1 CRISPR-Cas系统简介

成簇的规律间隔的短回文重复序列相关蛋白系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats associated proteins system, CRISPR-Cas) 是原核生物用来抵抗外来遗传物质(如噬菌体、质粒) 入侵的后天免疫防御体系^[1-2]。依据Cas编码的效应子模块，目前将CRISPR-Cas系统分为两大类^[3]。1类系统含有多个Cas蛋白组成的效应复合物，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型；2类系统仅有单个Cas蛋白作为效应器，比如Ⅱ型的Cas9蛋白、Ⅴ型的Cas12蛋白以及Ⅵ型的Cas13蛋白。

目前，较为人熟知的基因编辑系统是Ⅱ型CRISPR-Cas系统，也就是CRISPR-Cas9系统。自发现以来，因其操作便捷、成本低及特异性高等优点而被广泛应用，但它的不足之处——脱靶效应(off-target effects) 限制了其应用^[4]。CRISPR/Cas9系统中的向导RNA (single guide RNA, sgRNA) 是一段通过与靶DNA片段匹配，从而介导Cas9蛋白对基因组进行识别的RNA序列。Gupta等发现^[5]，sgRNA会与非靶点DNA序列错配，引入非预期的基因突变，即脱靶效应。

CRISPR-Cas13a系统则具有更强的特异性，可以靶向识别并切割RNA，其仅靶向RNA的能力为靶向DNA的CRISPR-Cas9系统提供了重要补充。CRISPR-Cas13a属于2类Ⅵ型蛋白，除了能够靶向和降解RNA之外，该系统还能实现对DNA或RNA的高效特异性检测，灵敏度达到阿摩尔级别(10^–18 mol/L)，可用于病原体的精准检测、癌症的早期诊断以及遗传性疾病的治疗等，是RNA研究领域的又一项卓越成果，具有重要的研究意义及巨大的应用潜力。

2 CRISPR-Cas13a系统基本原理

CRISPR-Cas13a (旧称C2c2) 系统是一种由RNA介导的RNA核酸内切酶。Cas13a系统较为简单，只需要一个Cas13a蛋白、crRNA分子以及目标序列即可产生效应^[6]。

CRISPR-Cas13a系统主要由Cas13a蛋白发挥作用，Cas13a与crRNA的重复序列结合并组成复合物。迄今为止研究的Cas13a蛋白均具有两种不同的核糖核酸酶活性^[7]，一种是负责处理前体crRNA的核糖核酸酶活性，辅助crRNA与Cas13a蛋白组装为成熟的干扰复合物；另一种是由高等真核生物和原核生物核苷酸结合域(higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide- binding domain, HEPN) 提供的核糖核酸酶活性。Cas13a含有两个HEPN，对Cas13a发挥切割RNA序列的功能是必需的。在Cas13a不结合靶向单链RNA时，不存在切割RNA序列的活性；但当Cas13a与crRNA的复合物结合靶向单链RNA时，crRNA的间隔序列与靶向RNA互补配对，触发核糖核酸蛋白(ribonucleoprotein, RNP) 复合物的构象变化，两个HEPN结构域靠近，从而形成一个催化位点^[8]。由于此位点与crRNA靶向的RNA双链体有一定距离，因此会引起crRNA与Cas13a蛋白的构象变化，激活Cas13a切割靶RNA的活性，使其不仅切割靶RNA，而且切割其他任意的单链RNA，包括宿主自身的非靶标RNA，这一特征称为Cas13a的附带切割活性(collateral cleavage)^[9]。因此，基于Cas13a高效的RNA酶切活性及其附带的切割活性，CRISPR-Cas13a系统可作为一个强大的基因表达调控工具与mRNA检测工具，在各类重大疾病的快速检测、诊断治疗以及基础研究领域都具有广阔的应用前景。

3 CRISPR-Cas13a系统的基因调控功能 3.1 CRISPR-Cas9系统DNA编辑的局限性

虽然目前已有不少关于CRISPR-Cas9系统应用于基因编辑的研究，但遗憾的是，Cas9系统仍具有一定的局限性。如空肠弯曲菌^[10]在感染人体细胞后，会向细胞质分泌无向导Cas9 (Campylobacter jejuni Cas9, CjeCas9) 核酸酶，天然核定位信号使CjeCas9定位至细胞核，并在此催化非靶向DNA裂解导致细胞死亡。尽管可以通过修饰Cas9系统，增加其可控性和靶向能力，但它依然具有脱靶效应及单链DNA (single-stranded DNA, ssDNA) 裂解的风险。由于针对DNA进行编辑，CRISPR-Cas9系统可能会对细胞内部某些关键基因造成不可逆的损伤。因此，相较于CRISPR-Cas9系统，CRISPR-Cas13a仅靶向RNA的特性更为安全。

3.2 CRISPR-Cas13a系统的RNA调控功能

CRISPR-Cas13a只靶向RNA的特异性，保证了其对RNA的定点调控，并且不改变编码基因本身。由于DNA碱基序列没有发生改变，因此，基因表达的调控在时间、空间和效率上都更加可控。同时，CRISPR-Cas13a系统靶向RNA时，可以同时靶向修饰多个基因及多拷贝基因的转录产物，这可能比DNA编辑更为高效。

Cas13a系统的RNA靶向特性可在基因表达调控方面发挥RNA编辑作用。Jing等^[11]尝试将Cas13a改造成精确定点的RNA调控工具，他们在模式生物裂殖酵母中实现了CRISPR-Cas13a靶向内源RNA并降解靶标RNA的功能，将无RNA切割活性的Cas13a蛋白(deactivated Cas13a, dCas13a) 与人源的RNA腺嘌呤脱氨酶催化结构域(hADAR2d) 融合成一种RNA调控系统。此系统可靶向mRNA并精确编辑特定的核苷酸残基。研究表明，该系统在编辑随机选择的内源基因转录本中具有实用性，其对内源RNA的精确定点调控，体现了CRISPR-Cas13a具有通过类似RNA干扰(RNA interference, RNAi) 的途径发挥基因治疗的潜力。同时，该系统仅靶向RNA的特点还可以应用于对某些逆转录病毒的干扰。通常，在转录水平抑制基因表达的技术还有RNA干扰技术，但是该技术会产生大量非特异性的脱靶效应。相较于此，CRISPR-Cas13a系统对靶RNA可表现出更好的降解效应及更显著的特异性^[12]。

4 CRISPR-Cas13a系统在疾病检测中的应用

Gootenberg等^[13]建立了一个基于CRISPR- Cas13a系统的分子检测平台，命名为特异性高灵敏度酶报告系统(specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking, SHERLOCK)，该系统是重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA) 技术与CRISPR技术的完美结合。RPA技术是一种利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，在等温条件下(37–42 ℃) 进行核酸扩增的技术，可克服传统PCR扩增方法在灵敏度和特异度等诸多方面的不足，简化了对仪器的要求、缩短了反应时间，特别是在临床、基层和即时检测(point-of-care testing, POCT) 时显示出突出的优越性。

该系统首先将目的核酸(DNA或RNA) 经过RPA进行扩增，再经过T7体外转录，转录后的RNA可被Cas13a与crRNA识别并结合，诱发Cas13a的附带切割效应，剪切RNA荧光报告探针并发出荧光。通过荧光信号可检测目的序列，因此该技术可用于体外检测目的核酸。

Wang等^[14]建立了结合PCR扩增的CRISPR- Cas13a检测系统(简称PCR-CRISPR)，对312份血清标本的乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV) DNA序列进行检测，发现其中302份标本与实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR, qPCR) 结果一致，其余10份HBV-DNA低水平阳性的样本，仅可被PCR-CRISPR检测到。

2018年，第二代SHERLOCK检测系统开发完成^[15]。相较于第一代，二代SHERLOCK在以下4个方面更为突出：(1) 检测水平低至10^–21 mol。(2) 将Cas13a与CsmⅥ (辅助CRISPR相关酶) 结合，从而提高灵敏度。(3) 添加横向流动条带，可以直接观察检测结果。(4) 4类不同的CRISPR酶可在同一体系下完成相互独立的反应，以此完成针对4个靶点的多通路检测。改良的二代SHERLOCK检测系统能同时检测出经稀释的寨卡病毒及登革热病毒的单链RNA (single-stranded ribonucleic acid, ssRNA)。

2019年底至今，SARS-CoV-2新型冠状病毒引起的COVID-19肆虐全球。Joung等^[16]开发了针对新型冠状病毒检测的SHERLOCK系统。另外，Patchsung等^[17]利用SHERLOCK检测了154个鼻咽和咽拭子样本中是否存在新型冠状病毒，灵敏度为96%，特异性为100%。STOP (SHERLOCK testing in one pot)^[18]作为改良版的SHERLOCK，最低检测下限为100个新型冠状病毒拷贝，与RT-qPCR检测方法相比具有同等的敏感性。令人振奋的是，Fozouni等^[19]进一步发明了联合智能手机的CRISPR-Cas13a免扩增方法，用于检测新型冠状病毒，整体检测流程更加便捷。但SHERLOCK诊断系统在COVID-19的病毒核酸检测中的应用正处于发展阶段，仍需进一步优化。

5 CRISPR-Cas13a系统在肿瘤诊断与治疗中的作用 5.1 CRISPR-Cas13a用于肿瘤的早期诊断

在肿瘤的诊断中，相较于传统的肿瘤检测方法，检测外周血的游离DNA (cell free DNA, cfDNA) 和微小RNA (microRNAs, miRNA) 可进行癌症的早期诊断。

5.1.1 cfDNA的检测

肿瘤相关标志物可反映肿瘤的发生发展，如cfDNA是人体组织排放到血液里的DNA片段，其中循环肿瘤游离DNA (circulating tumor DNA, ctDNA) 具有肿瘤突变成分的特征，能够作为癌症早期筛查的分子标记物^[20-21]。

cfDNA的传统检测方法是基因测序技术，包括Sanger测序法、二代测序和数字PCR。Gootenberg等^[13]利用SHERLOCK系统检测微摩水平的单链ctDNA，可检测出两种不同的突变等位基因包括表皮生长因子受体L858R和鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1 V600E。第二代SHERLOCK的灵敏度则更高，能成功检测出非小细胞肺癌患者cfDNA标本中EGFR L858R突变和EGFR 19号外显子缺失突变。另外，目前已有研究发现，胃癌患者的血浆cfDNA浓度显著升高，虽与传统肿瘤生物标志物无显著相关性，但与化疗疗效呈负相关。因此，血浆cfDNA浓度可作为胃癌诊断与疗效判断的潜在指标^[22]。

5.1.2 miRNA的检测

在肿瘤细胞中，miRNA是参与调控肿瘤细胞增殖等的重要因素。已知miRNA与靶mRNA互补配对可调控靶mRNA的降解，进而影响基因表达，调控正常细胞的增殖、分化及凋亡^[23]。例如抑癌性miRNA的缺失会增加其靶向癌基因的表达效率，而其他类型的miRNA，如miR-155对Burkitt淋巴瘤有正向调控作用。因此，某些参与调控肿瘤细胞活动的miRNA同样有可能成为癌症早期诊断的有效工具^[24]。

检测miRNA水平的传统方法包括DNA微阵列技术、RNA测序方法以及RT-qPCR。利用Cas13a/crRNA检测系统，同样可实现对miRNA的检测。Shan等^[25]利用LbuCas13a，即毛螺科菌的NK4A179表达的Cas13a蛋白，直接检测到肿瘤的miRNAs。对于Cas13a检测体系的特异性，可通过设计不同的crRNA以鉴别出单核苷酸变异，包括位于miRNA序列末端的变异。

在Cas13a检测肿瘤miRNA的实际应用中，Huang等^[26]联合Cas13a和电化学技术，利用电化学发光技术(electrochemiluminescence, ECL)，构建了一种CRISPR-Cas13a驱动的ECL芯片(PECL-CRISPR)，其原理是目标肿瘤miRNA激活Cas13a后，触发指数级放大程序和ECL检测信号。在最适条件下，选用的miR-17的检测限达到10^–15 mol/L，通过合理设计crRNA，该平台可以提供单核苷酸分辨性，从而显著区分miRNA靶点与其高度同源的家族成员。

为了增加CRISPR-Cas13a实际的应用价值，已经开发了多种基于Cas13a系统的快速诊断平台。Bruch等^[27]报道了一种基于CRISPR-Cas13a系统的电化学微流控生物传感器系统，可用于检测脑肿瘤患者血清样本中的miR-19b，9 min内可准确测量体积小于0.6 µL的样品，灵敏度可达10 pmol/L。

由此可见，CRISPR-Cas13a系统作为一种快速检测核酸的诊断工具，能用于肿瘤相关疾病的早期诊断，具有低成本和易于开展使用的优点，并且耗时短、灵敏度高，在多重靶分子的检测中亦有巨大的潜力。

5.2 CRISPR-Cas13a用于肿瘤的治疗

除了检测肿瘤标志物，CRISPR-Cas13a系统还可在肿瘤治疗中发挥作用。癌基因(oncogene) 是指与细胞的肿瘤性转化有关的基因，其异常表达往往引起肿瘤的发生。总体上，CRISPR-Cas13a系统主要通过特异性识别并降低癌细胞中癌基因的mRNA的表达，产生可控的附带切割作用，从而诱导癌细胞程序性死亡等，达到抑制肿瘤生长的目的。

5.2.1 胰腺癌

突变的KRAS是胰腺癌中已知的驱动癌基因，Zhao等^[28]证明了CRISPR-Cas13a系统经改造后可以用于KRAS突变胰腺癌的靶向治疗。研究者先在crRNA靶双链中引入一个单错配，使CRISPR-Cas13a系统能够特异性识别KRAS-G12D mRNA，而对于野生型KRAS mRNA的检测没有产生影响。之后对于KRAS基因突变的胰腺癌细胞，CRISPR-Cas13a系统同样可以特异性地降低突变KRAS基因mRNA的表达，并引起细胞凋亡，在动物模型内引起了肿瘤的显著缩小。

5.2.2 宫颈癌

高危型人乳头瘤病毒(high-risk human papillomavirus, HR-HPV) 如HPV16和HPV18亚型的持续感染，是宫颈癌的主要病因^[29]。CRISPR-Cas13a能下调针对肿瘤细胞中HPV的核酸序列表达。Chen等^[30]通过设计特异的crRNA，使Cas13a系统可以靶向HPV16/18的E6/E7 mRNAs。实验结果表明，特异性的CRISPR/Cas13a系统能有效并且特异地下调HPV16/18的E6/E7 mRNAs的转录，诱导HPV16阳性SiHa细胞和HPV18阳性的HeLa细胞生长抑制和凋亡。因此，通过CRISPR/Cas13a系统靶向HPV E6/E7 mRNAs可提供HPV相关宫颈癌的一种治疗策略。

5.2.3 胶质瘤

CRISPR-Cas13a系统能针对性地影响肿瘤细胞癌基因的表达。Wang等^[31]首次在真核生物中发现了CRISPR-Cas13a对肿瘤细胞的附带切割作用。在胶质瘤细胞EGFRvⅢ亚型中，CRISPR-Cas13a系统靶向突变的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因，特异性降低EGFR的mRNA的表达并产生附带切割效应。同时，研究者还观察到，在小鼠动物模型中小鼠脑胶质瘤的形成减弱，肿瘤的血管生成也有减缓。该研究表明，合理利用CRISPR-Cas13a系统靶向调节癌基因的转录是治疗肿瘤的一种潜在方法。

5.2.4 膀胱癌

在靶向癌基因的基础上，如果使细胞内Cas13a蛋白的表达具有可控性，则反应更易控制。Qi等^[32]将光开关系统作为基本构建体，并将Cas13a蛋白的DNA序列作为插入的表达基因，构建了一个结合CRISPR-Cas13a表达的光开关系统。在蓝光的诱导刺激下，膀胱癌5637和T24细胞株被诱导表达大量的Cas13a蛋白，并将转移相关肺腺癌转录物1 (metastasis- associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1) 作为靶点进行切割。研究者利用荧光报告法和qRT-PCR来检测基因MALAT1的表达情况。结果显示，结合了CRISPR-Cas13a表达的光开关系统可以有效抑制基因MALAT1的表达。因此，通过可控CRISPR-Cas13a在一定时间或空间上调节癌基因mRNA的转录，可作为肿瘤精确治疗的新策略。

6 总结与展望

基于CRISPR-Cas13a系统开发的核酸检测技术的高灵敏度和高特异性，在肿瘤相关标志物的快速检测和致癌突变的靶向治疗中，该系统具有可观的应用潜力。但脱靶效应的存在说明这些新开发的技术仍需不断地研究和完善，为了提高治疗的有效性及安全性，CRISPR-Cas13a系统仍需要进一步优化。

CRISPR-Cas13a系统的附带切割效应是否广泛地表现于肿瘤细胞中以及如何进一步优化该系统等都是我们需要关注的问题。例如crRNA往往是仅靶向癌基因的核酸序列，因此未来的研究可能需要通过生物信息学选取癌细胞特有的核酸序列以满足crRNA的特异性。此外，miRNA用于肿瘤的早期诊断，依赖于完善的miRNA信息库，以保证诊断结果的准确性，因此，在将来研究者可能着重于癌症患者的miRNA特征核酸序列以及表达量异常的miRNA种类。另外，CRISPR-Cas13系统为RNA编辑领域提供了新的思路，例如在某些基因病的临床治疗中调控有害基因的表达而改善患者病情。

尽管存在一定的挑战性，但基于crRNA的特异性及CRISPR-Cas13a系统的灵敏性，CRISPR-Cas13a系统仍有望在肿瘤治疗方面有所发展。目前，CRISPR-Cas13a用于肿瘤治疗的基础研究已经有了不少进展，但距离其发展为成熟的技术体系仍需进一步探索。