2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 郭超杰, 高松, 李宏彪, 吕云斌, 余世琴, 周景文
- GUO Chaojie, GAO Song, LI Hongbiao, LYU Yunbin, YU Shiqin, ZHOU Jingwen
- 异戊烯基转移酶N端截短强化异戊烯基柚皮素合成
- N-terminal truncation of prenyltransferase enhances the biosynthesis of prenylnaringenin
- 生物工程学报, 2022, 38(4): 1565-1575
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(4): 1565-1575
- 10.13345/j.cjb.210456
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文章历史
- Received: June 17, 2021
- Accepted: October 8, 2021
- Published: November 9, 2021
引用本文
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2. 江南大学 生物工程学院, 江苏 无锡 214122;
3. 江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室, 江苏 无锡 214122
2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China;
3. National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
8-异戊烯基柚皮素(8-prenylnaringenin, 8-PN) 是一种柚皮素异戊烯基化的衍生物，分布于少数几种植物中，如啤酒花[1]和苦参[2]等。8-PN是强有效的雌激素类似物，具有多种生物活性，特别是在缓解女性更年期和预防骨质疏松等方面[3-5]，具有重要的临床应用价值。此外，8-PN也是合成重要黄酮类药物淫羊藿素和淫羊藿苷的关键前体。
目前，8-PN主要以提取和合成两种方法生产。提取法主要从废啤酒花中提取。由于啤酒花球果中8-PN含量很低，每千克啤酒花球果只有25–60 mg的8-PN，比黄腐酚的含量低10倍[6-7]。此外，啤酒花球果还存在其他同分异构体，如6-异戊烯基柚皮素(6-prenylnaringenin, 6-PN) 等，增加了8-PN分离和纯化的难度。合成法生产8-PN主要包括化学合成法和微生物合成法。余心哲等以2, 4, 6-三羟基苯乙酮和对羟基苯甲醛为原料，经过异戊烯基化等5步反应成功合成了8-PN，但是收率较低，仅为47%[8]。生物合成8-PN由3部分构成(图 1)，即从头合成柚皮素骨架、酿酒酵母内源甲羟戊酸(mevalonate, MVA) 途径合成二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyl diphosphate, DMAPP)，以及异戊烯基转移酶(prenyltransferases, PTs) 催化柚皮素和DMAPP合成8-PN。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)通常被认为是安全的(GRAS) 模式菌株，适合大规模的工业应用[9]。近年来，利用代谢工程的方法已成功实现酿酒酵母高产柚皮素[10-11]。因此，利用酿酒酵母生物合成8-PN越来越受到人们的关注。
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| 图 1 8-PN生物合成途径 Fig. 1 Biosynthesis pathway of 8-PN. FjTAL: tyrosine ammonia-lyase from Flavobacterium johnsoniae; Pc4CL: 4-coumarate: CoA ligase from Petroselinum crispum; PhCHS: chalcone synthase from PetuniaX hybrid; SmCHI: chalcone synthase from Silybum marianum; EGR10: acetyl-CoA C-acetyltransferase; ERG13: hydroxymethylglutaryl-CoA synthase; tHMGR, truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA (HMG-CoA) reductase; ERG12: mevalonate kinase; ERG8: phosphomevalonate kinase; MVD1: mevalonate pyrophosphate decarboxylase; IDI1: isopentenyl pyrophosphate isomerase. PTs: prenyltransferases; Blue arrow: endogenous MVA pathway in S. cerevisiae; Orange arrow: naringenin synthesis pathway; Red arrow: PTs catalyze (2S)-naringenin to form 8-PN. |
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在8-PN合成过程中PTs起到了关键作用，并且多数PTs有较严格的底物特异性和区域特异性[12]。目前能够催化柚皮素8位异戊烯基化的酶的相关报道较少，且均为植物来源[13-14]。2008年Sasaki等首次从苦参中分离鉴定能够合成8-PN的基因，命名为SfN8DT-1[15]。后续实验表明，SfN8DT-1对柚皮素具有100%的底物特异性和区域特异性[16]。李博等在酿酒酵母中构建柚皮素合成途径并选择SfN8DT-1催化合成8-PN，首次实现了8-PN的微生物法从头合成[17]，然而由于前体柚皮素合成效率较低，限制了8-PN的合成。Levisson等选择苦参来源的SfFPT用于从头合成8-PN，并强化了柚皮素合成途径，最终在酿酒酵母中合成0.12 mg/L的8-PN[18]。由于PTs在微生物中表达后活性降低以及前体柚皮素和DMAPP供给不足的问题，限制了8-PN的高效合成。植物来源的PTs大部分具有不同的定位信号，将它们定位于不同的细胞器，如内质网、线粒体和叶绿体等[14]。这些定位信号随后被信号肽酶切除[19]，但在异源宿主中进行表达时，这些定位信号可能无法被识别并切除。因此，该冗余序列可能会影响酶自身的结构和功能。Sasaki等截短了SfN8DT-1前30个氨基酸，发现对酶的活性未产生影响[15]。李博等分别截短了前40个和84个氨基酸，8-PN的产量分别提高了44.2%和119.1%[17]。上述研究表明，不同位点进行截短会对酶的活性产生不同的影响。因此，本文通过在线网站预测了SfN8DT-1的结构，根据预测结果选取13个位点进行截短并进行发酵验证。随后，以截短后蛋白质为模板进行分子对接、丙氨酸扫描突变以及关键位点饱和突变，鉴定出一个关键催化位点。最后，针对DMAPP的供给，强化MVA途径中关键基因，进一步提高8-PN的产量，结果表明DMAPP是限制8-PN生物的关键因素。本研究结果对后续PTs催化机理的探究具有一定的参考价值。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株与质粒大肠杆菌(Escherichia coli) JM109用于质粒构建与扩增。酿酒酵母PN01用于8-PN的合成。质粒pY26-TEF-GPD[20]用于表达载体的构建。文中所使用的菌株和质粒列于表 1中。
| Strains and plasmids | Description | Resources |
| CENPK2-1D | MATa ura3-52, leu2-3, 112, trp1-289, his3Δ1 | Lab storage |
| PN01 | CENPK2-1D, Δpdc5:: GAL7p-FjTAL-TDH3t, Δaro10:: CYC1t-ARO4K229L-GAL1, 10p-ARO7G141S-ADH1t-G418, Δgal80:: TRP1, ΔrDNA: : PhCHS-GAL10p-GAL1p-ALD5p-SmCHI-ARO7p-Pc4CL-TDH3p-FjTAL-HIS | [22] |
| PN01-S | Strain PN01 harboring plasmid pY26-SfN8DT-1 | This study |
| PN01-Sf-txx | Strain PN01 harboring plasmid pSf-tXX | This study |
| PN01-Sf-t62K185X | Strain PN01 harboring plasmid pSf-t62K185X | This study |
| pY26-TEF-GPD | PGAL7-TCYC1-PGAL2-TADH1; Amp, Ura3, 2μ ori, pBR322 ori, and F1 ori | This study |
| pY26-SfN8DT-1 | pY26-PGAL7-SfN8DT-1-TCYC1 | This study |
| pSf-txx | pY26-PGAL7-SfN8DT-1-txx-TCYC1 | This study |
| pSf-t62K185X | pY26-PGAL7-SfN8DT-1-t62K185X-TCYC1 | This study |
LB培养基(g/L)：蛋白胨1，酵母提取物5，氯化钠10。根据需要加入0.1 g/L的氨苄青霉素钠。固体培养基加入20 g/L琼脂粉。
YPD培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10，固体培养基加入20 g/L琼脂粉。
YNB培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母无氨基氮源6.74，添加50 mg/L对应的缺陷氨基酸(His、Trp、Leu、Ura)，固体培养基加入20 g/L琼脂粉。
5 L发酵罐中补料培养基(g/L)：葡萄糖400、酵母粉15、Na2SO4 0.56、MgSO4·7H2O 10.24、KH2PO4 18、Na2SO4 0.56、K2SO4 7、色氨酸1、亮氨酸1、组氨酸1、尿嘧啶1、微量金属溶液20 mL/L、维生素溶液24 mL/L[21]。
1.1.3 试剂抗生素、氨基酸、质体提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒均购自生工生物工程(上海) 股份有限公司。蛋白胨和酵母粉购自Oxoid公司。8-PN标品购自宝鸡市辰光生物科技有限公司。乙腈(质谱纯) 购自德国Merck公司。其余试剂均购自上海国药集团。无缝克隆酶、感受态制备试剂盒购自大连宝生物有限公司(TaKaRa)。引物合成和DNA测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。
1.2 方法 1.2.1 质粒和菌株的构建使用引物Txx-F (xx为截短的位点) 和Tts-R作为上游和下游引物，以SfN8DT-1为模板构建质粒，并连接于pY26-TEF-GPD质粒上，分别命名为pSf-txx；使用引物K185X-F (X为突变后的氨基酸) 和K185-R，以pSf-t62为模板构建质粒，命名为pSf-t62K185X。构建的质粒转入E. coli JM109中用于质粒的扩增和提取。本文所使用引物见表 2。采用醋酸锂转化方法[23]将质粒转入酿酒酵母菌株中进行游离表达。
| Primers | Sequences (5′→3′) |
| Tts-R | CATTTTTGAGGGAATATTCAACTGTT |
| T59-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGAACTTAAAACAACATTACAAGGTGA |
| T60-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGTTAAAACAACATTACAAGGTGAATGAAGG |
| T61-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGAAACAACATTACAAGGTGAATGAAGG |
| T62-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGCAACATTACAAGGTGAATGAAGGTGG |
| T81-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGAAGAAGTATGTTGTTAACGCTATTTC |
| T91-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGGAACAATCCTTCGAATACGAACC |
| T99-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGACTAGAGACCCTGAATCAATTTGGG |
| T100-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGAGAGACCCTGAATCAATTTGGGATT |
| T101-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGGACCCTGAATCAATTTGGGATTCT |
| T102-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGCCTGAATCAATTTGGGATTCTGTTA |
| T110-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGAACGACGCTTTGGATATTTTCTACA |
| T115-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGATTTTCTACAAATTCTGTAGACCATATG |
| T118-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGAAATTCTGTAGACCATATGCTATGTTCA |
| T119-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGTTCTGTAGACCATATGCTATGTTCACT |
| T120-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGTGTAGACCATATGCTATGTTCACTATC |
| T121-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGAGACCATATGCTATGTTCACTATCGT |
| T122-F | TGAATATTCCCTCAAAAATGCCATATGCTATGTTCACTATCGTTTTG |
| K185X-F | TGTGTGATATTGAAATCGATNNKATCAA |
| K185-R | ATCGATTTCAATATCACACAATTGGTTC |
种子液：挑取阳性转化子于装有5 mL YNB (添加Leu) 的50 mL摇瓶中，220 r/min、30 ℃培养16–18 h。摇瓶发酵：种子液按照1%接种于装有25 mL YPD培养基的250 mL摇瓶中，220 r/min、30 ℃培养120 h。
5 L发酵罐：种子液按照上述培养方法以3%接种于含有2.5 L YPD培养基的5 L发酵罐中。初始搅拌速度为250 r/min，空气流速为2.5 L/min，温度为30 ℃。发酵16 h后，将补料培养基以5 mL/h的流速加入发酵罐中，共加入300 mL。用4 mol/L NaOH将pH控制在5.5，用溶解氧(dissolved oxygen, DO) 与搅拌耦合程序将DO控制在15%，设置为250–600 r/min，空气流速为2.5 L/min。
1.2.3 样品检测发酵120 h后，取500 μL发酵液，12 000 r/min离心1 min。取上清，分别在上清和沉淀物中加入500 μL乙酸乙酯。混匀并吸取上清液中上层有机相，将二者乙酸乙酯合并至装有0.5 mm玻璃微珠的破碎管中，使用FastPrep-24TM 5G仪器破碎细胞。然后经0.22 μm过滤膜过滤所有乙酸乙酯。样品检测采用配备有PDA检测器和Hypers11 ODS 250 4.6 mm2 5 μm C18色谱柱的高效液相色谱系统。流动相为纯水(A相) 和乙腈(B相)，均加入1‰三氟乙酸，采用梯度洗脱程序。流速为1 mL/min，程序为：T=0 min，B=10%；T=10 min，B=40%；T=30 min，B=80%；T= 35 min，B=80%；T=37 min，B=10%；T=40 min，B=10%。柱温设置为40 ℃，柚皮素和8-PN的检测波长分别为290 nm和350 nm。
1.2.4 蛋白质结构预测、分子对接和虚拟筛选利用在线网站(https://drug.ai.tencent.com/)对蛋白质二级结构进行预测。使用AutoDock 4.2软件对底物和蛋白质进行分子对接[24]。配体柚皮素和DMAPP通过全局对接的方式连接于蛋白质上。选择具有最高结合能的对接模型以及距离配体0.5 nm范围内的残基进行后续虚拟筛选。虚拟筛选利用Discovery Studio 2016软件对被选中的残基进行模拟突变，该算法通过计算蛋白质与配体的结合能来识别有潜力的残基。当结合能为正值时，表明蛋白与配体的亲和力会降低；结合能为负值时，表明蛋白与配体的亲和力会增加。
2 结果与分析 2.1 蛋白质结构预测与截短在线网站预测的结果(图 2A) 显示，SfN8DT-1由一个包含9个α-螺旋和8个环的主体骨架以及一个长侧链组成。长侧链由近120个氨基酸组成，侧链的存在有可能会干扰酶本身的结构和功能。为了消除侧链对酶活性的影响，根据预测的结构，在侧链上选取了13个不同的位点，分别对其进行截短。以一株可以实现从头合成柚皮素的酿酒酵母菌株E32 (后面称为PN01) 作为出发菌株[22]，转入质粒pY26-SfN8DT-1和pSf-txx，获得菌株PN01-S和PN01-Sf-txx，在YPD培养中发酵120 h后，结果如图 2B和2C所示。在截短至E81位置后，8-PN的产量较对照增加，当截短至H59-K62时8-PN产量有大幅度的提高。可能H59-K62截短后对酶的结构影响较小。当截短到E91、Q99和T100这3个位点时，L5受到干扰(图 2A)，8-PN产量开始下降。而R101截短后，8-PN产量增加，说明L5的干扰会影响其酶活性，截短至D102和V110位置出现同样的情况。截短到D115-R122位置后，H7被破坏。推测H7可能参与了跨膜结构的形成。综上，截短至K62的8-PN产量最高，达到9.33 mg/L，相比于对照菌株提高了290%，命名为PN01-pSf-t62。
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| 图 2 SfN8DT-1不同位点截短对8-PN合成的影响 Fig. 2 Effects of truncation at different sites of SFN8DT-1 on 8-PN synthesis. (A) Predicted secondary structure of SfN8DT-1 by an online website. H: α-helix; L: loop. (B) 13 sites were selected and marked in red; pink predicted signal peptide (SP). (C) 8-PN titer of 13 truncated sites. |
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植物来源的PTs大多数具有信号肽，可将其引导至不同的细胞器，如线粒体、叶绿体、内质网等[14]。SfN8DT-1的N端具有一段定位至质体膜的定位序列[15]，而在酿酒酵母中没有此细胞器。因此，信号肽的存在可能会干扰蛋白质的催化活性。针对侧链的截短可能消除了信号肽对蛋白质的影响，从而显著地提高了8-PN产量。
2.2 SfN8DT-1-t62底物对接分析进一步对SfN8DT-1-t62进行分析。首先，采用与SfN8DT-1相同的方法进行结构预测。如图 3A所示，截短后的蛋白质侧链发生了明显的变化，但主要结构保持不变。然后，选择SfN8DT-1-t62作为模板，在AutoDock 4.2软件中进行蛋白质与底物柚皮素和DMAPP对接。如图 3B所示，柚皮素结合在一个大的空腔中，而DMAPP结合在柚皮素附近的一个较小的空腔中。如图 3B所示，柚皮素与Asn173、Asp177、Asn184、Lys185和Asp307这5个氨基酸形成氢键，DMAPP与Lys185、Glu312、Gly313和Lys316 (均为截短后所对应的氨基酸顺序) 4个氨基酸形成氢键。而Lys185 (K185) 同时与这两种配体形成氢键，猜测K185是一个关键的催化位点，可能参与了DMAPP与柚皮素的连接。
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| 图 3 SfN8DT-1-t62分子对接情况分析 Fig. 3 Molecular docking analysis. (A) Predicted secondary structure of SfN8DT-1-t62. (B) Molecular docking of SfN8DT-1-t62 with (2S)-naringenin and DMAPP. |
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进一步评估K185等潜在残基对整个催化反应的影响。首先，对两个配体0.5 nm范围内的氨基酸进行丙氨酸扫描突变。如表 3所示，只有K185突变为A时，其与配体的亲和力开始下降，结合能为0.68 kcal/mol，这可能表明K185是一种潜在的关键氨基酸。随后，通过对K185进行模拟饱和突变，旨在寻找一个能有效提高8-PN产量的突变体。当K185突变为W时，其与底物的亲和力增加，而当K185突变为G、E、S、T时，其与底物的亲和力下降。为进一步验证其准确性，构建K185点突变质粒并转化至菌株PN01中，获得菌株PN01-sf-t62K185X (X表示不同氨基酸)。结果如图 4所示，当K185突变为任一氨基酸时，8-PN产量均出现显著下降，甚至无法检测到。
| Mutation | Binding energy (kcal/mol) | Effect |
| N385 | –0.02 | Neutral |
| D177 | –0.01 | Neutral |
| D314 | –0.01 | Neutral |
| S321 | –0.01 | Neutral |
| N173 | 0 | Neutral |
| Q174 | 0 | Neutral |
| C176 | 0 | Neutral |
| D181 | 0 | Neutral |
| Y237 | 0 | Neutral |
| N238 | 0 | Neutral |
| W246 | 0 | Neutral |
| K248 | 0 | Neutral |
| P250 | 0 | Neutral |
| T253 | 0 | Neutral |
| A330 | 0 | Neutral |
| D187 | 0.01 | Neutral |
| K247 | 0.01 | Neutral |
| K306 | 0.01 | Neutral |
| D307 | 0.01 | Neutral |
| I319 | 0.01 | Neutral |
| I180 | 0.02 | Neutral |
| P309 | 0.02 | Neutral |
| M311 | 0.02 | Neutral |
| L188 | 0.04 | Neutral |
| D310 | 0.04 | Neutral |
| I183 | 0.05 | Neutral |
| F317 | 0.07 | Neutral |
| E312 | 0.21 | Neutral |
| K316 | 0.24 | Neutral |
| P186 | 0.29 | Neutral |
| G313 | 0.37 | Neutral |
| N184 | 0.43 | Neutral |
| K185 | 0.68 | Destabling |
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| 图 4 K185位点饱和突变发酵结果 Fig. 4 Fermentation result of saturated mutation of K185. |
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这一结果表明K185是异戊烯基化反应中不可或缺的关键位点。根据图 3中分子对接结果，K185同时与柚皮素和DMAPP形成氢键，但将其突变为任意氨基酸时，均造成8-PN产量下降。根据上述结果，可以猜测K185可能参与柚皮素和DMAPP的结合过程，并对8-PN合成至关重要。由于植物来源的PTs多为膜蛋白，且结晶相对困难，K185在PTs催化机制中的作用仍需要进一步实验解释。
2.4 DMAPP供给强化前体供应是目标产物合成的限制因素之一[9, 25-26]，在8-PN生物合成途径中，柚皮素和DMAPP这两种前体供应不足可能限制其产量的提高。以往的研究表明，柚皮素是8-PN生物合成的关键因素[18]，但本研究中，只有部分柚皮素被异戊烯基化(小于8%)。DMAPP更有可能成为异戊烯基化反应的限制因素。在酿酒酵母中，DMAPP主要由MVA途径合成[27]，过量表达关键基因tHMGR和IDI1是增加DMAPP补充的常用策略[28-29]。
本研究通过过表达tHMGR和IDI1，形成菌株PN04 (1拷贝tHMGR)、PN06 (1拷贝IDI1)、PN13 (1拷贝tHMGR和IDI1)，进一步转化质粒pSf-t62，分别形成PN04-sf-t62、PN06-sf-t62和PN13-sf-t62。结果如图 5所示，当过表达IDI1 (PN06-sf-t62) 基因时，8-PN的含量相对于对照菌株提高了60.99%，达到15.02 mg/L。当只过表达tHMGR基因(PN04-sf-t62) 时，8-PN的产量下降比较明显，可能由于tHMGR基因的强化更利于下游萜类化合物，如角鲨烯等的合成[30]，使得8-PN合成过程中DMAPP供给不足。当同时过表达IDI1和tHMGR (PN13-sf-t62) 时，发酵120 h 8-PN产量达到了31.31 mg/L，相比对照菌株提高了233.58%。
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| 图 5 过表达MVA途径关键基因 Fig. 5 Overexpressing key genes in MVA pathway. |
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结果表明强化DMAPP的供给可以显著提高8-PN的产量。HMGR催化的反应是MVA途径的限速步骤，该途径合成的IPP和DMAPP是萜类和固醇类化合物合成的重要前体。研究表明，过量表达HMGR有利于角鲨烯和麦角甾醇的积累[30-31]。可能单独强化HMGR的表达不利于DMAPP的积累，而同时过量表达HMGR和IDI1有利于DMAPP积累[32]。该结果暗示DMAPP是8-PN合成的限制因素之一。
2.5 5 L发酵罐水平验证将菌株PN13-sf-t62在5 L发酵罐中进行培养，并进行流加补料。接种16 h后开始流加补料，补料速度为5 mL/h，共补料300 mL。结果如图 6所示，发酵120 h后，8-PN的产量达到44.92 mg/L，OD600达到76.3。菌株PN13-sf-t62在5 L罐中扩大培养后，8-PN的产量进一步提高43.47%，与摇瓶中相比，8-PN产量在5 L罐中提升并不明显，可能由于异戊烯基转移酶基因是构建于质粒上进行表达，游离质粒在酿酒酵母中大约每代会丢失5%[33]，这是造成发酵后期产物增长缓慢的重要原因。
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| 图 6 PN13-sf-t62菌株在5 L发酵罐中的发酵结果 Fig. 6 Fermentation result of PN13-sf-t62 strain in a 5 L bioreactor. |
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8-PN是强有效的雌激素，具有多种生物活性，同时也是重要药物淫羊藿素合成的前体，具有非常重要的药用价值。目前，生物合成柚皮素取得十分重要的进展，如Gao等[10]通过不同表达强度的启动子组合优化柚皮素合成途径，最终柚皮素的产量在5 L罐中能够达到1.21 g/L。然而，生物合成异戊烯基化柚皮素的产量却十分低[18]，并且相关的报道较少，可能由于目前少有能够催化柚皮素异戊烯基化的酶的报道以及PTs本身较低的催化效率。
研究表明，在不同宿主中表达外源蛋白可能会导致蛋白活性的明显降低甚至是丧失活性，这可能成为天然产物生物合成的瓶颈[34]。PTs在生物合成8-PN过程中起到了关键作用，与UbiA超家族中的大多数PTs一样，SfN8DT-1是定位于叶绿体膜上的膜结合蛋白[15]，然而，酿酒酵母中没有这样的细胞器，这意味着其原始转运肽可能无法将SfN8DT-1转移到目标细胞器。这种本该被叶绿体信号肽酶切割的冗余序列很可能会干扰蛋白质的结构和功能[19]。对无序或冗余的蛋白质序列进行截短是改善其各种性质的常用方法[35-36]。
本研究通过在线网站预测了SfN8DT-1的二级结构，并根据预测结果选取了13位点分别进行截短。发现在不同位置的截短会对蛋白质功能产生不同的影响，相对于根据信号肽预测结果来随机截短，根据蛋白质结构进行截短，更能够清晰地了解截短对蛋白质结构及功能的影响。但是，具体机制仍需进一步的实验来解释。然后，通过分子对接、丙氨酸扫描等，分析并鉴定出了一个关键催化位点K185，该结果为后续SfN8DT-1催化机理的解析做出了铺垫。通过强化DMAPP的供给，显著提高了8-PN的产量，并发现DMAPP是影响8-PN生物合成的关键因素。最后，在5 L罐中进行发酵，8-PN的产量提高至44.92 mg/L。在本研究中，仍有大部分柚皮素未被消耗，说明从头合成8-PN具有很大的提升空间。后续实验可以通过改造PTs催化活性以及筛选具有高催化活性酶等策略，进一步提高8-PN的合成。此外，前体DMAPP的供给相对柚皮素可能更加重要，后续实验有必要进一步强化DMAPP的供给。本研究为高效生物合成8-PN提供了一定的参考价值。
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