目前，由新冠病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 感染导致的新冠病毒肺炎(coronavirus disease, COVID-19) 席卷全球，已成为全球公共卫生关注的焦点^[1]。截至2021年11月23日，COVID-19确诊病例达2.5亿人，死亡病例达515万人。虽然灭活疫苗、基因工程疫苗、5型腺病毒活载体疫苗和mRNA疫苗的上市有效地阻断了SARS-CoV-2的大流行并显著地降低了COVID-19重症发病率，但面对SARS-CoV-2高频基因突变导致的传染性升高和疫苗保护力下降等问题，尤其是德尔塔突变株的全球蔓延导致了COVID-19确诊病例数量再度激增，积极开发新型广谱抗冠状病毒药物刻不容缓^[2-3]。

SARS-CoV-2是一种具有包膜的单股正链RNA病毒，具有高频的基因突变性，属于β-冠状病毒属。SARS-CoV-2主要通过刺突糖蛋白(spike glycoprotein) 的受体结合结构域(receptor-binding domain, RBD) 与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2 (angiotensin converting enzyme 2, ACE2) 结合，吸附到宿主呼吸道上皮细胞并注入病毒RNA到宿主细胞中^[4]。病毒RNA利用宿主细胞的核糖体翻译成pp1a和pp1ab等2条多聚蛋白质体(polyprotein)，并通过自剪切作用产生能够水解多聚蛋白质体为16个非结构蛋白质的主蛋白酶(main protease, Mpro) 和木瓜样蛋白酶(papain-like protease, PLpro)。其中，多聚蛋白质体在Mpro的水解作用下被切割成包括RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp) 等12个非结构蛋白质，调控病毒RNA的复制与转录，促进免疫逃逸^[5]。Mpro对多聚蛋白质体的水解过程是病毒RNA复制与转录过程中不可或缺的关键步骤。

作为半胱氨酸蛋白酶的Mpro在致病性β-冠状病毒中的进化相对保守，不易突变。Mpro的活性形式为同源二聚体结构，其可塑性较小的活性中心主要由His41和Cys145组成，是调控病毒RNA复制与转录的关键蛋白酶。鉴于Mpro进化保守且人体缺乏其同源蛋白酶，这使Mpro成为广谱抗冠状病毒药物开发的理想靶标之一^[6-8]。

自COVID-19疫情暴发以来，虽有大量的Mpro小分子抑制剂被相继发现与报道，但其中部分抑制剂已被证实是非特异性Mpro小分子抑制剂^[9-10]。因此，建立灵敏可靠的Mpro小分子抑制剂高通量筛选模型具有重要意义。本研究在高活性Mpro制备的基础上，旨在利用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 原理，通过一系列反应条件优化，建立灵敏、可靠的Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型，并筛选苗头化合物，为抗新型冠状病毒药物先导化合物的筛选与发现奠定基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂

大肠杆菌(Escherichia coli) Rosetta (DE3) 感受态细胞、质粒提取试剂盒、蛋白质标准分子量购自北京全式金生物技术有限公司；蛋白胨、琼脂粉、酵母粉购自Oxide公司；氨苄西林、异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl β-d-thiogalactoside, IPTG)、7-甲氧基香豆素-4-乙酸(7-methoxycoumarin-4-acetic acid, MCA)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、二硫苏糖醇(1, 4-dithiothreitol, DTT) 购自Aladdin公司；HisTrap^TM层析柱购自Cytiva公司；全黑半底96孔板购自Corning公司；FRET底物(FRET substrate：MCA-AVLQSGFR-Lys(Dnp)-Lys-NH₂，λ_ex/λ_em：320/405 nm) 购自吉尔生化(上海) 有限公司；天然产物化合物库购自ChemDiv公司；GC-376、依布硒啉(ebselen)、黄芩素(baicalein)、白花丹素(plumbagin, PLB)、银杏酸(ginkgolic acid, GA) 购自TargetMol公司；其他试剂为国产分析纯试剂。

1.1.2 仪器

超净工作台购自AIRTECH公司；细菌振荡培养箱购自上海知楚公司；超声波细胞粉碎仪购自SCIENTZ公司；蛋白质电泳仪购自Bio-Rad公司；高速冷冻离心机购自Eppendorf公司；AKTA Pure蛋白质纯化仪购自GE Healthcare公司；凝胶成像系统购自CLINX公司；多功能酶标仪购自BioTek公司。

1.2 方法 1.2.1 SARS-CoV-2 Mpro原核表达、分离纯化与比活力的测定

将含有重组质粒pET-21a-Mpro的E. coli DH5α甘油菌以平板划线法复苏后，提取重组质粒。再将重组质粒以冷CaCl₂化学转化法转化至E. coli Rosetta (DE3) 感受态细胞中，以氨苄西林抗性法筛选重组子。按照参考文献[11]所述的方法进行Mpro原核表达、分离纯化及比活力的测定。

1.2.2 Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型的优化

1) Mpro水解反应的缓冲液优化

将Mpro以4-吗啉乙磺酸(4-morpholineethanesulfonic acid, MES) 缓冲液(10 mmol/L MES, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 6.0) 稀释至0.25 μmol/L，加入FRET底物使其终浓度为10 μmol/L。将上述反应液以50 μL/孔加入到全黑半底96孔板中，设置增益值为58，检测温度为室温(25 ℃)，激发光为320 nm，发射光为405 nm，检测间隔为1 s，检测总时间为2 min，以多功能酶标仪检测相对荧光强度(relative fluorescence unit, RFU) 值。根据30 s内酶促反应曲线的斜率计算其反应初速度(V=ΔRFU/s)。设定反应缓冲液为羟乙基哌嗪乙磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES) 缓冲液(10 mmol/L HEPES, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.0) 与Tris缓冲液(10 mmol/L Tris, 50 mmol/L NaCl, 1 mmol/L EDTA, pH 8.0)，同法检测酶促反应的初速度，确定Mpro水解反应的最佳缓冲液。

2) Mpro最佳反应浓度的确定

以HEPES缓冲液将Mpro稀释至1.5、1.25、1、0.75、0.5、0.25、0.125、0.062 μmol/L，分别在各组稀释液中加入FRET底物使其终浓度为5 μmol/L，再以50 μL/孔加入到全黑半底96孔板中，以多功能酶标仪检测RFU值。以GraphPad Prism 8.0拟合Mpro水解反应曲线，计算Mpro的半数有效浓度(half concentration of maximal effect, EC₅₀) 值。

3) Mpro水解反应的最佳反应温度的优化

将FRET底物以含0.4 μmol/L Mpro的HEPES缓冲液稀释至5 μmol/L，再以50 μL/孔加入到全黑半底96孔板中，设置反应温度为4 ℃，以多功能酶标仪检测RFU值。设置反应温度为25、30 ℃，同法检测RFU值。通过计算各组酶促反应的初速度，确定Mpro水解反应的最佳反应温度。

4) DMSO最大耐受浓度的测定

设定上述反应体系中DMSO终浓度分别为0、2%、5%和10%，按照上述方法检测各组酶促反应的RFU值并计算其酶促反应的初速度，确定Mpro水解反应中DMSO最大耐受浓度。

5) Mpro水解反应的最佳反应时间的确定

将FRET底物以含0.4 μmol/L Mpro的HEPES缓冲液稀释至5 μmol/L，再以50 μL/孔加入到全黑半底96孔板中，设置检测温度为25 ℃，分别在酶促反应的第0、1、2、3、4、5、6 min，以多功能酶标仪检测RFU值。通过计算各组酶促反应的ΔRFU值，确定Mpro水解反应的最佳反应时间。

1.2.3 DTT对FRET筛选模型可靠性的影响

将20 mmol/L依布硒啉以含0.8 μmol/L Mpro的HEPES缓冲液稀释至2 μmol/L，以2倍倍比稀释法，共稀释8个浓度梯度，以25 μL/孔加入到全黑半底96孔板中，室温孵育30 min。再分别以25 μL/孔加入10 μmol/L FRET底物到各组梯度溶液中，以多功能酶标仪检测RFU值，分别计算各组酶促反应的初速度。设定DMSO组为阴性对照组。依布硒啉的抑制率计算公式如下：

(Eq. 1)

式中V_Ebselen代表含既定依布硒啉浓度下的酶促反应的初速度，V_DMSO代表阴性对照组的酶促反应的初速度。以GraphPad Prism 8.0拟合依布硒啉的抑制曲线，计算半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration, IC₅₀) 值。同法检测在HEPES缓冲液中含1 mmol/L DTT条件下，依布硒啉(起始浓度100 μmol/L) 在FRET筛选模型中的IC₅₀值。

设定黄芩素的起始终浓度为100 μmol/L，以2倍倍比稀释法，共稀释8个浓度梯度。按照上述操作方法，分别计算在不含或含有1 mmol/L DTT条件下，黄芩素在FRET筛选模型中的IC₅₀值。考虑到DTT对FRET筛选模型的可靠性有重要影响，本研究所述的苗头化合物高通量筛选实验中，所使用的HEPES缓冲液均含1 mmol/L DTT。

1.2.4 FRET筛选模型的特异性评价

设定GC-376起始终浓度为1 μmol/L，以2倍倍比稀释法，共稀释8个浓度梯度，按照依布硒啉抑制活性测定中所述的方法，计算GC-376在FRET筛选模型中的IC₅₀值。

在含0.8 μmol/L Mpro的HEPES缓冲液中分别加入GC-376 (2 μmol/L) 和2% DMSO，以25 μL/孔加入到全黑半底96孔板中，室温孵育30 min。其中A板#1–#50孔反应体系中含GC-376，设定为阳性对照组；B板#1–#50孔反应体系中含DMSO，设定为阴性对照组。再以25 μL/孔加入10 μmol/L FRET底物到上述反应孔中，室温继续孵育5 min，以多功能酶标仪检测RFU值。按照参考文献[12]所述的方法计算FRET筛选模型的Z′因子值。同时计算本筛选模型的信号窗值(signal window, SW)、信号本底比值(signal to background, S/B) 与信噪比值(signal to noise, S/N)。其中，Z´因子值计算方法如下所述：

(Eq. 2)

式中阴性对照组RFU值的标准差为SD_DMSO，阳性对照组RFU值的标准差为SD_GC-376，阴性对照组RFU值的平均值为μ_DMSO，阳性对照组RFU值的平均值为μ_GC-376。

1.2.5 天然产物化合物库的高通量筛选

将含0.8 μmol/L Mpro的HEPES缓冲液以24 μL/孔加入到全黑半底96孔板中，再以1 μL/孔加入天然产物化合物库(1 mg/mL)，室温孵育30 min。以25 μL/孔加入10 μmol/L FRET底物，室温继续孵育5 min，再以多功能酶标仪检测RFU值。设定GC-376孔为阳性对照组，DMSO孔为阴性对照组。在初次筛选过程中，确定淬灭率(quenching ratio, Q_r) 大于50%的初筛化合物为候选苗头化合物(hit)，再进行第二轮复筛。

(Eq. 3)

1.2.6 白花丹素与银杏酸的抑制活性、抑制机制及其抑制常数值的测定

设定白花丹素与银杏酸的起始终浓度为100 μmol/L，以2倍倍比稀释法，共稀释8个浓度梯度。按照依布硒啉抑制活性测定中所述的方法，根据酶促反应的初速度，分别计算在不含或含有1 mmol/L DTT条件下，白花丹素与银杏酸在FRET筛选模型中的IC₅₀值，确定其抑制活性。

将20 mmol/L白花丹素以0.8 μmol/L Mpro稀释至0、12、24、36 μmol/L，以25 μL/孔加入至全黑半底96孔板中，室温孵育30 min。在白花丹素单一抑制浓度条件下，再以25 μL/孔加入10、20、30、40 μmol/L FRET底物，测定白花丹素在不同浓度的FRET底物中酶促反应的初速度。利用Lineweaver-Burk双倒数作图法，计算白花丹素的抑制常数(inhibitory constant, K_i) 值。

将50 mmol/L银杏酸以0.8 μmol/L Mpro稀释至0、3.2、6.4、9.6 μmol/L。同法检测银杏酸的K_i值。

2 结果与分析 2.1 SARS-CoV-2 Mpro原核表达、分离纯化与比活力的测定

将以氨苄西林抗性法筛选的重组子扩增培养，经IPTG诱导后，工程菌在相对分子量34 kDa位置有明显的目的蛋白质表达条带，其与Mpro预期分子量基本一致，并呈可溶表达。由于在Mpro的羧基端融合有多聚组氨酸标签，故此菌体裂解上清液经25%饱和硫酸铵沉淀法制备粗体液后，采用HisTrap^TM亲和层析柱成功地纯化了重组Mpro。SDS-PAGE结果显示，纯化的Mpro在相对分子量34 kDa位置呈单一条带，纯度大于90% (图 1A)。纯化的Mpro经透析和定量后，浓度达2 mg/mL。比活力测定实验结果表明，纯化的Mpro具有良好的水解活性，比活力不低于40 000 U/mg (图 1B)。利用MCA标准曲线和米氏方程，计算Mpro的酶促反应动力学参数，其中米氏常数(Michaelis constant, K_m) 值为19.71 μmol/L，最大反应速度(maximal velocity, V_max) 值为149.7 ΔRFU/s，催化常数(catalytic number, k_cat) 值为0.137/s，专一性常数(k_cat/K_m) 值为6 990 L/(mol·s) (图 1C–1D)。为了保持FRET筛选模型较低的本底值和较高的灵敏度，选用5 μmol/L FRET底物作为其最佳工作浓度。

2.2 FRET筛选模型的优化

将Mpro水解反应置于pH 6.0、7.0、8.0的缓冲液中，检测不同pH条件下Mpro酶促反应的初速度。酶促反应实验结果表明，在pH 7.0缓冲液中，Mpro的酶促反应初速度较快，此时Mpro水解活性最佳(图 2A)。因此，选用HEPES (pH 7.0) 缓冲液作为Mpro水解反应的最佳反应缓冲液。

将5 μmol/L FRET底物与倍比稀释的Mpro孵育，进行Mpro水解反应。拟合的Mpro水解反应曲线表明，在上述水解反应中，Mpro的EC₅₀值为0.4 μmol/L (图 2B)。为了保持FRET筛选模型的较高灵敏度，选用0.4 μmol/L作为Mpro的最佳工作浓度。

将5 μmol/L FRET底物与0.4 μmol/L Mpro分别在4 ℃、25 ℃、30 ℃条件下孵育，进行Mpro水解反应。酶促反应实验结果表明，Mpro水解反应在上述条件下，其酶促反应的初速度无显著差异(图 2C)，说明建立的FRET筛选模型具有良好的温度耐受性与稳定性，环境温度的波动对FRET筛选模型的稳定性没有显著的影响。为了方便FRET筛选模型的便利使用，选择室温作为Mpro水解反应的最佳反应温度。

将5 μmol/L FRET底物与0.4 μmol/L Mpro分别在不同DMSO条件下孵育，进行Mpro水解反应。酶促反应实验结果表明，当Mpro水解反应中DMSO浓度低于2%时，其对酶促反应的初速度无显著影响(图 2D)。为了保证FRET筛选模型的稳定性与可靠性，DMSO工作浓度不应高于2%。

将5 μmol/L FRET底物与0.4 μmol/L Mpro分别在不同时间点孵育，进行Mpro水解反应。酶促反应实验结果表明，从4 min开始，酶促反应的ΔRFU值基本达到最大，说明Mpro水解反应彻底完成(图 2E)。为了保证FRET筛选模型的高灵敏度与高效性，确定FRET底物与Mpro的最佳孵育时间为5 min。

综上所述，通过上述系统的优化实验，确定了FRET筛选模型的最佳工作条件为：在HEPES缓冲液中，5 μmol/L FRET底物与0.4 μmol/L Mpro室温孵育5 min，再进行RFU值检测。

2.3 DTT对FRET筛选模型可靠性的影响

依布硒啉与黄芩素是已报道的Mpro小分子抑制剂^{[6, 13-15]}。上述优化的FRET筛选模型中的抑制活性实验表明，当HEPES缓冲液中不含DTT时，依布硒啉与黄芩素具有良好的抑制活性，其IC₅₀值分别为(0.21±0.03) μmol/L、(2.18±0.2) μmol/L (图 3A, 3C)，与文献报道基本一致^{[6, 13-15]}。当HEPES缓冲液中含有1 mmol/L DTT时，依布硒啉与黄芩素对Mpro的抑制活性极大地减弱，IC₅₀值均大于50 μmol/L (图 3B–3D)。这表明依布硒啉与黄芩素是非特异性的Mpro小分子抑制剂，DTT是影响FRET筛选模型可靠性的重要因素。因此，为了保证FRET筛选模型具有良好的可靠性，在苗头化合物高通量筛选与活性鉴定的实验中，均应在含有DTT的HEPES缓冲液中进行。

2.4 FRET筛选模型的特异性评价

GC-376是公认的、具有良好抑制活性的Mpro小分子抑制剂^[16-18]。GC-376的抑制活性实验结果表明，GC376对Mpro酶活性具有良好的抑制作用，在所建立的FRET筛选模型中的IC₅₀值为0.12 μmol/L，与文献报道基本一致^[17-18] (图 4A–4B)，说明建立的FRET筛选模型具有良好的特异性与灵敏性。

设定GC376与DMSO作为FRET筛选模型的阳性对照组与阴性对照组。通过系统的计算，本筛选模型的各项筛选指标均满足高通量筛选的基本要求(表 1)。其中Z′因子值为0.79，满足其大于0.5的基本要求(图 4C)。说明已成功建立了适用于Mpro小分子抑制剂高通量筛选的FRET筛选模型。

2.5 天然产物化合物库的高通量筛选

根据上述优化的实验结果，使用0.4 μmol/L Mpro与5 μmol/L FRET底物成功建立了Mpro小分子抑制剂高通量筛选模型(图 5A)。利用已建立的FRET筛选模型对本室天然产物化合物库进行了高通量筛选，以淬灭率大于50%作为候选苗头化合物的判断标准，初筛共获得24个候选阳性化合物(图 5B)。

2.6 白花丹素与银杏酸的抑制活性、抑制机制及其抑制常数值的测定

在第2轮复筛中，发现白花丹素与银杏酸对Mpro酶活性的抑制作用具有明显的剂量依赖性，且DTT对其抑制活性无显著影响，说明白花丹素与银杏酸是新型特异性Mpro小分子抑制剂(图 6A–6B, 6E–6F)。其中，白花丹素的IC₅₀值为(19.15±0.94) μmol/L，且为非竞争型抑制剂，其K_i值为11.89 μmol/L (图 6B–6D)。银杏酸的IC₅₀值为(4.89±0.3) μmol/L，且为竞争型抑制剂，其K_i值为3.52 μmol/L (图 6F–6H)。

3 讨论

自SARS-CoV-2感染导致的COVID-19疫情暴发以来，始终具有较高的传染性。SARS-CoV-2德尔塔突变株使其传染性和致病性进一步增强，降低了疫苗接种的保护力^[3]。因此，积极开发广谱抗冠状病毒药物具有重要意义。进化保守的Mpro在调控新冠病毒RNA复制中具有重要的作用且人体缺乏其同源蛋白酶。因此，Mpro被认为是广谱抗冠状病毒药物开发的理想靶标之一^[6-8]。

制备高活性的Mpro是药物高通量筛选模型建立的重要基础。本研究利用大肠杆菌原核表达技术，基于羧基端融合多聚组氨酸标签的构建策略，成功地进行了重组Mpro在大肠杆菌中的原核表达与分离纯化。纯化的Mpro比活力不低于40 000 U/mg，且k_cat/K_m值为6 990 L/(mol·s)，不低于已报道的酶活力^[11]，说明制备的Mpro具有良好的水解活性，这为Mpro小分子抑制剂高通量筛选模型的建立奠定了坚实基础。

目前，已报道了多种筛选方法用于Mpro小分子抑制剂的筛选与发现，主要包括虚拟筛选法、FRET筛选法、细胞模型筛选法和表型筛选法等^[19]。其中，经典的FRET筛选法主要基于电偶极相互作用时，能量从起始被激发的供体分子(donor) 转移到受体分子(acceptor) 不产生任何光子的原理，具有操作简便、灵敏度高、分析快速等优点，从而使FRET技术在药物筛选、生物分析与食品科学等领域被广泛应用^[19-20]。基于FRET技术原理，以荧光基团MCA与淬灭基团Dnp标记来源于Mpro天然剪切序列的多肽作为Mpro水解底物。当Mpro水解FERT底物产生MCA-AVLQ片段时，由于底物失去FRET效应会产生较高的RFU值。但活性化合物可以抑制Mpro对FRET底物的水解作用，产生较低的RFU值^[19]。虽然已有报道利用FRET筛选法成功地发现了大量的Mpro抑制剂，但非特异性抑制剂的高频出现，迫切需求建立更可靠、更稳定的FRET筛选法应用于Mpro小分子抑制剂的快速筛选与发现^[9-10]。本研究在高活性Mpro成功制备的基础上，通过一系列反应条件优化，成功地建立了灵敏、可靠的FRET筛选模型。通过依布硒啉与黄芩素在FRET筛选模型中的抑制实验，证实了DTT是影响FRET筛选模型可靠性的重要因素。

Mpro作为半胱氨酸蛋白酶，Cys145是重要的活性中心。DTT作为一种小分子还原剂，可使含有游离巯基的Mpro更加稳定。某些化合物(如依布硒啉、黄芩素等) 可能通过非特异性的烷基化或氧化作用影响Cys145巯基使Mpro失活，表现出非特异性的表观抑制作用^[10]。但加入DTT可以更好地保护Cys145巯基，防止上述非特异性表观抑制作用的发生，提高了FRET筛选模型的可靠性。本研究证实，DTT的存在可以消除筛选化合物潜在的非特异性影响，进一步提高FRET筛选模型的可靠性与稳定性。GC-376作为共价结合的Mpro小分子抑制剂，其在FRET筛选模型中的IC₅₀值与文献报道基本一致^[19-20]，且本筛选模型的Z′值为0.79，再次证实了所建立的FRET筛选模型具有良好的可靠性、灵敏性和稳定性。本研究建立的FRET筛选模型较好地模拟了Mpro的水解反应，但由于标记底物多肽的荧光分子易于淬灭，所以需要新鲜配制并使用。另外，由于某些天然产物分子可能具有荧光特性，能够对FRET筛选模型的RFU值检测造成较大的干扰，所以需要及时利用化合物库的理化信息，有效地排除此类化合物的干扰以提高筛选效率。考虑到Mpro的酶动力学反应易受环境、温度等因素影响，为了更好地保持FRET筛选模型的稳定性与重复性，需要尽量保证FRET反应条件的一致性。

利用所建立的FRET筛选模型，通过对本室天然产物化合物库进行高通量筛选，发现了具有良好抑制活性的白花丹素与银杏酸是一类新型特异性Mpro小分子抑制剂。白花丹素是传统中药白花丹的主要药效成分，其具有广泛的药理活性，包括抗病毒、抗肿瘤、抗炎症等^[21-22]。本实验室曾报道白花丹素是一类靶向β-catenin/ TCF4相互作用的新型Wnt抑制剂，具有良好的抗肿瘤活性^[23]。但白花丹素也对Mpro酶活性展现出了中等强度的非竞争性抑制作用。白花丹素作为Mpro抑制剂的新型苗头化合物，需要深入进行化学改造与结构优化，以提高其成药性与靶向性。相较白花丹素的中等抑制活性，来源于银杏叶提取物的银杏酸却展现出了较强的竞争性抑制活性。已有研究证实，银杏酸对埃博拉病毒、流感病毒、EB病毒、基孔肯亚病毒、马亚罗病毒、寨卡病毒等展现出了良好的广谱抗病毒活性^[24-25]。近期研究证实，银杏酸也是靶向新冠病毒Mpro的小分子抑制剂，具有较好的抗新冠病毒活性，其EC₅₀值为8.3 μmol/L^[26-27]。本研究再次证实了银杏酸是新冠病毒Mpro的竞争型小分子抑制剂，可能是一类具有广阔开发前景的新型苗头化合物。

综上所述，本研究通过系统的优化方案，成功地建立了适用于新冠病毒Mpro小分子抑制剂快速筛选的FRET高通量筛选模型，证实了白花丹素与银杏酸是一类新型苗头化合物，为抗新型冠状病毒药物先导化合物的筛选与发现奠定了基础。