2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 刘洪周, 杨思霞, 王楠, 刘海波, 李建昌
- LIU Hongzhou, YANG Sixia, WANG Nan, LIU Haibo, LI Jianchang
- 微生物电解池耦合厌氧消化过程中产甲烷代谢通量与微生物的关系
- The relationship between methane production metabolic flux and microorganisms in a microbial electrolytic cell coupled anaerobic digestion
- 生物工程学报, 2022, 38(5): 1889-1902
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(5): 1889-1902
- 10.13345/j.cjb.210593
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文章历史
- Received: August 4, 2021
- Accepted: October 17, 2021
- Published: November 3, 2021
引用本文
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微生物电解池(microbial electrolytic cell, MEC) 促进厌氧消化(anaerobic digestion, AD)，是目前厌氧消化领域的研究热点问题[1-3]。该技术不仅能固定AD体系内的CO2，还能极大地提高CH4转化率和沼气品质，这得益于AD的代谢网络中各代谢通量是由一系列微生物主导的[4]。此外，电压作为驱动MEC胞外电子传递和析氢反应的主要因子，在合适的电压作用下阳极表面能够富集大量的电活性微生物，同时电压对体系内菌群的演化具有调控作用[1]。典型的例子是，Ding等[5]研究外加电压对MEC中甲烷生成和微生物活性的影响中证实了微生物的代谢能力对电压的扰动较为敏感。
代谢通量分析(metabolic flux analysis, MFA) 是代谢过程及途径分析的一种强有力的分析技术[6]，在代谢通量研究中，MFA技术可对体系在环境扰动后的代谢能力做出预测，通过通量平衡分析(flux balance analysis, FBA) 不仅能预测代谢过程中未知的代谢途径，还能明确代谢产物的流量和流向[7]。因FBA在拟稳态假设下分析，且代谢反应按化学计量和质量平衡关系进行计算而被普遍应用[8]，MFA已成功地应用于赖氨酸、乳酸和乙醇等化合物的优化生产[9-10]。Gonzalez-Garcia等[11]曾利用混合培养的接种物降解葡萄糖产生H2，建立了比较完整的代谢通量网络，并计算出代谢网络的通量。Li等[12]曾在微生物发酵过程中丰富了希瓦氏菌(Shewanella oneidensis) 的代谢通量水平，从而提高了电化学反应过程中NADH/NAD+的总水平，明显加快了胞外电子传递速率。Rafieenia等[13]利用蔗糖、果糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖和核糖等6种不同碳源建立了丁酸梭菌代谢网络模型，研究了丁酸梭菌发酵制氢的过程，并计算出了NADH通量是影响H2产生的重要辅助因子。此外，根据报道提出“统一微生物”这一概念，即将体系内所有微生物看作一个统一的整体[8]，所涉及的生化反应照化学计量方式进行，同时国内外一些学者已经在部分体系中做了相应尝试，并取得相关成果[14]。因此，AD过程中消化能力和副产物的产率都可以利用通量分析技术进行直接表征[11]。
本研究旨在以葡萄糖为底物，以电解电压为扰动因子，采用基于质量守恒的MFA通量平衡分析的方法，探究MEC-AD产CH4代谢通量与微生物之间的关系，将有利于提高厌氧消化的目标产物，为生成特定产物提供调控手段。
1 材料与方法 1.1 实验装置MEC-AD反应器为有机玻璃圆柱形的单室反应器，有效体积为400 mL。反应器的阳极为石墨电极(30 mm×30 mm×2 mm)，阴极为纯pt电极(30 mm×30 mm×0.2 mm)，两电极对称放置，间距为3 cm，电极均浸没在发酵液中，参比电极(Ag/AgCl) 与阳极和阴极组成三电极体系。电极通过外电路与无纸记录仪(SIN-R7000A) 连接。
1.2 接种物实验中的接种物为以猪粪为底物驯化后的厌氧活性污泥。其pH值为7.71，总固体物(TS) 含量为15.12%，挥发性固体物(VS) 含量为8.26%。
1.3 实验方案实验分为2个阶段，第一阶段为培养阶段，即MEC-AD启动并达到拟稳态阶段。第二阶段为电压扰动阶段。
培养阶段：根据Shao等[15]的研究，实验初始培养条件为电解电压1.0 V，初始pH 7.0，温度30 ℃。启动时，在反应器中接种120 g厌氧活性污泥、180 mL磷酸缓冲溶液和10 mL微量元素溶液(缓冲溶液及微量元素溶液配制参照文献[16])，随后再加入蒸馏水使其总质量为400 g，底物葡萄糖加入量为1.0 g，控制浓度为2.5 g/L，此后当pH恢复至7.0以上时进行补料，每次补料量为1.0 g葡萄糖。实验运行前在反应器中通入氮气2 min，确保体系处于厌氧环境。培养过程中，反应器置于30 ℃恒温磁力搅拌器中。
扰动阶段：扰动电压为0.6 V和1.4 V，1.0 V为对照组，每组设置3组平行实验。实验中以体系培养达到拟稳态(实验通过电流值、pH值和电极电势来判断是否达到拟稳态[17-18]，相关研究表明，当体系产生电流，pH值在7.0附近波动且电势差维持在0.6 V左右时体系已达到拟稳态[14, 19-20]) 的各参数作为初态，并根据MEC-AD代谢网络中的中间产物(如挥发性脂肪酸、醇) 和最终产物选择关键代谢产物并计算其净生成速率[11, 14]，所检测的代谢产物为甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸、丙酮酸、戊酸、己酸、乙醇、丙醇、丁醇、CO2、CH4和H2，随后加入1.0 g葡萄糖运行14 h为终态(经14 h后1.0 g葡萄糖基本消耗殆尽)。
1.4 分析方法1) 电流、电压和pH值测定：电流和电压由宽屏物质记录仪(SIN-R7000A) 记录，pH值由pH计(PHS-3C) 直接读取，每24 h读取一次数据。
2) 气体成分测定：通过气相色谱仪(GC9790Ⅱ，浙江) 测定气体样品的组成，色谱柱为不锈钢填充柱，检测器为导热检测器(TCD)。测试条件为：TCD温度为200 ℃，柱箱温度为110 ℃，载气为高纯氮，进样口温度为200 ℃，进样量为200 μL。
3) 挥发性有机酸测定：采用GC9790Ⅱ (浙江，福立) 型气相色谱仪(色谱柱为KB-FFAP毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 m)，N2流速20 mL/min，H2流速40 mL/min，火焰离子化检测器(FID) 温度200 ℃) 进样2 μL，测定挥发性脂肪酸含量(乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸)。具体测量方法参考文献[21]。
4) 醇含量检测：通过气相色谱仪(GC9790Ⅱ，浙江) 测定样品的醇含量。检测条件为：宽量程火焰离子检测器(FID)，载气为N2 (纯度为99.999%)、H2 (纯度为99.999%) 和除水分的空气，柱箱初始温度为60 ℃，升温速度为20 ℃/min，进样温度为250 ℃，进样量为2 μL[22]。
5) 构建MEC-AD代谢网络：采用已明确的代谢途径作为参照构建MEC-AD代谢网络。据相关研究表明[23]，ED途径、EMP途径和PP途径的物质均流向丙酮酸，所以此代谢网络不考虑ED途径、EMP途径和PP途径。该代谢网络包含的代谢产物和代谢生化反应过程[11, 14, 23-24]如表 1所示。将表 1中37个代谢生化反应输入Cell Net Analyzer软件中构建MEC-AD体系的代谢网络。
| No. | Equation | No. | Equation | |
| R1 | Glu+PEP⇒G6P+Pyr | R20 | Pyr+2H2O⇒Ace+CO2+3H2 | |
| R2 | NADH+Pyr⇒Lac+NAD | R21 | But+2H2O⇒2Ace+2H2+H+ | |
| R3 | Pyr+NADH⇒NAD+For+AcCoA | R22 | Pyr⇒Pyr (ext) | |
| R4 | 2Fd+Pyr+CoA⇒CO2+AcCoA+2FdH | R23 | Eth+Pyr⇒Val (ext)+H2O | |
| R5 | 2Fd+NADH⇒2FdH+NAD | R24 | For⇒For (ext) | |
| R6 | NADPH+NAD⇔NADH+NADP | R25 | CO2⇒CO2 (ext) | |
| R7 | 2NADH⇒H2+2NAD | R26 | CO2+4H2⇒CH4+2H2O | |
| R8 | 2FdH⇒H2+2Fd | R27 | H2⇒H2 (ext) | |
| R9 | Lac⇒Lac (ext) | R28 | 2AcCoA+H2⇒Pro (ext)+2CoA+CO2 | |
| R10 | Lac+NADH⇒Pyr+NAD | R29 | Ace⇒CO2+CH4 | |
| R11 | For⇒CO2+H2 | R30 | Ace⇒Ace (ext) | |
| R12 | AcCoA+ADP+iP→ATP+Ace+CoA | R31 | Eth⇒Eth (ext) | |
| R13 | AcCoA+2NADH⇒Eth+CoA+2NAD | R32 | But+Eth⇒Hex (ext)+H2O | |
| R14 | 2AcCoA+NADH⇔CoA+H2O+CroCoA+NAD | R33 | But⇒But (ext) | |
| R15 | CroCoA+2Fd+NADH⇒ButCoA+2FdH+NAD | R34 | But+2NADH⇒But (ext)+CoA+2NAD | |
| R16 | CroCoA+NADH⇒ButCoA+NAD | R35 | Pyr⇔Pyr (ext) | |
| R17 | ButCoA+ADP+iP⇒But+ATP+CoA | R36 | CH4⇒CH4 (ext) | |
| R18 | 2CO2+4H2⇒Ace+2H2O | R37 | 2H++2e–⇒H2 | |
| R19 | Eth+2H2O⇒4H++Ace | |||
| Glu: glucose; G6P: glucose 6 phosphate; Pyr: pyruvate; NADH: reduced coenzyme Ⅰ; Lac: lactic acid; For: formic acid; AcCoA: acetyl coenzyme A; CoA: coenzyme A; Fd: ferredoxin; NADP: oxidized coenzyme Ⅱ; Ace: acetic acid; Eth: ethanol; CroCoA: crotonyl-CoA; ButCoA: butyryl-CoA; iP: PO4–; But: butyric acid; Val: valeric acid; Hex: hexanoic acid; Pro: propionic acid; ext: means extracellular. | ||||
6) 16S rRNA：扰动结束后，从MEC-AD体系中分别取出微生物样品，并储存于–80 ℃超低温冰箱中。微生物样品委托诺禾致源基因公司进行高通量测序及数据优化分析。选取丰度Top20的微生物基于R语言的psych、pheatmap和reshape2包计算微生物丰度与代谢物之间的相关性及显著性，通过R代码输出微生物丰度与代谢物之间的关系热图。此外，选取丰度Top10的微生物基于R语言的psych包计算种间相关性，并选取相关系数大于0.9的边作为有效连接，利用Gephi0.9.2构建物种互作网络[25-26]。
2 结果与讨论 2.1 产甲烷代谢通量的变化特征 2.1.1 代谢产物净生成速率的变化如图 1所示，电流和pH值均呈锯齿形变化，其原因与投料时间及VFAs浓度有关[24, 27]，培养至第20天以后变化趋势趋于稳定，电流在1–8 mA范围内变化，pH值在6.8–7.2范围内变化，均属于MEC-AD正常运行参数范围内[14, 19]。在图 2中，阳极电势和阴极电势呈逐渐下降趋势，电势差维持在600 mV左右。据文献报道[20]，当电势差达到600 mV左右时体系已达到拟稳态。图 1和图 2的数据表明，MEC-AD体系已达到拟稳态且阳极膜已基本形成[28]，微生物新陈代谢和繁殖迭代已经达到动态平衡[29]，已满足MFA拟稳态的分析要求[30]。
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| 图 1 电流和pH值随时间变化 Fig. 1 Profile of current and pH. |
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| 图 2 电极电势随时间变化 Fig. 2 Profile of electrode potential. |
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扰动14 h后提取发酵液进行代谢产物检测，并计算净生成速率，结果如表 1所示。由表 1可知，电压扰动后，CH4、H2和乙醇的净生成速率均发生了显著的变化。乙醇净生成速率在负向(0.6 V) 和正向(1.4 V) 扰动时分别为0.010±0.002和0.016±0.007，较1.0 V分别降低了42%和7%。H2净生成速率在负向和正向扰动时分别为0.024±0.014和0.004±0.002，较1.0 V分别降低了13%和86%。此外，电压无论是正向扰动还是负向扰动，CH4、甲酸、丙酮酸及CO2净生成速率均显著升高，其中CH4的净生成速率在负向和正向扰动时分别为0.522±0.052和0.395±0.029，较1.0 V分别提高了77%和34%。特殊地是丙酸的净生成速率随电压负向扰动而降低，正向扰动时响应并不明显。其本质是MEC-AD体系中各代谢途径的通量发生了变化，原因与电压扰动后微生物做出不同的响应有关[23, 31-33]，表明通过改变电压可调控相关产物的净生成速率。
2.1.2 代谢通量的变化特征根据表 2测量数据输入Cell Net Analyzer软件做出如图 3所示的电压扰动下MEC-AD产CH4代谢通量分布图。结果以H2、CH4和CO2进行分析，如图 3所示，MEC-AD产CH4代谢途径包括氢营养型产CH4途径(R26) 和乙酸转化途径(R29)。电压扰动后，通过单因素方差分析表明，阴极表面平均产氢通量(R37) 为2.431 4，显著(P＜0.01) 高于NADH平均产氢通量(R7) 的0.705，不同电压扰动时平均有77.5%的H2由MEC阴极产生。在对照组1.0 V时R37产氢通量为2.640，高于扰动组0.6 V和1.4 V的2.118和2.536，表明1.0 V电压条件下有利于增强游离H+在阴极表面的得电子能力，其原因可能是适当的电压促进电活性微生物在阳极表面生长代谢有关[34]。然而，最终产物中H2通量(R27) 却只有R37产氢通量为0.76%±0.43%，1.4 V扰动时通量值低至0.004，研究表明，乳酸的产生不利于H2的生成[34]，1.4 V扰动时乳酸通量增大，这可能是导致1.4 V时H2通量(R27) 最低的原因。此外，在培养阶段也未检测到大量的H2成分(图 4)，其原因还与耗氢节点有关。图 3中产CH4代谢节点(R26) 和产乙酸代谢节点(R18) 都是耗氢节点[10]，在0.6 V、1.0 V和1.4 V条件下，H2还原CO2产CH4通量(R26) 分别占35%、37%和40%，产乙酸通量(R18) 分别占24.69%、28.99%和27.59%，表明大量的H2被用于还原CO2产甲烷或乙酸。此外，图 4为1.0 V条件下培养阶段测得的气体含量，数据显示CO2含量逐渐降低，CH4含量逐渐升高，而H2含量几乎为零，实测数据与通量分布信息相一致。
| Metabolites | Experimental group | P-value | ||
| Control group (1.0 V) (mmol/(L·h)) | Experimental group (0.6 V negative disturbance) (mmol/(L·h)) | Experimental group (1.4 V forward disturbance) (mmol/(L·h)) | ||
| Glucose | 1.127±0.015 | 1.128±0.006 | 1.128±0.018 | |
| Formic acid | 0.003±0.000 | 0.009±0.002 | 0.010±0.003 | * |
| Acetic acid | 0.751±0.144 | 0.556±0.077 | 0.711±0.120 | |
| Propionic acid | 0.106±0.010 | 0.092±0.005 | 0.106±0.002 | * |
| Butyric acid | 0.418±0.034 | 0.449±0.039 | 0.405±0.020 | |
| Lactic acid | 0.011±0.005 | 0.009±0.004 | 0.013±0.006 | |
| Pyruvic acid | 0.016±0.004 | 0.036±0.007 | 0.027±0.017 | * |
| Pentanoic acid | 0.023±0.011 | 0.011±0.005 | 0.029±0.009 | |
| Caproic acid | 0.000±0.000 | 0.000±0.000 | 0.000±0.000 | |
| Ethanol | 0.017±0.001 | 0.010±0.002 | 0.016±0.007 | ** |
| Propyl alcohol | 0.000±0.000 | 0.000±0.000 | 0.000±0.000 | |
| Butanol | 0.000±0.000 | 0.000±0.000 | 0.000±0.000 | |
| CO2 | 0.226±0.023 | 0.240±0.038 | 0.274±0.007 | * |
| CH4 | 0.295±0.013 | 0.522±0.052 | 0.395±0.029 | ** |
| H2 | 0.028±0.023 | 0.024±0.014 | 0.004±0.002 | ** |
| P-value represents the criterion for whether a factor has a significant effect on the experimental results. When P-value≤0.01, it indicates that the influence of factors on the results is very significant. When 0.01＜P-value≤0.05, it indicates that the factors have a significant impact on the results. | ||||
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| 图 3 电压扰动的MEC-AD产CH4代谢途径及通量分布 Fig. 3 Metabolic pathway and flux distribution of MEC-AD methane production upon voltage perturbation. |
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| 图 4 1.0 V培养阶段气体含量和日产气量随时间变化 Fig. 4 Gas content of the 1.0 V culture and the profile of daily gas production. |
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图 3中乙酸可以从R12、R18、R19、R20和R21途径中得到，1.4 V扰动下乙醇转化为乙酸的通量增大，丁酸转化为乙酸的通量较0.6 V有所降低，其通量大小受电压及多种微生物共同影响，表明相关微生物随电压改变而做出响应，其实质是不同电压扰动下特定微生物控制特定产物的代谢通量[35]。如图 3所示，在0.6 V、1.0 V和1.4 V条件下分别有65%、63%和60%的CH4由乙酸转化途径(R29) 得到。对照组1.0 V及0.6 V和1.4 V扰动组中乙酸转化为CH4的量分别占总乙酸通量的20.85%、37.19%和24.95%，约有2/3的乙酸仍然累积在体系内，在1.0 V条件下培养阶段的数据也证实了乙酸的累积(图 5)。表明产甲烷菌在0.6 V扰动时最为活跃，致使乙酸转化为CH4的量增加。
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| 图 5 1.0 V培养阶段挥发性脂肪酸随时间变化 Fig. 5 Profile of volatile fatty acids of the 1.0 V culture. |
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通过高通量测序技术获得生物膜及发酵液中的微生物群落，进一步分析产甲烷代谢通量与微生物群落的关系。如表 3、图 6所示，F0.6、F1.0和F1.4组的操作分类单元(operational taxonomic units, OTU) 数分别为2 728、2 089和2 195，FF0.6、FF1.0和FF1.4组的OTU数分别为1 273、1 305和1 320。显然阳极膜微生物比发酵液更丰富，且电压扰动下阳极膜微生物群落变化显著(0.01＜P-value＜0.05)。OTU的独特差异归因于MEC-AD中电压扰动的影响。如图 7所示，0.6 V扰动下Top10的微生物较1.0 V和1.4 V存在更紧密的互作关系，随电压升高竞争关系和协同关系均减弱。相关研究表明，紧密的互作关系更具有底物竞争力[36]，因此0.6 V扰动时物种间较强的协同关系(如产甲烷菌和产氢产乙酸菌的协同关系等) 可能是产甲烷通量增大的原因。
| Anodic film | Fermented liquid | |||
| Samples | Grouping | Samples | Grouping | |
| Initial state | S | Initial state | FS | |
| 0.6 V disturbance | F0.6 | 0.6 V disturbance | FF0.6 | |
| 1.4 V disturbance | F1.4 | 1.4 V disturbance | FF1.4 | |
| 1.0 V undisturbed | F1.0 | 1.0 V undisturbed | FF1.0 | |
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| 图 6 阳极膜微生物的OTU和发酵液微生物的OTU Veen图 Fig. 6 OTU diagram of anodic membrane microbes and OTU Veen diagram of fermentation broth microbes. |
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| 图 7 阳极膜微生物互作差异比较 Fig. 7 Comparison of microbial interactions on anodic membrane. The size of the nodes in the figure indicates the relative abundance of microbes, the dotted line indicates positive correlation (synergy), and the solid line indicates negative correlation (competition). |
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在属水平上进一步分析物种丰度与产甲烷通量之间的关系，如图 8A所示，三氯单胞菌(Trichloromonas) 在阳极膜表面占主导，在F0.6、F1.0和F1.4组中的相对丰度分别为40%、27%和36%。根据Shao等[15]以葡萄糖为底物进行MEC制氢时发现H2产率与阳极表面微生物丰度呈正相关的研究，推测Trichloromonas可能是与H2通量有关的特征微生物。
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| 图 8 微生物属相对丰度堆积图 Fig. 8 Stacking diagram of relative abundance of microorganisms. (A) The relative abundance of microbes on the surface of anode membrane. (B) The relative abundance of microbes in fermentation broth. |
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如图 8B所示，毛球菌(Trichococcus) 是发酵液中的优势菌属，在FF0.6扰动组中相对丰度为26%低于FF1.0组的27%和FF1.4组的38%，Trichococcus参与了碳水化合物转化为乳酸和乙酸等过程[37]，因此从通量平衡来看，总乙酸通量(R29+R30) 存在1.4 V (0.949)＞1.0 V (0.939)＞0.6 V (0.896) 的关系，乳酸通量(R9) 也具有相同的特征，即1.4 V (0.013)＞1.0 V (0.011)＞0.6 V (0.009)。因产氢通量和产乙酸通量与产甲烷通量直接相关，表明产甲烷通量的变化与Trichloromonas和Trichococcus的丰度有关。此外，无论是阳极生物膜还是发酵液都存在梭菌属、甲烷鬃菌属、噬氢菌属和噬蛋白菌属等。
特殊的是，图 3中数据显示，阴极产氢通量(R37) 的变化特征1.0 V (2.640)＞1.4 V (2.536)＞0.6 V (2.118) 与H2还原CO2的总通量(R18+R26) 的变化特征1.0 V (0.478)＞1.4 V (0.354)＞0.6 V (0.320) 一致，但与H2还原CO2产甲烷通量(R26) 的变化特征1.0 V (0.110)＜1.4 V (0.158)＜0.6 V (0.183) 和产甲烷通量(R36) 的变化特征1.0 V (0.297)＜1.4 V (0.395)＜0.6 V (0.522) 却不尽相同。其原因是H2还原CO2的产物为甲烷或乙酸，其中H2还原CO2产甲烷通量与氢营养型产甲烷菌(如甲烷杆菌(Methanobacterium) 和甲烷短杆菌(Methanobrevibacterium) 等) 的丰度有关，H2还原CO2产乙酸通量与同型产乙酸菌(如梭菌属(Clostridium) 等) 的丰度有关[38]。如图 8所示，Methanobacterium是MEC-AD体系中的氢营养型产甲烷菌，其总丰度(阳极膜表面Methanobacterium的丰度与发酵液中Methanobacterium的丰度之和) 在1.0 V、1.4 V和0.6 V时存在1.0 V (6%)＜1.4 V (9%)＜0.6 V (10%) 的关系，与H2还原CO2产甲烷的通量关系一致。同样地，同型产乙酸菌的丰度与H2还原CO2产乙酸通量(R18) 也存在类似的关系，即同型产乙酸菌的丰度关系为1.0 V (12%)＞1.4 V (10%)＞0.6 V (9%)，R18途径的通量关系为1.0 V (0.368)＞1.4 V (0.196)＞0.6 V (0.137)，表明MEC的引入强化了H2还原CO2的量，但还原产物的通量将会根据特定功能微生物的丰度进行分配。此外，在产甲烷菌能够直接利用的底物充足时，产甲烷通量(R36) 由产甲烷菌的丰度决定[38]，在MEC-AD体系中R36途径的通量是产甲烷的总通量，其通量值受乙酸浓度、H2分压和产甲烷菌丰度等因素共同影响[38]，因此仅考虑其中某个因素与产甲烷通量(R36) 存在何种特定关系尚不清楚，有待进一步研究。
如图 9所示，采用P-value＜0.01且相关系数大于0.6或小于–0.6的数据进行讨论。理研菌(Petrimonas)、互营单胞菌(Syntrophomonas)、拟杆菌(Blvii28)、假单胞菌(Acinetobacter)、梭菌(Tuzzerella)、球形螺旋菌(Sphaerochaeta)的丰度对CH4通量有显著影响，其中CH4通量与Petrimonas、Syntrophomonas、Blvii28、Acinetobacter的丰度呈正相关，与Tuzzerella、Sphaerochaeta的丰度呈负相关。而产CH4通量受代谢网络中乙酸通量及H2通量等多个代谢环节的影响[17]，毛螺旋菌(Lachnospiraceae) 的丰度对乙酸通量有显著影响，且呈正相关，乙酸通量多受产氢产乙酸菌或同型产乙酸菌的影响。Petrimonas、Syntrophomonas、Blvii28、Acinetobacter、Clostridium、紫单胞菌(Proteiniphilum)、Tuzzerella、芽孢杆菌(Terrisporobacter) 的丰度对H2通量有显著影响，其中H2通量与Petrimonas、Syntrophomonas、Blvii28、Acinetobacter的丰度呈正相关，与Tuzzerella、Terrisporobacter的丰度呈负相关，与H2通量相关的微生物多为Acinetobacter和Clostridium等电活性微生物[39]。数据表明不同微生物影响不同代谢物的通量，其中影响产H2通量和产CH4通量的物种具有相似性，多为拟杆菌属、梭菌属、假单胞菌属和厚壁菌属。奇怪的是，实验中并未检测到大量的产甲烷菌存在，因此在MEC-AD体系中H2还原CO2途径显得尤为重要[40]。产甲烷菌丰度较小也导致了体系中转化为CH4的乙酸通量较小，仅占总乙酸通量的27.68%±6.9%。
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| 图 9 物种与代谢产物的相关性及显著性分析热图 Fig. 9 Heat map of correlation and significance analysis between species and metabolites. |
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通过上述讨论得到以下结论：CH4的净生成速率在0.6 V扰动和1.4 V扰动时较1.0 V分别提高了77%和34%，0.6 V、1.0 V和1.4 V条件下产CH4通量分别由35%、37%和40%的H2还原CO2途径和65%、63%和60%乙酸转化(R29) 途径得到，平均有77.53%的H2由阴极产生。此外，电压扰动能够改变电极生物膜物种多样性及互作关系，其中0.6 V扰动时，物种多样性最高(OTU为2 728)，互作关系最紧密且产CH4通量最大(0.522)。Petrimonas、Syntrophomonas、Blvii28、Acinetobacter、Tuzzerella、Sphaerochaeta的丰度对CH4通量有显著影响(P-value＜0.01)，而影响产H2通量和产CH4通量的物种具有相似性。表明通过改变系统电压可调控相关产物的净生成速率。
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