2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 付雯宣, 李诗韵, 赵运英, 邓禹
- FU Wenxuan, LI Shiyun, ZHAO Yunying, DENG Yu
- 代谢工程改造大肠杆菌合成丙二酸
- Metabolic engineering of Escherichia coli for production of malonic acid
- 生物工程学报, 2022, 38(7): 2566-2580
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(7): 2566-2580
- 10.13345/j.cjb.210952
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文章历史
- Received: December 29, 2021
- Accepted: March 15, 2022
引用本文
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2. 江南大学 生物工程学院, 江苏 无锡 214122;
3. 江南大学 江苏省生物活性产品加工工程研究中心, 江苏 无锡 214122
2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China;
3. Jiangsu Provincial Research Center for Bioactive Product Processing Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
丙二酸是一种二元羧酸，又称缩苹果酸，在自然界中以钙盐的形式存在于甜菜根中。丙二酸在世界范围内需求量巨大，被美国能源部列为可由生物质生产的前30种化学品之一[1]，是非常重要的有机合成中间体。丙二酸及其酯可用于合成巴比妥、维生素B1、维生素B2，是重要的医药中间体[2]，亦是吲熟酯等植物生长调节剂的中间体，因此在农业中常用于合成植物生长调节剂[3]；在化工领域，丙二酸是一种具有竞争力的铝表面处理剂，加热分解生成乙酸和水。生成的乙酸能够和铝发生反应生成醋酸铝、氢气和水，不会造成环境污染，与甲酸等酸性处理剂相比具有很大的优势[4]；在食品加工领域，丙二酸及其酯是重要的食品添加剂，能提高产品的风味[5]。目前，工业上生产丙二酸主要采用水解丙二酸二乙酯的方法[6]，以及在氢氧化钙水溶液中水解氟乙酸钙得到丙二酸钙，再通过酸性水解获得丙二酸[7]。然而这些合成方法具有反应过程复杂、生产成本高等缺点，因此，开发一种可行、高效、生产成本低的生产替代途径迫在眉睫。
近年来，生物法合成丙二酸逐渐走入人们的视野[8]，研究者开始探索丙二酸生物合成途径，但由于缺乏对合适酶和代谢途径的认识，生物法合成丙二酸的研究进展缓慢。目前并未发现生产丙二酸的天然代谢途径[9]，β-丙氨酸途径是生物法合成丙二酸较为理想的代谢通路，该途径以β-丙氨酸作为丙二酸的合成前体合成丙二酸[10]，为代谢合成丙二酸奠定了基础。有研究者通过β-丙氨酸途径实现了丙二酸在大肠杆菌中的生物合成，最终通过发酵优化使重组菌株在5 L发酵罐的产量达到3.6 g/L[8]，证明了生物合成丙二酸具有可行性。但目前关于丙二酸生物合成的研究还处于初级阶段，丙二酸的产量有待进一步的提高。
大肠杆菌(Escherichia coli) 是公认的已经被充分研究的模式生物，其含有的大部分蛋白酶也都被深入地研究[11]。由于其清晰的遗传背景、繁殖速度快以及成熟的基因改造技术，大肠杆菌是备受研究者青睐的基因工程菌。随着分子酶工程学的不断发展，酶融合技术已经被广泛用于代谢工程实验中，是近年来的研究热点之一[12]。在合成生物学方面，该技术可通过减少底物的损失和中间体的积累提高终产物的产量；还可以利用抗原抗体特异性结合的原理，在宿主菌株中表达支架蛋白以实现酶的共定位。Tippmann等的研究中运用了该方法，使大肠杆菌中聚羟基丁酸酯的产量提高了7倍[13]。Dueber等运用融合蛋白技术优化合成酶的比例，减少了细胞的代谢负担，从而使产物的滴度提高了77倍[14]，这说明酶融合技术应用前景广阔，在代谢合成领域极具应用价值。
本研究为了降低生产成本，提高研究的商业价值，所有质粒选用的均是组成型表达载体。本研究首先过表达大肠杆菌BL21(DE3) 来源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸转氨酶(aspC)、天冬氨酸-α-脱羧酶(panD) 基因，同时引入铜绿假单胞菌来源的β-丙氨酸丙酮酸转氨酶(pa0132) 基因、大肠杆菌K12来源的琥珀酸半醛脱氢酶(yneI) 基因，获得重组菌BL21(TP)。为了进一步提高丙二酸产量，本研究设计了两种实验方案：(1) 用CRISPR/Cas9技术敲除竞争途径的pykA基因，阻碍碳源进入TCA循环，重组菌命名为BL21ΔpykA(TP)；(2)过表达谷氨酸棒杆菌来源的丙酮酸羧化酶(pyc) 基因，通过增强草酰乙酸的供给提高丙二酸产量，获得的重组菌命名为BL21(TPP)，并通过SDS-PAGE验证途径中6个酶是否表达。在摇瓶水平和5 L发酵罐水平对BL21(TPP) 菌株进行发酵优化，最后将yneI、pa0132和ppc、aspC分别进行融合表达。最终，本研究实现了大肠杆菌中丙二酸的生物合成，为后续生物合成丙二酸的研究提供了技术基础和理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株、质粒和培养基| E. coli strains | Characteristics | Sources |
| JM109 | For plasmid construction | Lab store |
| BL21(DE3) | For expressing genes | Lab store |
| MG1655(K12) | For expressing genes | Lab store |
| DH5α | For expressing genes | Lab store |
| BL21(TPP) | BL21(DE3) carrying pCDF-ppc-aspC, pTrc99A-pyc-panD and pRSF-yneI-pa0132 | This study |
| BL21(SCR) | BL21(DE3) carrying pCDF-ppc-linker-aspC, pRSF-yneI-linker-pa0132 and pTrc99A-pyc-panD | This study |
| BL21(TP) | BL21(DE3) carrying pCDF-ppc-aspC, pTrc99A-panD and pRSF-yneI-pa0132 | This study |
| BL21ΔpykA | BL21(DE3) knocking out pykA gene | This study |
| BL21ΔpykA(TP) | BL21(DE3) knocking out pykA gene carrying pCDF-ppc-aspC, pTrc99A-panD and pRSF-yneI-pa0132 | This study |
| Plasmids | Characteristics | Sources |
| pTrc99A-panD | pTrc99A harboring the optimized gene panD, AmpR | This study |
| pTrc99A-pyc-panD | pTrc99A harboring the optimized genes pyc and panD, AmpR | This study |
| pCDF-ppc-aspC | pCDF harboring the optimized genes ppc and aspC, StrepR | This study |
| pRSF-yneI-pa0132 | pRSF harboring the optimized genes yneI and pa0132, KanR | This study |
| pCDF-ppc-linker-aspC | pCDF-ppc-aspC harboring the antibody sequence linker, StrepR | This study |
| pRSF-yneI-linker-pa0132 | pRSF-yneI-linker-pa0132 harboring the antibody sequence linker, KanR | This study |
| pCas | pCas-cas9, KanR | Lab store |
| pTarget-pykA | sgRNA-pykA, Spe | This study |
| pTarget | sgRNA, Spe | Lab store |
LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，氯化钠10；SOB培养基(g/L)：蛋白胨20，酵母粉5，MgSO4·7H2O 2.47，NaCl 0.5，KCl 0.186；固体培养基需添加2.5%的琼脂粉，添加的抗菌素终浓度为1 mmol/L。
1.1.2 引物本研究所有引物均由天霖生物公司合成，如表 3所示。
| Primers | Sequences (5′→3′) |
| ppc-F | AACAGACCCCATGGGCATGAACGAACAATATTCCGCATT |
| ppc-R | GCCGGATGATTAATTGTCAAGAATTCTTAGCCGGTATTACGCATACCTG |
| aspC-F | CACACAGGAAACAGACCATGTTTGAGAACATTACCGCCG |
| aspC-R | GCCGCAAGCTTGTCGACTTACAGCACTGCCACAATCGC |
| yneI-F | CACACAGGAAACAGACCATGACCATTACTCCGGCAACTC |
| yneI-R | TTCTTTACCAGACTCGAGTCAGATCCGGTCTTTCCACAC |
| pa0132-F | CACACAGGAAACAGACCATGAATCAGCCCCTGAATGTC |
| pa0132-R | GCCGGATGATTAATTGTCAAAAGCTTTCAGGCAATTCCGTTCAGAG |
| pyc-F | CACACAGGAAACAGACCGTGTCGACTCACACATCTTCAACG |
| pyc-R | GCCGGATGATTAATTGTCAAGAATTCCTTAGGAAACGACGACGATCAAGTC |
| panD-F | GAAACAGACCCTCGAGCAAGAGGTATATATTAATGTTGCGTACTATCC |
| panD-R | GCCAAAACAGCCAAGCTTCTAGATCGAGCGACTGGTTAAAAG |
| pCDF-F | GTCGACAAGCTTGCGGCC |
| pCDF-R | ATTTCCTAATGCAGGAGTCGCAT |
| pRSF-F | CTCGAGTCTGGTAAAGAAACCGC |
| pRSF-R | ATTTCCTAATGCAGGAGTCGCAT |
| pTrc99A-F | AAGCTTGGCTGTTTTGGCG |
| pTrc99A-R | CAGCTCATTTCAGAATATTTGCCA |
| pRSF-linker-F | ATGACCATTACTCCGGCAACTC |
| pRSF-linker-R | AAGCTTGGCAATTCCGTTCA |
| pCDF-linker-F | ATGTTTGAGAACATTACCGCCG |
| pCDF-linker-R | GAATTCGCCGGTATTACGCA |
| linker-pRSF-F | ACGGAATTGCCAAGCTTTCTTCAAGCTCTGGTAGCTCGTC |
| linker-pRSF-R | CCGGAGTAATGGTCATTCCGGAGCTCGAACTGCC |
| linker-pCDF-F | TAATACCGGCGAATTCTCTTCAAGCTCTGGTAGCTCGTC |
| linker-pCDF-R | CGGCGGTAATGTTCTCAAACATTCCGGAGCTCGAACTGCC |
| pykA-sgRNA-F | TGCGCGTCAGCTAAACCGAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT |
| pykA-sgRNA-R | CTCGGTTTAGCTGACGCGCAACTAGTATTATACCTAGGACTGAG |
| pykA-up-F | CCACAGCCAGGATCCACGCATGAGTTGTATGAATTGT |
| pykA-up-R | CATCCGGCAACGTACGTAATACTCCGTTGACTGAAACAAC |
| pykA-down-F | TGTTTCAGTCAACGGAGTATTACGTACGTTGCCGGATGC |
| pykA-down-R | TGCGGCCGCAAGCTTTACGTCAGGGGTACTGG |
DNA聚合酶及Marker购自TaKaRa公司；MultiF Seamless Assembly Mix重组酶购自ABclonal公司；DNA纯化及质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海) 股份有限公司。
1.2 重组质粒的构建为了在大肠杆菌中构建丙二酸生物合成途径，本研究过表达了大肠杆菌BL21(DE3) 来源的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸转氨酶(aspC)、天冬氨酸-α-脱羧酶(panD) 基因。同时引入了铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 来源的β-丙氨酸丙酮酸转氨酶(pa0132) 基因、大肠杆菌K12来源的琥珀酸半醛脱氢酶(yneI) 基因和谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) 来源的丙酮酸羧化酶(pyc) 基因。以本实验室保存的pRSF、pCDF、pTc99A质粒以及大肠杆菌的基因组为模板，通过表 3中的引物，分别扩增获得基因片段以及上下游的同源臂序列。再采用同源重组的方法，构建pTrc99A-panD、pTrc99A-pyc-panD、pCDF-ppc-aspC和pRSF-yneI-pa0132表达质粒。具体构建策略如下。
重组质粒pTrc99A-panD的构建：以大肠杆菌BL21(DE3) 基因组为模板，用引物panD-F、panD-R扩增天冬氨酸-α-脱羧酶(panD) 基因。以实验室保存的pTrc99A质粒为模板，用引物pTrc99A-F、pTrc99A-R线性化质粒模板。再用同源重组酶将panD片段和pTrc99A质粒同源重组，将重组产物转入E. coli JM109感受态细胞中，得到pTrc99A-panD重组质粒。
重组质粒pTrc99A-pyc-panD的构建：以大肠杆菌BL21(DE3) 基因组为模板，用引物panD-F、panD-R扩增天冬氨酸-α-脱羧酶(panD)基因。以谷氨酸棒杆菌基因组为模板，用引物pyc-F、pyc-R扩增丙酮酸羧化酶(pyc) 基因。以同源重组酶将panD、pyc片段和pTrc99A质粒同源重组，将重组产物转入E. coli JM109感受态细胞中，得到pTrc99A-pyc-panD重组质粒。
重组质粒pCDF-ppc-aspC的构建：以大肠杆菌BL21(DE3) 基因组为模板，用引物ppc-F、ppc-R扩增磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)；引物aspC-F、aspC-R扩增天冬氨酸转氨酶基因(aspC)。以pCDF质粒为模板，用引物pCDF-F、pCDF-R线性化质粒模板。再用同源重组酶将ppc、aspC片段和pCDF质粒同源重组，将重组产物转入E. coli JM109感受态细胞中，筛选获得pCDF-ppc-aspC重组质粒。
重组质粒pRSF-yneI-pa0132的构建：琥珀酸半醛脱氢酶基因(yneI) 和β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因(pa0132) 由苏州金唯智生物科技有限公司合成，用引物yneI-F、yneI-R扩增琥珀酸半醛脱氢酶基因(yneI)；用引物pa0132-F、pa0132-R扩增β-丙氨酸丙酮酸转氨酶基因(pa0132)。以实验室保存的pRSF质粒为模板，用引物pRSF-F、pRSF-R线性化质粒模板。再用同源重组酶将yneI、pa0132片段和pRSF质粒同源重组，将重组产物转入E. coli JM109感受态细胞中，获得pRSF-yneI-pa0132重组质粒。
为了提高丙二酸合成途径的效率，本研究将丙二酸合成途径的关键酶yneI和pa0132以及ppc和aspC分别进行融合表达。采用Stefan等[12]的融合蛋白构建方法，对构建的组成型表达质粒进行改造。具体构建策略如下。
重组质粒pCDF-ppc-linker-aspC的构建：linker基因片段由苏州金唯智生物科技有限公司合成，其氨基酸序列为(SSSSG)4。用引物linker-pCDF-F、linker-pCDF-R扩增linker片段。以pCDF-ppc-aspC质粒为模板，用引物pCDF-linker-F、pCDF-linker-R线性化pCDF质粒，再用同源重组酶将linker片段和pCDF-ppc-aspC质粒同源重组，将重组产物转入E. coli JM109感受态细胞中，筛选获得pCDF-ppc-linker-aspC重组质粒。
重组质粒pRSF-yneI-linker-pa0132的构建：linker基因片段由苏州金唯智生物科技有限公司合成，引物linker-pRSF-F、linker-pRSF-R扩增linker片段。以pRSF-yneI-pa0132质粒为模板，pRSF-linker-F、pRSF-linker-R线性化pRSF质粒，再用同源重组酶将linker片段和pRSF-yneI-pa0132质粒同源重组，将重组产物转入E. coli JM109感受态，筛选获得pRSF-yneI-linker-pa0132重组质粒。
1.3 CRISPR/Cas9系统敲除大肠杆菌丙酮酸激酶(pykA) 基因本研究使用双质粒系统敲除pykA基因，构建含有Cas9编码基因的pCas质粒和含有sgRNA的pTarget质粒。基因敲除时，将两个质粒和目标基因上下游500 bp的片段一起电转化入待敲除菌株中，并使用终浓度为10 mmol/L的阿拉伯糖诱导重组酶的合成，实现基因敲除。
验证敲除正确后，诱导pCas质粒定位pTarget质粒上的sgRNA，从而消除pTarget质粒。由于pCas质粒是温敏型质粒，因此选用在42 ℃培养的方式消除pCas质粒。
1.4 重组菌株的构建将质粒pRSF-yneI-pa0132、pCDF-ppc-aspC和pTrc99A-panD电转化至BL21(DE3) 菌株中，获得重组菌BL21(TP)。将质粒pRSF-yneI-pa0132、pCDF-ppc-aspC和pTrc99A-panD电转化至BL21(DE3)ΔpykA菌株中，获得重组菌BL21ΔpykA(TP)。将质粒pRSF-yneI-pa0132、pCDF-ppc-aspC和pTrc99A-pyc-panD电转化至BL21(DE3) 菌株中，获得产丙二酸的工程菌BL21(TPP)。将pCDF-ppc-linker-aspC、pRSF-yneI-linker-pa0132和pTrc99A-pyc-panD电转化至BL21(DE3) 菌株中，获得产丙二酸的工程菌BL21(SCR)。
1.5 基因表达的鉴定挑取单克隆于25 mL的LB培养基中，37 ℃培养12 h。再将上述菌液转接LB培养基中过夜培养，发酵时按2%接种量转接SOB培养基中，37 ℃培养48 h。分别在4、8、12、24、36、48 h取样，10 000 r/min、4 ℃离心20 min，取上清液进行SDS-PAGE检测。
1.6 重组菌株的发酵实验摇瓶发酵：重组菌株接种至LB培养基中传代两次，发酵时取传代结束菌液接种至SOB培养基中，37 ℃、230 r/min培养72 h，每隔12 h取样，测定OD600和丙二酸积累量。
5 L发酵罐发酵：重组菌株接种至LB培养基中培养12 h，再按2%接种量分别接种于6瓶LB培养基中，37 ℃、230 r/min培养12 h后接种发酵罐。
1.7 检测方法HPLC检测：取发酵液1 mL，13 000 r/min离心10 min，取上清液通过0.22 μm的滤膜。丙二酸、乙酸和葡萄糖采用示差检测器进行分析，检测参数如下：采用5 mmol/L H2SO4作为流动相，0.6 mL/min流速进样，柱温30 ℃，进样量20 μL，检测器温度30 ℃。β-丙氨酸检测参数参考Song等[15]的研究。
2 结果与分析 2.1 丙酮酸激酶(pykA) 基因敲除菌的构建用引物pykA-sgRNA-F和pykA-sgRNA-R全质粒PCR扩增pTarget质粒，引入20 bp的sgRNA序列，获得基因敲除质粒pTarget-pykA。用引物pykA-up-F和pykA-up-R扩增上游同源臂；用引物pykA-down-F和pykA-down-R扩增下游同源臂，利用融合PCR技术获得1 000 bp的上下游同源臂。
将pCas质粒、pTarget-pykA质粒和上下游同源臂电转化入BL21(DE3) 菌株中实现基因敲除，并进行菌落PCR验证，结果如图 1所示。若敲除成功，则条带大小应为750 bp，将条带大小正确的扩增片段送至天霖生物公司测序。测序结果与同源臂序列一致，则pykA基因敲除成功。将pTrc99A-panD、pCDF-ppc-aspC和pRSF-yneI-pa0132质粒转化至基因敲除菌株中，获得重组菌BL21ΔpykA(TP)。
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| 图 1 菌落PCR验证琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 1 Colony PCR to verify pykA deletion. 1–6: pykA gene deletion; 7: no gene deletion. |
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将构建的3个表达质粒pRSF-yneI-pa0132、pCDF-ppc-aspC和pTrc99A-pyc-panD转化至BL21(DE3) 菌株中，获得产丙二酸的工程菌BL21(TPP)，丙二酸合成途径如图 2所示。本研究构建BL21(TPP) 菌株后，通过SDS-PAGE验证了pa0132、yneI、pyc、ppc、aspC、panD这6个关键酶基因的表达情况。挑取BL21(TPP) 转化子接种到新鲜的SOB培养基37 ℃、230 r/min培养，取发酵上清液进行SDS-PAGE检测，对照为培养12 h的BL21菌株发酵上清液，结果如图 3所示。
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| 图 2 丙二酸合成途径代谢通路 Fig. 2 Metabolic pathway for the production of malonate acid. Glucose-6-P: 6-phosphate-glucose; pykA: pyruvate kinase; gltA: citrate synthase; sdhC: succinate dehydrogenase; ppc: phosphoenolpyruvate carboxylase; pyc: pyruvate carboxylase; aspC: aspartate aminotransferase; panD: aspartate-α-decarboxylase; pa0132: β-alanine pyruvate aminotransferase; yneI: succinate semialdehyde dehydrogenase. Glucose：葡萄糖；Glucose-6-P：6-磷酸-葡萄糖；Phosphoenolpyruvate：磷酸烯醇式丙酮酸；Pyruvate：丙酮酸；Acetyl-CoA：乙酰辅酶A；Citrate：柠檬酸；Succinic acid：琥珀酸；Fumarate：富马酸；Oxaloacetate：草酰乙酸；Aspartate：天冬氨酸；β-alanine：β-丙氨酸；Malonice semialdehyde：丙二酸半醛；Malonate：丙二酸；pykA：丙酮酸激酶；gltA：柠檬酸合酶；sdhC：琥珀酸脱氢酶；ppc：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；pyc：丙酮酸羧化酶；aspC：天冬氨酸转氨酶；panD：天冬氨酸-α-脱羧酶；pa0132：β-丙氨酸丙酮酸转氨酶；yneI：琥珀酸半醛脱氢酶 |
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| 图 3 过表达关键酶基因的SDS-PAGE验证 Fig. 3 SDS-PAGE verification of overexpression of key genes. (A) pRSF-yneI-pa0132. (B) pCDF-ppc-aspC. (C) pTrc99A-pyc-panD. |
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yneI和pa0132基因表达的目的蛋白大小分别为49.7 kDa和48.4 kDa，图 3A检测结果显示这两个蛋白已经成功表达；ppc和aspC基因表达的目的蛋白大小分别为99.0 kDa和43.6 kDa，图 3B显示ppc和aspC基因已表达；图 3C的检测结果显示pyc和panD基因均已成功表达，其目的蛋白大小分别为128.0 kDa和14.1 kDa。蛋白胶图中的条带大小与理论一致，因此磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸转氨酶(aspC)、天冬氨酸-α-脱羧酶(panD)、β-丙氨酸丙酮酸转氨酶(pa0132)、琥珀酸半醛脱氢酶(yneI) 和丙酮酸羧化酶(pyc) 基因已表达。
2.3 重组菌株的摇瓶发酵 2.3.1 重组菌株摇瓶发酵液液相检测结果将经过两次活化的重组菌BL21(TP)、BL21ΔpykA(TP) 和BL21(TPP) 种子液接种至50 mL SOB培养基中，37 ℃、230 r/min摇瓶发酵72 h，每12 h取样进行液相检测。液相检测结果如图 4所示，菌株BL21(TPP) 的丙二酸积累量最高，丙二酸在48–60 h的积累最快，最高在60 h时有0.47 g/L的丙二酸积累量。因此以BL21(TPP) 为本研究的出发菌株。
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| 图 4 重组菌株摇瓶发酵上清液中丙二酸产量 Fig. 4 Titer of malonic acid in the supernatant of the recombinant strains cultured in shake flasks. |
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重组菌株BL21(TPP) 在SOB中发酵培养72 h后，将发酵液离心，取上清液通过0.22 μm的滤膜制备检测样品。采用LC-MS对丙二酸进行定性，检测结果如图 5所示，图 5A为丙二酸标样，图 5B为发酵上清液样品，样品中的特征离子(m/z 59.0、m/z 103.0) 与标样相同，说明发酵液中有丙二酸的积累。
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| 图 5 BL21(TPP) 摇瓶发酵上清液的液质检测结果 Fig. 5 LC-MS analysis of the supernatant of strain BL21(TPP) cultured in shake flasks. (A) Malonic acid standard. (B) Fermentation supernatant. A：丙二酸标样；B：发酵上清液样品 |
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不同的宿主菌株，其丙二酸生产能力也不同。因此对常见的几种大肠杆菌(E. coli) 宿主进行了发酵筛选，以便于后续的研究。将pRSF-yneI-pa0132、pCDF-ppc-aspC和pTrc99A-pyc-panD质粒转化入MG1655(K12)、JM109、BL21(DE3) 和DH5α菌株中，初始葡萄糖浓度为4 g/L，接种量2%进行摇瓶发酵。由图 6可知，BL21(DE3) 菌株合成丙二酸的能力最强，丙二酸积累量最高，为0.51 g/L。因此本研究以BL21(DE3) 菌株作为宿主菌株以进行进一步的研究。
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| 图 6 不同宿主菌株对丙二酸产量的影响 Fig. 6 Effect of different host strains on the production of malonic acid. |
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微生物发酵过程中常用的碳源有葡萄糖、淀粉、果糖、甘露糖和甘油等[16]，不同的碳源种类对发酵过程中菌体的生长代谢影响显著。本研究选取了大肠杆菌发酵常用的5种碳源，每种碳源的浓度均为4 g/L，其他组分和培养条件均不变，发酵液检测结果如图 7所示。从图中可以看出，最有利于丙二酸生产的碳源是葡萄糖，其次是乳糖和蔗糖，半乳糖作为碳源时丙二酸的积累量明显低于葡萄糖。其原因可能是葡萄糖对于菌体而言是快速碳源，容易被菌体所利用。
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| 图 7 不同碳源种类对丙二酸产量的影响 Fig. 7 Effect of different types of carbon sources on the production of malonic acid. |
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培养基中的糖浓度是大肠杆菌发酵控制中的关键因素，浓度过高时会利于副产物的生成，阻碍目标产物的高效合成[17]。本研究选取了4、8、12、16 g/L四个初始葡萄糖的浓度梯度，探究最佳的初始糖浓度。使用SOB培养基发酵72 h，每12 h取样测定OD600并进行HPLC检测，结果如图 8所示。从图中可以看出，4 g/L的初始糖浓度更有利于菌体积累丙二酸。糖浓度过高，对菌体的生长和代谢有抑制作用。
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| 图 8 不同初始糖浓度对丙二酸积累量的影响 Fig. 8 Effect of different initial sugar concentration on the production of malonic acid. |
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本研究继续在5 L发酵罐水平探究BL21(TPP) 菌株产丙二酸的最优条件，发酵罐的发酵条件为通气量1 vvm，转速400 r/min，温度37 ℃，装液量3 L，接种量10%。补料方式对发酵罐的产量有很大的影响，因为不同的补料方式会导致发酵液中残糖浓度的不同，残糖浓度过高，发酵液中渗透压过大，不利于菌体对营养物质的吸收；而残糖浓度过低时，菌体缺少碳源的供给，必然影响产物的合成[18]。因此首先比较连续补料和间歇补料对丙二酸积累量的影响，发酵结果如图 9所示。从图中可以看出，连续补料在49 h时丙二酸积累量最高，为0.688 g/L。间歇补料在42 h时丙二酸积累量最高，为2.16 g/L，是流加补料的3倍多，并且达到最高产量的时间也更短。分析原因可能是：少量多次的补料方式能够克服底物的抑制效应，使菌体的活力更高，更有利于菌体生长和利用底物[19]，因此后续的上罐将采用间歇补料的方式。
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| 图 9 5 L发酵罐补料方式对丙二酸积累量的影响 Fig. 9 Effect of feeding method on the production of malonic acid in 5 L fermentor. (A) Continuous feeding. (B) Intermittent feeding. |
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溶氧浓度是高密度发酵过程中影响菌体生长的重要因素之一，对菌体生长和代谢的影响很大[20]。将溶氧控制在最佳的范围，能够使菌体的活力更强。本研究在溶氧和搅拌关联的设置下对发酵罐的溶解氧进行了优化，设置了25%和15%两个梯度，其他发酵条件不变，HPLC结果如图 10所示。分析图中数据，溶氧为15%时菌体的生长速率比25%溶氧时快很多，并且副产物的积累也更少，这可能是碳源大部分用于菌体生长的缘故。从丙二酸的积累量来看，溶氧为25%时丙二酸积累量为3.32 g/L，而溶氧为15%时的丙二酸产量仅为1.65 g/L，这可能是由于15%的溶解氧不足以同时满足菌体的生长及产物的合成，造成丙二酸积累少，菌体过早衰老的现象。
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| 图 10 5 L发酵罐溶解氧对丙二酸积累量的影响 Fig. 10 Effect of dissolved oxygen on the production of malonic acid in 5 L fermentor. (A) 25%. (B) 15%. |
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将BL21(SCR) 菌株在4 g/L初始糖的SOB中，37 ℃、230 r/min培养72 h，每12 h取样并采用HPLC进行定量检测，发酵结果如图 11所示。BL21(SCR) 菌株在48 h时积累0.83 g/L的丙二酸，比相同条件下的对照组BL21(TPP) 菌株提高了36%。该结果说明对蛋白质进行融合表达能够减少中间代谢物的损失，促进丙二酸的合成。
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| 图 11 BL21(SCR) 融合蛋白菌株摇瓶发酵结果 Fig. 11 Shake flask fermentation of strain BL21(SCR) with fusion protein. |
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本文研究了不同接种量对BL21(SCR) 菌株在5 L发酵罐培养条件下产丙二酸的影响，进一步探究该菌株的丙二酸生产能力。发酵过程中，设置了10%接种量和15%接种量两个梯度，初始糖浓度为4 g/L，0–3 h的转速为300 r/min，3 h后设置为溶氧与转速联动，以保证溶氧在25%左右，搅拌转速范围为300–800 r/min，每当葡萄糖浓度降为0 g/L时，补加终浓度为8 g/L的葡萄糖，发酵结果如图 12所示。分析图中数据，当接种量为15%时菌株的生长速率更快，丙二酸的积累也更多，最高为4.5 g/L，这说明提高接种量对丙二酸的积累有促进作用。
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| 图 12 BL21(SCR) 菌株不同接种量5 L发酵罐发酵结果 Fig. 12 Fermentation profile of strain BL21(SCR) in 5 L fermentor with different inoculum size. (A) 10%. (B) 15%. |
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BL21(SCR) 菌株上罐结果显示(图 13)，乙酸在整个发酵过程中的积累非常多，为了减少乙酸的积累，进一步提高丙二酸的积累量，本研究采用了梯度降温的上罐发酵策略。通过在发酵中后期降低发酵罐温度，达到减慢菌体生长，提高目标代谢通路碳流量的目的[21]。发酵过程中，初始糖浓度为4 g/L，0–3 h的转速为300 r/min，3 h后设置为溶氧与转速联动，以保证溶氧在25%左右，搅拌转速范围为300–800 r/min，每当葡萄糖浓度降为0 g/L时，补加终浓度为8 g/L的葡萄糖，初始发酵温度为37 ℃，12 h降温到34 ℃，24 h降温到32 ℃，32 h降温到30 ℃直至发酵结束，发酵结果如图 13所示。可以看出梯度降温确实可以减缓菌体的生长，抑制副产物乙酸的合成，该条件下丙二酸的积累量达到了5.61 g/L，这说明发酵中后期降低温度能促进丙二酸的合成。
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| 图 13 BL21(SCR) 菌株梯度降温5 L发酵罐发酵结果 Fig. 13 Fermentation profile of strain BL21(SCR) in 5 L fermentor with gradient cooling. |
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丙二酸作为一种重要的有机合成中间体，它可用作金属表面处理剂、植物生长调节剂[22]以及维生素B2的合成，因此丙二酸的需求量巨大。但目前广泛使用的化学合成法具有生产成本高、转化率低等缺点[23]，因此生物法合成丙二酸成为了近年来的研究热点，构建基因工程菌实现丙二酸的合成具有重要的意义。
本研究以大肠杆菌BL21(DE3) 作为表达宿主，通过引入外源pa0132、yneI和pyc基因，以及过表达大肠杆菌自身的ppc、aspC和panD基因，实现了大肠杆菌中丙二酸的生物合成。通过对重组菌株进行发酵优化，使菌株在摇瓶的最高产量为0.61 g/L，5 L发酵罐水平对重组菌株进行了补料方式以及溶解氧浓度的优化，我们发现在间歇补料以及溶氧为25%的条件下丙二酸的积累量最高，在62 h时积累了3.32 g/L的丙二酸。
为了进一步提高丙二酸产量，本研究将丙二酸合成途径的关键酶基因yneI和pa0132以及ppc和aspC分别进行融合表达，以减少底物的损失和中间代谢物的积累，提高丙二酸的产量。构建的BL21(SCR) 菌株在摇瓶中的丙二酸积累量为0.83 g/L，在5 L发酵罐中最高54 h时积累了5.61 g/L丙二酸。该实验结果与出发菌株BL21(TPP) 相比，产量提高了69%，并且菌体的生长和丙二酸的积累速度也更快。通过对最优发酵结果碳平衡的计算，发现单位体积(1 L) 消耗的碳原子量为1.62 mol，生产丙二酸消耗碳原子0.16 mol，生产乙酸消耗0.67 mol，生产β-丙氨酸消耗0.56 mol，剩余的0.23 mol碳原子用于菌体生长，总碳平衡。说明乙酸和β-丙氨酸作为主要的副产物占据了大部分的碳源，这也是限制丙二酸产量提高的关键因素。本研究最优发酵条件的丙二酸产率为0.09 g/g葡萄糖，该途径的理论产率为0.88 g/g葡萄糖。实际产率低于理论产率的原因主要有：乙酸的积累量较高，最高有21.4 g/L的积累(图 13)，与目标途径竞争了大量的碳源；发酵过程中丙二酸的前体β-丙氨酸的积累量一直在上升(图 13)，说明β-丙氨酸丙酮酸转氨酶(pa0132) 和琥珀酸半醛脱氢酶(yneI) 的催化效率不高，使得β-丙氨酸没有被高效地转化为丙二酸。
本研究对重组菌株的研究主要集中在发酵优化，而对途径中酶的活性以及辅因子没有进行深入的研究。并且目前有研究表明，琥珀酸半醛脱氢酶是一种CoA依赖的脱氢酶，改变CoA的数量可以调节该酶的活性[24]；添加NAD+和NADH可以激活该酶的活性[25]。在后续的研究中，将对琥珀酸半醛脱氢酶进行纯化和表征，从而进一步提高丙二酸的产量。
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