] |
| S. somaliensis | Rif/rpoB (R444H) | 3 folds, (0.679 5± 0.015 8) g/L (RSM) | 2015 | [54] | |
| GE2270 | Planobispora rosea | Str, Gen, Rif | 1.8 folds | 2006 | [55] |
| Inducamides A-C (16) | Streptomyces sp. | Rif/rpoB (S442F) | New compounds | 2014 | [56] |
| Isoindolinomycin (18) & Lactonamycin (19) | Streptomyces sp. | Rif/rpoB (H437Y) | New compounds | 2018 | [25] |
| Methylbenzene-containing polyketides (17) | Streptomyces sp. | Rif/rpoB (H437D) | New compounds | 2016 | [26] |
| Milbemycin | S. bingchenggensis | Str | 1.8 folds, 1.45 g/L (UV, CM) | 2009 | [57] |
| Mutaxanthenes (15) | Nocardiopsis sp. | Str, Rif/rpoB (G3280A in gene) | New compounds | 2013 | [58] |
| Norvancomycin | Amycolatopsis orientalis | Str, Rif | 1.4 folds (HEB) | 2006 | [59] |
| Nosiheptide (27) | S. actuosus | Str/rpsL (K88R) | 9.2 folds, 1.54 g/L (60Co g-ray, GS, LiCl) | 2014 | [60] |
| Oligomycin (34) | S. avermitilis | Str/rpsL (K43M) | 20-40 folds, 1.064 g/L | 2009 | [38] |
| Piperidamycins (14) | S. mauvecolor | Str/rpsL (K88R), Gen, Rif/rpoB (H437D or H437L) | New compounds | 2009 | [15] |
| Rabelomycin | S. dengpaensis | Str | 7.8 folds, (0.015 7 ± 0.000 5) g/L (UV, F) | 2020 | [61] |
| Rimocidin (33) | S. rimosus | Gen, Rif | 1.6 folds, 0.673 1 g/L | 2019 | [62] |
| Saquayamycin B1 | S. dengpaensis | Str | 11.4 folds, (0.039 9 ± 0.000 5) g/L (UV, F) | 2020 | [61] |
| Salinomycin (29) | S. albus | Str/rpsL (K88R), Gen, Rif | 2.3 folds, 23 g/L | 2003 | [63] |
| Tet, Chlo | 2 folds, 34.712 g/L (ARTP) | 2019 | [64] | ||
| Str/rsmG mutation | ≈2 folds, > 0.2 g/L | 2019 | [65] | ||
| Str/rsmG mutation | 5.1 folds, > 0.4 g/L (iii) | 2020 | [66] | ||
| Sinefungin | S. incarnatus | Rif/rpoB (D447G) | 35 folds, > 0.05 g/L (iv) | 2010 | [67] |
| Streptomycin (1) | S. griseus | Gen | 10 folds, 0.3 g/L | 2008 | [45] |
| Rif/rpoB (Q424K) | 2.4-6.0 folds, (0.178±0.027) g/L | 2013 | [27] | ||
| Tiancimycin A (31) | Streptomyces sp. | Rif/rpoB (L422P) | 40 folds, (0.022 5±0.003 1) g/L | 2018 | [68] |
| Str/rpsL (K43N) | 45 folds, (0.013 7±0.000 3) g/L | 2019 | [69] | ||
| Gen, Str/rsmG deletion | 1.6 folds, (0.002 08±0.000 40) g/L (GS) | 2020 | [70] | ||
| Tiancimycin D (32) | Streptomyces sp. | Str/rpsL (K43N) | 109 folds, (0.019 2±0.000 4) g/L | 2019 | [69] |
| Toyocamycin (24) | S. diastatochromogenes | frr overexpression | 1.5 folds, > 0.6 g/L | 2014 | [71] |
| Rif/rpoB (H437Y) | 4.5 folds, 0.68 g/L | 2016 | [28] | ||
| Vancomycin (26) | A. orientalis | Rif/rpoB (S442Y) | 2.6-3.4 folds (0.270±0.017) g/L | 2013 | [27] |
| Virginiamycin | S. virginiae | Str | 11.6 folds, 0.251 g/L (UV, MW, GS) | 2018 | [72] |
| 6'-deoxy-bleomycin Z | S. flavoviridis | Str, Gen, Rif | 7 folds，0.07 g/L (UV) | 2018 | [73] |
| ARTP: atmospheric and room temperature plasma; CM: chemical mutation; F: fermentation optimization; GS: genome shuffling; HE: heterologous expression; HEB: hard electron beam; MW: microwave mutagenesis; RSM: response surface methodology; UV: ultraviolet mutagenesis; i: reporter-guided selection system; ii: cofactor engineering; iii: complementation with a mini-gene cluster; iv: rest cell system. *: Significant change including the titer increasing folds, the finally highest titer and other improvement strategies. Ery, Fus, Gen, Gnt, Kan, Lin, Par, Rif, Str, and Thi indicate resistance to erythromycin, fusidic acid, gentamicin, geneticin, kanamycin, lincomycin, paromomycin, rifampicin, streptomycin, and thiostrepton, respectively. rpsL and rpoB indicate the genes coding for the ribosomal protein S12 and the RNA polymerase β-subunit, respectively. | |||||
在放线菌核糖体工程的应用中，已有10余种抗生素得以推广应用，而其中尤以Rif和Str应用最广，也是机制研究最为透彻的两种。
2.1.1 RifampicinRif诱导放线菌产生的最常见突变位于rpoB编码的RNA聚合酶β-亚基保守的第437位的His/H，该位点容易突变为Tyr/Y、Asp/D、Arg和Leu/L等(表 1)，且该位点的突变极易激活菌株中的沉默基因簇而发掘新颖代谢产物。例如：Hosaka等诱导获取的苯胺紫链霉菌(Streptomyces mauvecolor)中rpoB H437L和H437D突变株菌能生产Pip类代谢产物[15]；Thong等从1株具有rpoB H437D突变的链霉菌中分离鉴定一类新型methylbenzene-containing polyketides (17)，又从另1株具有rpoB H437Y突变的链霉菌中获取了一类新型isoindolinone-containing tetracyclic polyketides: isoindolinomycin (18) 与lactonamycin (19)[25-26]。此外该位点的突变也能够显著提升菌株目标产物的生产效率，例如：S. antibioticus中的rpoB H437R突变能够显著提升actinomycin D/AcnD (28) 的产量4–10倍，而糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)中出现同样突变时，Ery的产量显著提升了3倍，达到了(0.163±0.034) g/L[27]；此外S. diastatochromogenes中toyocamycin/Toy (24) 则在菌株获得rpoB H437Y突变后产量提升3.5倍，达到0.68 g/L[28]。
除常见的437位His易发生突变外，近年来还发现Rif还容易诱使rpoB的433位与442位的Ser、422位的Leu、424位的Gln/Q以及427位的Asp和440位的Arg发生相应突变，从而激活沉默的次级代谢途径。例如：S. lividns中的rpoB的S433L、S433P以及R440C (Cys) 等突变都能激活原先培养条件下沉默的Act生物合成途径[41-42]；尤其Hosaka等筛选获得的rpoB S442W (Trp) 突变株也同上述其他Rif抗性突变株一样能够生产Pip类化合物[15]，而Fu等诱导获得的具有rpoB S442F (Phe) 突变的链霉菌则被激活生产一类新骨架结构分子inducamides A-C (16)[56]。此外上述位点的突变，也能显著提升菌株的产物生产效率，例如S. coelicolor中rpoB R440H和Q424L突变将菌株中Act的生产效价提高至原效价的93倍以上，达到2.79 g/L水平，而另一个rpoB S443L突变则将菌株的Act的生产效价提高到原来的42–55.5倍，高达(28.7±1.3) g/L[34, 27]；具有良好生物学活性的烯二炔分子tiancimycin A/Tia A (31)的生产菌经诱导产生rpoB L422P突变后产量提升约为野生型产量的40倍[68]。此外Acn D生产突变株菌S. parvulus rpoB D427V (Val)、Formcyin A生产突变株菌S. lavendulae rpoB R440H和Vancomycin (26) 生产突变株东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis) rpoB S442Y在获得Rif抗性的同时，相关产物的产量均有1–5倍左右的增加[27]。除上述常见的保守位点突变外，rpoB的一些菌株特异性突变也能够有效激活菌株潜在产物的生物合成途径，如fredericamycin A/Fre A (20) 因菌株获得了rpoB R444H抗性突变后得以激活生产[44]。这些独特的突变位点的揭示及相关应用实例充分表明Rif是一个高效、效应广泛且显著的核糖体工程可用抗生素。
2.1.2 StreptomycinStr诱导放线菌产生的突变更加集中，常见于rpsL编码的核糖体蛋白S12的2个保守突变位点：第88位和第43位的Lys。常见的突变形式为K88E、K88R (Arg) 和K43N (Asn)。例如：S. coelicolor和S. lividns中rpsL K88E突变能够激活原先培养下沉默的Act生物合成[29, 35]；而具有rpsL K88E、K88R双位点突变的S. coelicolor菌株中Act的生产效价则显著提升了14倍，达到2.8 g/L的水平[30-31]；而带有rpsL K88R突变的S. antibioticus和S. parvulus菌株则能分别将Acn D的生产效价提升为出发菌株的7–10倍和2–10倍[38]。此外具有rpsL K43N突变的放线菌菌株，代谢产物生产提升同样显著，例如：具有上述突变的Tia生产菌中Tia A、Tia D的产率分别较出发菌株提升了45倍和109倍；而S. erythraea中出现同样突变时，Ery的产量提升了1倍，达到了0.15 g/L[38, 69]。
除上述常见的保守突变外，经Str诱导的放线菌往往也能够产生一些独特的效应突变，例如：具有罕见的rpsL L90K、R94G突变的S. lividns同样可以激活原培养条件下沉默的Act的生物合成[43]；具有rpsL K43M (Met) 突变的S. avermitilis能够有效提升其oligomycin (34) 的产量至出发菌株的20–40倍，达到1 g/L以上[38]。此外Str还会诱发放线菌中的rsmG基因发生突变，从而产生一类弱抗性突变株。具有这类突变的S. coelicolor和S. lividns同样能够激活处于沉默状态的Act生物合成基因(簇) [36]；而当rsmG基因发生突变时S. albus也能够提升其salinomycin/Sal (29) 产量达到0.2 g/L以上的水平[65]。综上可见，Str同样也是一种效应显著的核糖体工程用抗生素。
2.1.3 Gentamicin及其他抗生素Gen是一类诱导机制及突变效应尚不明确的核糖体工程用抗生素，但作为常用抗生素之一，其对放线菌次级代谢的激活与提升效果同样明显，例如：Hosaka等同样获取了具有单一Genr抗性的Pip生产菌株[15]；Hu等利用Gen处理S. antibioticus和S. griseus后筛选获得了Acn D和Str的高产菌株[45]。
除上述3种常见抗生素外，在Act的生物合成研究中Ochi研究团队发现利用Par诱导S. coelicolor产生rpsL (Pro) P91S (Ser) 突变能够有效提升Act产率至出发菌株的5–21倍，产量最高可达2.1 g/L[32]；而利用Ery诱导S. coelicolor可激活出发菌株中沉默的Act生物合成基因簇，而诱导S. lividns则有效提升出发菌株中Act的生产效价5–7倍，最高达到3 g/L水平[40]；此外，Li等针对daptomycin/Dap (25) 生产菌株S. roseosporus，首次选用Ple进行诱导处理，在获得独特的rplC (Gly) G152V抗性突变后，Dap产率提升为出发菌株的1.3倍，达到0.8 g/L以上水平[52]。上述工作表明，核糖体工作技术体系可用抗生素类型广泛，通过优选抗生素丰富其技术体系的同时，也能够获取生产多种不同活性产物的优良工程菌株。
2.2 利用抗生素组合诱导激活放线菌生产新颖活性化合物和增产目标产物通过选择多种效用抗生素串联组合获取的双抗、多抗突变菌株同样也能够生产多种新颖活性化合物并实现目标产物的高效增产，而且往往这类菌株中增产效率数倍于其单一抗性突变株。例如：Derewacz筛选获得的含有罕见rpoB突变位点(G3280A基因突变) 的Rifr、Strr双抗性突变Nocardiopsis菌株则能够生产一类含氧杂蒽骨架的新的Ⅱ型聚酮mutaxanthenes[58]。Wang等首次使用了8种抗生素处理S. coelicolor菌株，获取的具有8种抗性的突变菌株中Act产量创纪录地提升为出发菌的180倍[37]；而具有Rifr、Strr、Genr三抗性的GE2270与Sal生产菌株，其目标产物的产量均有显著提升[55]。除了原始生产菌株外，利用核糖体工程构建的Rifr、Strr双抗性S. coelicolor M1154突变菌株，异源表达生产Chlo与congocidine，产量均提升20–40倍[50]。
基于多重抗生素的核糖体工程往往能够产生综合诱变效应与事半功倍的诱导效果。这类抗生素组合策略已全面普及，尤其所获得的突变菌株可作为下游其他生物学技术处理的出发菌株，促进放线菌次级代谢产物的深入发掘。
2.3 核糖体工程与其他生物学技术组合运用核糖体工程具有良好的菌株适用性，近年来研究人员将核糖体工程与其他菌株改良方法组合使用，从而实现菌株次级代谢能力与目标产物生产效率的最优提升。与核糖体工程组合运用的菌株改良技术主要有传统的菌株诱变技术，包括物理诱变(紫外与射线) 及化学试剂诱变；新型高效菌株诱变技术，例如：DNA重排(shuffling) 和等离子诱变技术(atmospheric and room temperature plasma, ARTP)；以及培养基优化和添加化学诱导剂等(表 1)。且在实际工作中，研究人员往往不会局限于使用1–2种改良方法，而是尽可能多地组合各种可行的菌株诱变改良技术。
2.3.1 核糖体工程与传统菌株诱变技术的组合运用传统诱变技术同样也具有良好的菌株适用性，且操作简便，通过与核糖体工程组合实用，结合高效的筛选验证可以达到更大程度的菌株诱变效果，从而获取更加优良的次级代谢激活优化菌株。其中实验室利用最为常规的是紫外诱变(可利用超净工作台紫外灯) 结合核糖体工程诱导获取优良出发突变菌株，基于最优的发酵培养条件，可实现目标代谢产物的快速直接增产，例如：Zhu等筛选了菌株生产6′-deoxy-bleomycin/Ble的最优条件后，再串联使用紫外诱变和核糖体工程改良相应的生产菌株，最终将产物效价提升至出发菌株的7倍，达到0.07 g/L[73]；Li等利用紫外诱变和核糖体工程诱导获取了具有Strr的S. dengpaensis类突变株，该突变株在优化培养条件下自身angucycline类抗生素：rabelomycin/Rab与saquayamycin B1/Saq B1的产量分别提升为出发菌株的7.8倍与11.4倍[61]；此外本研究团队针对激活生产caerulomycin A/Cae A (22) 的具有Genr突变的海洋Actinoalloteichus sp.类菌株进行紫外诱变，将产物的效价进一步提升85%，并作为后续深入改良的出发菌株[49]。此外，紫外诱变也可以和传统的化学诱变组合使用，结合核糖体工程达到菌株的最佳优化，例如：Wang等利用紫外和化学试剂组合诱变具有Strr的来源于核糖体工程的milbemycins (30) 生产菌株，获取了1株具有1.8倍增长，单个分子效价最高达到1.45 g/L的高产菌株[57]。
除常用的紫外诱变外，利用其他射线诱变与核糖体工程相结合也能够获取优良的高产突变菌株，例如：针对生产norvancomycin的具有Rifr、Strr双抗性的核糖体工程诱导突变株，王耀耀等进一步利用高能电子诱变(hard electron beam) 进行处理，并最终将产物的效价提升为原菌株的1.4倍[59]；Lv等利用60Co γ-ray诱变处理获取最优的avilamycin/Avi生产出发突变株，用于核糖体工程开发[47]；同样Wang等也利用60Co γ-ray诱变，并结合LiCl化学诱变获取了可用于后续核糖体工程开发的nosiheptide/Nos (27) 生产优化突变株[60]；Tong等为提升S. virginiae中virginiamycin/Vir的产率，首先使用紫外诱变结合微波诱变，获取用于随后核糖体工程与基因组重排(genome shuffling) 处理的出发菌株[72]。可见传统的菌株诱变技术与核糖体工程可互补契合、效果显著。
2.3.2 核糖体工程与新型高效菌株诱变技术的组合运用传统诱变技术虽然操作简便易行，但存在严重的局限性，而一些新型高通量菌株诱变技术，能够有效弥补传统技术中的突变率低、可操纵性有限等不足，从而实现更高效的菌株诱变，并与核糖体工程有机结合，实现放线菌活性次级代谢产物的有利发掘。例如：利用具有成本低、操作方便且诱变机制多样而又无环境污染损害的ARTP技术处理经核糖体工程诱导获得的具有Tetr、Chlor双抗性的S. albus突变菌株，Zhang等成功地筛选到1株Sal产量提升为原菌株2倍、效价高达34.71 g/L的高产菌株[64]。除上述ARTP外，另一种基于DNA重排思路改进，借助传统方法与细胞融合技术相结合，对微生物细胞进行基因组重组的高效诱变技术基因组重排也被运用于组合核糖体工程，从而实现放线菌次级代谢途径的发掘与优化。例如：Lv与Wang分别将射线诱变获取的最优出发菌株用于基因组重排同步Str胁迫诱导处理，分别获取了具有rpsL K43N位点突变的产量提升为野生型菌株36.8倍，达到了1.4 g/L水平的Avi高产菌和具有rpsL K88R位点突变的Nos产量提升至1.54 g/L，约9.2倍于出发菌株的优良突变株[47, 60]。此外，基因组重排还应用于其他类型抗生素生产菌的核糖体工程组合诱变中，例如：Yu等利用组合抗生素诱变，获取了具有Parr、Rifr、Neor、Genr四种抗性的S. roseosporus突变菌株，并进一步利用基因组重排诱导使得菌株中Dap的产量提升至0.324 g/L，4倍于出发菌株[53]；Tong等利用基因组重排结合Str胁迫的条件处理紫外与微波诱导获取的S. virginiae突变菌株，进而获取了具有Strr抗性的突变株中Vir效价达到0.251 g/L (11.6倍于野生菌株)[72]；Liu等利用核糖体工程与基因组重排交替处理菌株，最终获取了1株具有Genr与Strr (rsmG deletion) 的双抗性突变株，并将活性优良的十元烯二炔Tia A产量提升至出发菌株的1.6倍[70]。综上所述，利用新型高效菌株诱变技术结合核糖体工程，是切实可行的优良放线菌次级代谢产物生产菌选育策略。
2.3.3 核糖体工程结合基因工程技术改良目标菌株随着基因工程技术的发展，利用成熟的放线菌遗传操作体系直接达到核糖体工程的诱导效果或与核糖体工程组合使用也已有广泛应用。最具代表性的就是基于Str诱导产生的rpsL K88E突变能够提高核糖体再循环因子(ribosome recycling factor) 的含量，进而有效激活放线菌自身次级代谢的效应机制，在菌株中原位(超) 表达自身ribosome recycling factor的编码基因frr，在不经由抗生素直接诱变的情况下直接获取具有核糖体工程诱导效果的基因过表达突变株，从而提升菌株次级代谢产物的生产效价。例如：Li等利用ermEp强启动子在S. avermitilis中过表达frr基因，将阿维菌素(avermectin) 提升至出发菌株的3–3.7倍，生产效价增值0.8 g/L以上[46]；同样Ma等通过frr基因的过表达，有效提升了核苷类抗生素Toy产量至0.6 g/L以上，增至出发菌株的1.5倍水平[71]。
除直接的frr基因过表达外，Wang等利用目标化合物生物合成必需功能基因的启动子结合新霉素磷酸转移酶(neomycin phosphotransferase) 编码基因构建了一套针对rpsL突变的reporter- guided检测系统，快速精准地筛选到了A21978C，效价达到0.12 g/L以上，至少为出发菌株2.2倍增长且具有rpsL K43N突变的S. roseosporus高产Strr抗性突变株[48]；Li等为提升Sal产量，将其原有的100 kb以上的生物合成基因簇sal进行改造，获取了一个极简的mini-cluster，并导入具有rsmG突变且具Strr抗性的S. albus底盘菌株中，从而有效地提升菌株Sal的生产效价至0.4 g/L以上，达到野生型菌株的5.1倍水平[66]。本研究团队针对Cae A生物合成途径中需要多个关键黄素辅酶参与骨架分子的修饰这一现象，依据近年来兴起的辅因子工程(cofactor engineering) 技术，在已激活生产Cae A且经由紫外诱变提升其生产效价的突变菌株中过表达黄素辅因子前体核黄素生物合成的关键功能基因ribA，以提高菌株中核黄素含量水平促进黄素辅酶的生物合成，所获取的突变株中Cae A的生产效价再次提升了约45%[49]。基因工程技术能够有的放矢地作用于目标产物的生物合成途径，因而其与核糖体工程组合使用时，针对性强、效用显著，能更加有效地提高放线菌次级代谢产物的生产效率。
2.3.4 核糖体工程与其他方法的结合运用在放线菌次级代谢产物发掘中，基于产物结构特征与生物合成机制，可针对性地优化菌株的发酵培养基组分和配比，以及相关的发酵过程的理化参数，从而在不直接改变菌株遗传特性的基础上，最大程度地促进相关产物的代谢生产。作为最基本的优化策略，发酵优化可以先于抗生素诱导等菌株处理方法，也可以在获取最佳突变菌株后，进行针对性的优化。例如在Rab、Saq B1与6’-deoxy-ble Z的紫外与核糖体工程组合诱导前，研究人员针对出发菌株进行了相应的发酵培养优化[61, 73]；而Zhang等基于响应面优化法(response surface methodology)，建立起适合Rif诱导激活的Fre A生产突变株的最佳培养基组分，将该化合物的生产效价提升至原培养条件的3倍[54]；本研究团队，针对获取的最优Cae A生产突变株，同样利用响应面优化法筛选出了最适的培养基配方，后续发酵分析发现突变株中Cae A生产效价在该培养基配方下提升至最初配方的5.4倍[49]。除常规的发酵培养优化外，Fukuda等通过在培养基中添加10 mmol/L L-Arg，利用静息细胞技术系统(resting cell system)，将具有rpoB D447G突变的Rifr突变株中的西奈芬净(sinefungin) 的生产效价提升至0.05 g/L以上[67]。
综上所述，各种类型的技术方法建立及效用机制的揭示，一方面完善了核糖体工程的应用体系，促进核糖体工程的不断完善与进步；另一方面开发出多种类型的高产突变菌株及其相应的活性产物，丰富了放线菌活性次级代谢产物库，也为放线菌次级代谢产物的研究与开发提供了良好的借鉴与参考。
3 总结与展望核糖体工程对菌株遗传背景要求低，且无需完善菌株遗传操作体系作为支撑；此外该技术既无外源遗传物质的导入，也不会改变菌株基因组的组成，完全符合当前生物安全法律法规要求，因而具有极为广泛的应用范围和推广空间。核糖体工程经过30余年的发展，已先后在放线菌体系内发掘了10余类新颖结构分子，优化了包括链霉菌及多种稀有放线菌在内的近百株放线菌菌株，有力地促进了放线菌次级代谢的深入研究与活性次级代谢产物的开发利用。此外核糖体工程的不断完善，也为以放线菌为代表的微生物分子遗传学等学科提供了类型丰富的研究样本，拓展其研究范围，促进了学科交叉融合发展。
然而当前放线菌核糖体工程仍存在较多局限，如多种抗生素效用机制不明、诱变效率有限等，会对其应用带来一定限制。因此核糖体工程技术仍有待进一步的发展完善，主要体现在以下4个方面。
1) 发掘更多可用的抗生素：当前放线菌核糖体工程已有10余种可选抗生素，进一步发掘其他可用抗生素，一方面在遇到具有特定抗生素抗性的野生型菌株时，能够自如地调整实验方案；另一方面也有效拓展了放线菌核糖体工程的“武器库”，使其运用更加灵活，便于开展多种方案的组合抗性诱导激活操作。
2) 深入解析多种抗生素的作用机制及确定对应的作用靶点：除Rif与Str外，包括Gen在内的绝大部分抗生素诱导机制与作用靶点尚不明确。针对特定抗生素诱导激活的突变菌株，探究其相应的突变机制及定位关键的抗性靶标[74]，揭示各种抗生素的诱导激活的具体机制，奠定核糖体工程的理论基础并建立机理模型，从而系统地完善放线菌核糖体工程。
3) 基于抗生素诱导激活机制在分子水平上实现菌株的定向突变：基于抗生素诱导激活机制和抗性靶标，研究人员可在目标菌株的基因组上实现分子水平的定向改造，而直接获取具有抗性的产物生产激活或高产突变株，例如：广泛应用的frr过表达技术，直接获取Strr菌株用于产物后续的发掘开发[59, 71]。此外也可以针对ropB与rpsL等抗性靶标基因，利用可行的分子克隆技术在菌株中构建诸如rpoB H437D与rpsL K88E等突变，而直接用于后续代谢产物的分析[75]。这种技术路线源于核糖体工程，而又不完全依赖抗生素的直接诱导，可避免冗长且不可控的菌株抗性诱变与筛选过程。尤其该方法可直接获取目标突变株，避免了抗性诱导带来的不确定性，由被动获取突变株变成主动创造突变株，极大地提高了放线菌次级代谢产物生产的激活与提升效率。
4) 利用菌株基因组信息为指导，快速筛选目标突变菌株：随着基因组学的发展，研究人员可在短时间内获取放线菌菌株的全基因组序列并界定其中全部的次级代谢产物生物合成基因簇，因此利用各基因簇中的特征基因设计基因表达分析引物，利用高通量的基因表达分析技术，直接筛选核糖体工程获取的各种抗性突变菌株，有的放矢地挑选目标化合物激活生产或目标基因(簇) 激活表达的突变菌株，而无需依赖大规模的菌株发酵及产物分析等过程。例如本研究团队，在界定的Cae A生物合成基因簇cam中定位了其骨架合成关键催化酶的编码基因camE，并通过设计基因对应的定量PCR引物，仅通过1次定量PCR反应就挑选出了最优的Cae A激活生产突变菌株，而无需将大量的突变菌株进行耗时费力且成本较高的同步发酵及产物对比分析[62]。通过建立起基因(簇) -化合物的关联关系，利用经济高效的基因表达筛选，实现目标突变株的特异性筛选而直接获取最优出发菌株。
此外，核糖体工程作为一项优良的细菌次级代谢开发策略，可以与其他更多类型的生物学方法技术进行有机整合与高效组合，实现事半功倍的放线菌次级代谢产物的高效发掘，例如本研究团队首次将辅因子代谢通路优化策略整合于放线菌紫外诱变-核糖体工程串联使用当中，进一步提升了菌株中Cae A的生产效价[62]。综上所述，随着基因组学、分子遗传学、分子克隆技术及天然产物研究与开发策略的不断发展，放线菌核糖体工程必将进入一个崭新的发展空间，开创放线菌来源创新药物开发的新局面！
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