2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 金亮, 李利宏, 张荣珍, 徐岩
- JIN Liang, LI Lihong, ZHANG Rongzhen, XU Yan
- 重组枯草芽孢杆菌发酵生产乳铁蛋白N叶工艺优化
- Fermentation optimization for production of lactoferrin N-lobe by recombinant Bacillus subtilis
- 生物工程学报, 2022, 38(7): 2628-2638
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(7): 2628-2638
- 10.13345/j.cjb.210714
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文章历史
- Received: September 13, 2021
- Accepted: March 7, 2022
引用本文
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乳铁蛋白(lactoferrin, LF) 是转铁蛋白家族中的一种铁结合蛋白，主要存在于乳汁中的乳清蛋白部分[1-2]，乳铁蛋白主要由乳腺上皮细胞表达和分泌，它主要存在于乳汁中，同时也存在于一些分泌物中，例如汗液、泪液、唾液等[3]。根据来源的不同，可分为人乳铁蛋白(human lactoferrin, HLF)、牛乳铁蛋白(bovine lactoferrin, BLF)，猪乳铁蛋白(porcine lactoferrin, PLF)、羊乳铁蛋白(ovine lactoferrin, OLF) 等[4]。其中BLF和HLF在相应的乳汁中的含量较高，母乳中的乳铁蛋白含量约为2−3 g/L，牛乳中的乳铁蛋白含量约为0.8 g/L[5]。
BLF是牛体内一种重要的非免疫防御系统的生物活性蛋白，可以促进人体对铁的吸收[6]，具有广谱的抗菌、抗病毒[7-8]、抗氧化、抗肿瘤[9]、抗癌[10-11]以及调节机体免疫反应的作用[12]。同时在饲料添加剂、食品添加剂、医药和化妆品行业中也具有广泛的应用前景[13]。
BLF包含两个叶状结构，即N叶和C叶，每个叶包含两个区域，每个域有一个Fe3+结合位点，两个铁的结合位点所配位形成的几何形状都是扭曲了的八面体，在N叶中，蛋白质配体由Asp60、Tyr92、Tyr192、His253提供，在C叶中由Asp395、Tyr433、Tyr526、His595提供。N-叶包括发挥杀菌作用和肝素结合的结构域，而C-叶包含执行肝细胞结合和内化功能的结构域[14-15]。
BLF作为一种营养添加剂，主要以从牛乳中天然提取进行制备，用于动物和人类营养品，包括婴幼儿配方食品[16]。由于目前商用BLF的生产受限于奶源，设备投入大、生产成本高、提取工艺复杂，成为制约BLF大量制备的瓶颈因素。因此发展安全有效的大规模生产BLF研究具有重要意义。
随着转基因技术的迅猛发展，利用基因工程菌在反应器中大量生产乳铁蛋白已经成为研究热点，也为国产化乳铁蛋白提供一个新思路[17-18]。实验室前期已经成功将乳铁蛋白N叶构建在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 168中，实现了其高效可溶性表达[19]，本研究在此基础上构建了提高热敏性的重组菌株B. subtilis pMA0911-D60Y/Y92D，并以表达优化后的重组工程菌B. subtilis pMA0911-D60Y/Y92D为研究对象，采用摇瓶和10 L发酵罐，通过对发酵培养基及发酵条件进行优化研究，同时对发酵工艺开展了响应面优化设计，最终获得枯草芽孢杆菌发酵表达牛乳铁蛋白N叶的最佳培养基配方与发酵条件，可为该蛋白的工业化发酵生产提供理论指导。
1 材料与方法 1.1 菌株重组枯草芽孢杆菌B. subtilis pMA0911-D60Y/Y92D组成型诱导表达工程菌为实验室构建。
1.2 试剂种子培养基：LB培养基，胰蛋白胨10.00 g/L、酵母粉5.00 g/L、NaCl 10.00 g/L。
发酵培养基：TB培养基，胰蛋白胨12.00 g/L、酵母浸粉24.00 g/L、甘油4.00 mL/L、磷酸二氢钾2.31 g/L、磷酸氢二钾12.54 g/L。
1.3 发酵培养方法种子活化方法：从–80 ℃冰箱中取出保存的B. subtilis pMA0911-D60Y/Y92D，划线LB含有卡拉霉素抗性的平板，37 ℃倒置过夜培养。
摇瓶种子培养：挑取单克隆于LB试管中，37 ℃恒温培养8 h左右，作为发酵种子液。
重组菌株发酵研究：将发酵种子液按照1%接种量，接种到200 mL TB培养基中，37 ℃培养2–3 h，30 ℃发酵培养48 h。
1.4 乳铁蛋白表达量等测定菌体浓度测定：将发酵菌液进行适当稀释后，用分光光度计测定波长600 nm处吸光度(OD600)，用超纯水作为空白对照。
菌体预处理与SDS-PAGE分析目的蛋白的表达量：将发酵菌液重悬于0.1 mol/L磷酸钾缓冲液中，加入1 mg/mL溶菌酶处理60 min，于冰浴中超声破碎细胞(工作2 s，间隔3 s，工作时间10 min)，4 ℃、12 000×g离心30 min，收集上清液。取15 μL上清液与5 μL 4×上样缓冲液混匀后，煮沸10 min，SDS-PAGE凝胶电泳分析，然后利用分析软件Image Master VDS software对电泳条带的积分光密度(integrated optical density, IOD) 值进行分析，比较不同试验设计组之间目的蛋白表达量的差异，并作为试验设计筛选的依据。
1.5 蛋白纯化Ni柱的亲和层析将离心收集的重组菌细胞悬浮于MCAC-0 (20 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl, pH 8.5)中超声破碎。破碎条件：功率300 W，工作4 s，间隔6 s，工作时间10 min。超声破碎后10 000×g离心30 min，取上清液微孔滤膜(0.22 μm) 过滤，然后上样至预先用MCAC-0缓冲液平衡好的HisTrap HP亲和柱，用AKTA purifier 10纯化系统，用不同浓度梯度咪唑洗脱杂蛋白和目的蛋白，将收集的目的蛋白超滤浓缩用于Superdex-200柱凝胶过滤层析，其柱平衡和洗脱缓冲液为：50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，pH 8.2。所有蛋白纯化操作在4 ℃进行。
1.6 重组菌株B. subtilis pMA0911-D60Y/ Y92D摇瓶发酵工艺研究(1) 不同碳、氮源对重组菌株生长和目的蛋白表达的影响
以TB培养基为基础培养基，以胰蛋白胨为氮源，分别以可溶性淀粉、玉米糊精、葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、蔗糖作为碳源进行碳源优化；以TB培养基为基础培养基，以葡萄糖为碳源，分别以大豆蛋白胨、酪蛋白胨、玉米浆、豆粕粉和胰蛋白胨作为氮源进行氮源优化，37 ℃、200 r/min发酵30 h后按1.4所述方法进行蛋白量的评定，从而确定最佳碳、氮源。
(2) 不同初始pH、培养温度、诱导表达时间对重组菌株生长和目的蛋白表达的影响
调节培养基的初始pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5；设置温度为28、25、20和17；设置最长发酵表达时间为30 h，每隔5 h进行取样，摇瓶发酵培养，按1.4所述方法进行效价评定，从而确定蛋白表达的最适pH、温度和诱导表达时间。
(3) 重组菌株发酵工艺响应面优化设计
根据单因素试验结果，以A、B、C为考察因素，以Y (integrated optical density, IOD) 为评价指标，使用Design-Expert 8.0软件进行Box-Behnken中心组合试验设计，试验因素与水平如表 1所示。
| Levels | A-pH | B-temperature (℃) | C-time (h) |
| ‒1 | 6.5 | 25 | 20 |
| 0 | 7.0 | 28 | 25 |
| 1 | 7.5 | 37 | 30 |
(1) 不同转速、pH、温度对重组菌的生长和目的蛋白表达的影响
以优化后的摇瓶发酵条件进行发酵罐发酵，10 L发酵罐装液量7 L。设置转速为200、250、300、350 r/min；调节培养基的初始pH值为6.5、7.0、7.5、8.0；调节温度为26 ℃、28 ℃和30 ℃，发酵罐发酵30 h。按1.4所述方法进行蛋白量评定，从而确定最适转速、pH、温度。
(2) 两阶段式温度和pH调控对重组菌的生长和目的蛋白表达的影响
以优化后的摇瓶发酵条件为基础条件进行发酵罐发酵，10 L发酵罐装液量7 L，在发酵前7 h将温度和pH分别设置为37 ℃和pH 7.5，在发酵7–25 h即重组菌进入对数生长期且大量表达目的蛋白时将温度和pH分别设置为28 ℃和pH 7.0。在培养过程7–20 h，增大通气量使溶氧维持在30%左右，20 h开始以25 mL/h的流速流加补料培养基(100 g/L葡萄糖，200 g/L蛋白胨，5 g/L K2HPO4，8 g/L MgSO4·7H2O，5 mL微量元素)，防止溶氧急剧上升，整个发酵过程溶氧维持在30%左右。
为了确定最适发酵条件下，重组菌株表达目的蛋白的情况，对其进行蛋白纯化，取一定量发酵液，收菌，超声破碎，4 ℃、12 000×g离心30 min，取上清液用0.22 µm水系滤膜过滤，按照Jin等[19]报道的方法将目的蛋白纯化至均一，用SDS-PAGE测定酶的含量，并用Bradford方法[19]测定蛋白质的浓度，用牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA) 作为标准蛋白质。
2 结果与分析 2.1 重组菌株B. subtilis pMA0911-D60Y/ Y92D摇瓶发酵工艺优化 2.1.1 不同碳源和氮源对重组菌株生长和目的蛋白表达的影响在工业发酵生产过程中，碳源[20]、氮源[21]是发酵培养基的重要组成。本研究考察了不同种类的碳氮源对重组菌株生长和目的蛋白表达的影响。从图 1A可知，重组菌株对葡萄糖的利用效率最高，其OD600值最高，其次是麦芽糖、玉米糊精、可溶性淀粉、蔗糖和海藻糖；添加葡萄糖为碳源时蛋白表达量(IOD) 最高。从图 1B可知，重组菌株以胰蛋白胨作为氮源对菌体的生长最为有利，玉米浆、大豆蛋白胨和酪蛋白胨次之，而豆粕粉生长最为缓慢；且以胰蛋白胨作为氮源对牛乳铁蛋白N叶表达最为有利，因此选取葡萄糖和胰蛋白胨作为最佳碳氮源用于后续发酵。
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| 图 1 不同碳源(A) 和氮源(B) 对重组菌株B. subtilis pMA0911-D60Y/Y92D生长和蛋白表达的影响 Fig. 1 Effects of carbon (A) and nitrogen (B) sources on cell growth and protein expression of B. subtilis pMA0911-D60Y/Y92D. |
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菌体在发酵过程中适宜的pH、温度及发酵时间可以降低发酵成本，提高发酵效率，获得较高的蛋白表达量[22-24]。在最适碳源和氮源条件下，分别调节培养基的初始pH值为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5进行摇瓶发酵，如图 2A所示，当pH为7.5时重组菌株的OD600值最高，生长状态优于其他pH条件下的生长状态。当pH为7.0时对重组菌株表达牛乳铁蛋白N叶更为有利。综合菌体的生长和目的蛋白的表达结果，在发酵前7 h内将培养基的pH调节至7.5，以利于重组菌的生长，在7−16 h时，即发酵进入后期阶段将pH调节至7.0，以利于牛乳铁蛋白N叶的积累。
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| 图 2 不同pH (A)、温度(B) 和诱导表达时间(C) 对重组菌株B. subtilis pMA0911-D60Y/Y92D生长和蛋白表达的影响 Fig. 2 Effect of pH (A), temperature (B) and induction duration (C) on cell growth and protein expression of B. subtilis pMA0911-D60Y/Y92D. |
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大肠杆菌在37 ℃条件下生长最好，而在17、20、25 ℃等低温条件下，较易实现目的蛋白的可溶性表达，有研究表明28 ℃适宜乳铁蛋白的诱导表达[19]。因此，选取17、20、25、28和37 ℃表达目的蛋白。从图 2B中可以看出，随着温度的升高，菌体的生长更好，其中37 ℃条件下菌体生长最好，牛乳铁蛋白N叶表达量呈上升趋势，在28 ℃条件下，表达量最高，37 ℃时表达量降低，这可能是温度过高使得蛋白表达太快，无法正确折叠，从而造成可溶表达量下降。综合考虑菌体的生长和蛋白表达量，后续选取28 ℃作为最适诱导温度。
从图 2C中可以看出，随着时间的延长，菌体的OD600逐渐增加，25 h时达到最高，随后菌体的生长略有下降，且随着时间的延长，牛乳铁蛋白N叶的表达量逐渐增加，在25 h达到最大值，随后目的蛋白表达量呈下降趋势。综合考虑菌体的生长和目的蛋白的表达情况，选择25 h作为最佳发酵时间。
2.1.3 响应面优化重组菌株发酵工艺试验根据单因素试验结果，选择三因素三水平来进行响应面的优化，即(A) pH (6.5、7.0、7.5)；(B) 温度(25、28、37℃)；(C) 时间(20、25、30 h)，以IOD (Y) 为响应值，建立17个试验点，进行响应面优化设计，试验条件和结果如表 2所示。对响应面优化试验用Design Expert 8.0软件进行方差分析(表 2)，得到响应值IOD (Y) 与发酵pH (A)、发酵温度(B)、发酵时间(C) 这3个因素的多元回归方程：Y=−2 089.69+441.33A+ 18.22B+25.34C+0.005AB−0.711AC+0.039BC− 30.11A2−0.31B2−0.42C2。由响应面实验结果方差分析表 3可知，由于P＜0.000 1，重组菌株IOD的回归方程和响应面试验结果的关系模型是极其显著的，说明可以依靠分析结果来说明实验结果。分析多元回归方程可知，一次项B和交互项AB、BC由于P＞0.05，无显著影响，一次项A、C和交互项AC由于P＜0.05，分别对重组菌株IOD影响显著，二次项A2、B2、C2由于P＜0.000 1，对重组菌株IOD有极显著的影响，由此可以看出此次试验的3个因素与IOD的关系，它们不是简单的线性关系，F值可以反映不同试验因素对响应值的影响程度，F值越大即对响应值IOD的影响越显著，由表 3可知，对IOD的影响程度大小依次是C因素＞A因素＞B因素(发酵时间＞发酵pH＞发酵温度)。
| No. | A-pH | B-temperature (℃) | C-time (h) | IOD |
| 1 | –1 | 0 | 1 | 51.33 |
| 2 | 0 | 1 | 1 | 48.78 |
| 3 | –1 | 0 | –1 | 43.11 |
| 4 | –1 | 1 | 0 | 49.36 |
| 5 | –1 | –1 | 0 | 48.32 |
| 6 | 0 | 0 | 0 | 67.23 |
| 7 | 0 | 0 | 0 | 67.80 |
| 8 | 0 | 0 | 0 | 67.51 |
| 9 | 1 | 0 | 1 | 52.14 |
| 10 | 1 | 1 | 0 | 49.33 |
| 11 | 1 | 0 | –1 | 51.03 |
| 12 | 0 | 0 | 0 | 67.49 |
| 13 | 1 | –1 | 0 | 48.22 |
| 14 | 0 | –1 | –1 | 45.11 |
| 15 | 0 | –1 | 1 | 47.11 |
| 16 | 0 | 1 | –1 | 42.09 |
| 17 | 0 | 0 | 0 | 67.44 |
| Source of variance | Sum of square | Degrees of freedom | Mean square | F value | P value | Salience |
| Model | 1 440.41 | 9 | 160.05 | 96.90 | ＜0.000 1 | Significant |
| A-pH | 9.24 | 1 | 9.24 | 5.60 | 0.049 9 | * |
| B-temperature | 0.08 | 1 | 0.08 | 0.048 4 | 0.832 1 | |
| C-time | 40.59 | 1 | 40.59 | 24.58 | 0.001 6 | ** |
| AB | 0.001 2 | 1 | 0.001 2 | 0.000 7 | 0.979 0 | |
| AC | 12.64 | 1 | 12.64 | 7.65 | 0.027 8 | * |
| BC | 5.50 | 1 | 5.50 | 3.33 | 0.110 8 | |
| A2 | 238.63 | 1 | 238.63 | 144.48 | ＜0.000 1 | *** |
| B2 | 524.24 | 1 | 524.24 | 317.41 | ＜0.000 1 | *** |
| C2 | 469.82 | 1 | 469.82 | 284.46 | ＜0.000 1 | *** |
| Residual | 11.56 | 7 | 1.65 | |||
| Pure error | 0.166 5 | 4 | 0.041 6 | |||
| Total dispersion | 1 451.97 | 16 | ||||
| * means significant, ** means very significant, *** means extremely significant. | ||||||
使用Design-Expert软件，绘制响应面三维图及等高线。由图 3A和3B可知，在pH 6.5−7.5、发酵温度25−37 ℃条件下，IOD表现出先升高后降低的趋势。由等高线的弯曲程度可以看出，对于温度和pH对IOD的影响是显著的，温度和pH这两个因素之间的影响不显著。由图 3C和3D可知，在pH 6.5−7.5、发酵时间20−30 h条件下，IOD表现出先升高后降低的趋势，由等高线的弯曲程度可以看出，发酵pH和发酵时间这两个因素均对IOD影响显著，发酵pH和发酵时间这两个因素之间的影响显著。由图 3E和3F可知，在发酵温度25−37 ℃、发酵时间20−30 h条件下，IOD表现出先升高后降低的趋势。由等高线的弯曲程度可以看出，发酵温度和发酵时间对IOD的影响显著，发酵温度和发酵时间这两个因素之间的影响不显著。用Design-Expert 8.0软件对以上试验结果进行分析，通过优化和预测可知，重组菌株的最优发酵工艺为：pH 7.03，发酵温度28.12 ℃，发酵时间25.51 h。在该条件下，重组菌株的IOD为67.80%，在该条件下平行测定3次，进行验证试验，最终得到重组菌株的IOD为68.03%，该预测结果与模型预测值较接近，具有一定参考价值，表明运用响应面分析法优化得到的重组菌株发酵工艺参数可靠。
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| 图 3 pH、温度、时间对IOD影响的响应面三维图与等高线分析 Fig. 3 Response surface 3D map and contour analysis of the effect of pH, temperature and time on IOD. |
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从摇瓶水平放大到发酵罐发酵，重组菌的生长及目的蛋白合成都会有差异，其中溶氧是发酵罐发酵的一个重要参数，更是影响重组菌能量代谢的一个关键因素[25]，同时pH、温度会影响目的蛋白的表达量，因而有必要进行发酵罐发酵工艺的优化研究。
研究发现，在发酵前期，较高的转速对菌体的生长有利，这可能是由于较高转速可提供更充足的氧，但转速提高到350 r/min，在发酵20 h后菌体生长缓慢。300 r/min条件下牛乳铁蛋白N叶的表达量最高(图 4A)，综合转速对菌体生长和目的蛋白表达的影响可以考虑采用分段控制转速的方式，在发酵前期主要考虑菌体的生长，而发酵后期主要兼顾目的蛋白的积累量。
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| 图 4 不同转速(A)、pH (B) 和温度(C) 对重组菌株B. subtilis pMA0911-D60Y/Y92D生长和蛋白表达的影响 Fig. 4 Effect of agitation (A), pH (B), and temperature (C) on cell growth and protein expression of B. subtilis pMA0911-D60Y/Y92D. |
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从图 4B中可以看出在pH 7.5条件下菌株的生长状态较好，但在pH 7.0条件下，牛乳铁蛋白N叶的表达量最高。如图 4C中可以看出，相比于26 ℃和28 ℃，发酵温度为30 ℃时更有利于重组菌的生长，但28 ℃培养更有利于目的蛋白的表达，该重组菌株的发酵过程主要可以分为菌体生长和目的蛋白表达两个阶段，分别在相对应的阶段维持不同的温度，在发酵前期采用30 ℃培养，在发酵后期采用28 ℃表达目的蛋白。
2.2.2 两阶段式温度、pH对重组菌在10 L罐水平上生长和目的蛋白表达的影响前期研究中发现，最适温度与pH对重组菌的生长和目的蛋白的表达不一致，37 ℃和pH 7.5有利于菌体的生长，而28 ℃和pH 7.0则有利于蛋白的表达，为了进一步研究温度与pH对重组菌的生长以及目的蛋白表达的影响，设计了二段式温度、pH对菌体生长和蛋白产量的调控实验。10 L发酵罐装液量7 L，在发酵前7 h即重组菌进入对数生长期前将温度和pH分别设置为37 ℃和pH 7.5，在发酵7−25 h重组菌进入对数生长期，此时目的蛋白开始大量表达，将温度调节为28 ℃，用磷酸和氨水将pH值调节为7.0。
将细胞上清液用HisTrap HP亲和层析及SuperdexTM 200 (10/300 GL) 凝胶色谱法进行纯化，目的蛋白纯化至单一条带，如图 5所示，SDS-PAGE分析表明纯化的乳铁蛋白N叶大小约为37.0 kDa，蛋白纯度为94.3%。相应的A280值的计算和SDS-PAGE分析显示每升重组菌产约23.5 mg牛乳铁蛋白N叶。前期研究中，B. subtilis pMA0911-Pveg-BLF-N中每升培养物约10 mg乳铁蛋白N叶产量[19]，二段式发酵工艺优化使得牛乳铁蛋白N叶表达量提高了2.35倍。
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| 图 5 重组菌株B. subtilis pMA0911-D60Y/Y92D的发酵过程参数(A) 以及重组菌株B. subtilis pMA0911中目的蛋白表达与纯化的SDS-PAGE分析(B) Fig. 5 Fermentation parameters of B. subtilis pMA0911-D60Y/Y92D (A) and SDS-PAGE analysis of expression and purification of target protein in B. subtilis pMA0911 (B). M: marker; lane 1: B. subtilis pMA0911; lane 2: cell-free extracts of B. subtilis pMA0911-Pveg-BLF-N; lane 3: cell-free extracts of B. subtilis pMA0911-D60Y/Y92D; lane 4: purified protein from B. subtilis pMA0911-Pveg-BLF-N; lane 5: purified protein from B. subtilis pMA0911-D60Y/Y92D. |
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牛乳铁蛋白N叶已经在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等宿主中进行表达和性质表征，但表达量不高(表 4)，并且有些宿主菌如大肠杆菌等安全性差。B. subtilis是研究得最为透彻的通常认为是安全的(generally recognized as safe, GRAS) 菌株，其遗传背景清晰，具有完善的基因操作流程并可用于大规模制备。由于BLF的来源匮乏，从牛乳中提取步骤繁琐，因此利用枯草芽孢杆菌为表达宿主，高效合成牛乳铁蛋白N叶的研究具有重要意义。
| Hosts | Yield (mg/L) | Feature | References |
| Escherichia coli | 15.3 | Antibacterial activity | [27] |
| Insect cells | 10.0 | Inhibits E. coli | [28] |
| Bacillus subtilis | 10.0 | Inhibits E. coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa | [19] |
| Bacillus subtilis | 16.5 | Inhibits E. coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa | [19] |
本研究在摇瓶水平上对重组菌株B. subtilis pMA0911-D60Y/Y92D表达牛乳铁蛋白N叶的发酵工艺及响应面分析进行了优化，采用高密度发酵策略对重组菌株进行10 L发酵罐的放大培养，确定了重组菌株最佳的表达条件。由于在菌体生长阶段与目的蛋白表达阶段的最适温度和pH有差异，为了使目的蛋白表达量达到最高，采用二段式发酵方式，即温度和pH分阶段调控发酵策略来提高牛乳铁蛋白N叶的表达量，即发酵前期采用适宜菌体生长温度及pH，后期采用利于蛋白表达的温度及pH，有效地提高了目的蛋白的表达量。与优化前相比，表达量提高了2.35倍[19]。Wei等[26]应用两阶段温度调控策略使得念珠菌中谷胱甘肽的产量提高了2.5倍。发酵产物经纯化后，重组菌每升培养物得到纯度超过94%、产量约23.5 mg的乳铁蛋白。利用枯草芽孢杆菌合成牛乳铁蛋白N叶产量远高于Garcia-Montoya等[27]报道的大肠杆菌中表达的乳铁蛋白N叶15.3 mg/L的产量。后续研究将进一步优化分批补料方式，更好地提高酶的产量。本研究为高效制备牛乳铁蛋白N叶奠定了较坚实的基础，为后续全长的表达优化提供了科学依据。
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