2022, Vol. 38中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 钟桂芳, 邓婷娟, 徐康, 倪温碧, 王裴, 胡伯里, 周继勇
- ZHONG Guifang, DENG Tingjuan, XU Kang, NI Wenbi, WANG Pei, HU Boli, ZHOU Jiyong
- 非洲猪瘟病毒内囊膜蛋白p17与宿主互作蛋白的初步鉴定
- Identification of host proteins interacting with African swine fever virus inner envelope protein p17
- 生物工程学报, 2022, 38(8): 2883-2890
- Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(8): 2883-2890
- 10.13345/j.cjb.220218
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文章历史
- Received: March 20, 2022
- Accepted: May 26, 2022
- Published: May 30, 2022
引用本文
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非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV) 是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae) 家族中唯一成员，是唯一已知通过节肢动物传播的双链DNA病毒[1]。1921年首次在东非地区肯尼亚发现非洲猪瘟(African swine fever, ASF)，自此ASF在非洲国家蔓延。ASFV可以通过直接接触传播，也可以通过污染材料间接传播[2]。自2007年，ASFV入侵欧亚大陆，严重危害野生动物和家畜健康，随着病毒的传播和变异，已经演化出至少24种ASFV基因型[3]。据ASFV基因p72的遗传学分析，2018年8月中国暴发的ASF为基因型Ⅱ[4]，ASFV给我国的养猪业造成破坏性影响[5]。
ASFV颗粒具有独特的多层结构，直径约250 nm[6]。它包括一个含基因的类核体，依次被内蛋白衣壳、内脂蛋白膜、外蛋白衣壳和外脂蛋白膜包裹。病毒基因组有170‒190 kb，含有超过150个开放阅读框，大部分缺乏任何已知或可预测的功能信息[7]。其中一些基因功能已有研究，例如E120R和MGF505-7R等抑制Ⅰ型干扰素[8-9]，E199L诱导细胞凋亡[10]，S273R抑制细胞焦亡[11]。1986年Carrascosa等通过免疫电子显微镜在病毒颗粒内衣壳发现由ASFV基因D117L编码的p17[12]。1995年Simón-Mteo等分析出p17在转录后期表达，绘制其结构并测定序列信息[13]。随后Suarez等发现病毒在形成二十面体结构过程中，p17发挥至关重要的作用。接着Xia等学者发现p17可以通过内质网应激影响细胞周期，抑制细胞增殖[14]。p17在病毒颗粒形成中发挥着重要作用，但其调控宿主细胞生命活动的分子机制还存在大量的未解之谜。因此筛选出与ASFV p17相互作用的宿主因子对探究ASF的致病机制具有重大意义。
本研究采用免疫共沉淀及蛋白质谱技术筛选出与ASFV p17互作的宿主蛋白，通过免疫共沉淀实验和激光共聚焦实验鉴定出线粒体外膜蛋白TOMM70、热休克蛋白HSPA8与ASFV p17存在相互作用关系。
1 材料与方法 1.1 材料及主要试剂HEK293T、3D4/21细胞购自ATCC细胞库并由本实验室保存；pCMV-N-Flag、pCMV-N-Myc、pEGFP-C3真核表达载体购自Clontech Laboratories公司；pCMV-Myc-HSPA1L、pCMV-Myc-TRAP1和pCMV-Flag-HSPA8真核表达载体由实验室保存；HRP标记的羊抗鼠抗体、HRP标记的羊抗兔抗体购自赛默飞世尔公司；Flag、Myc抗体购于杭州华安生物技术有限公司；抗Flag琼脂糖凝珠购于Sigma公司；T4 DNA连接酶、Bio-Best转染试剂、高保真酶、PCR mix、蛋白显色底物溶液购自南京诺唯赞生物科技有限公司；RPMI-1640、DMEM培养基购自英杰生命技术有限公司；限制性核酸内切酶和蛋白质预染Marker购自宝生物公司；质粒抽提试剂盒购自北京天根生化科技(北京) 有限公司；核酸清洁回收试剂盒、核酸切胶回收试剂盒购自杭州新景生物公司；蛋白上样液购自北京索莱宝科技有限公司；FITC羊抗鼠购自KPL公司；A546驴抗兔购自Invitrogen公司。
1.2 构建ASFV p17真核表达质粒根据网上公布的ASFV HLJ/2018基因组序列(GenBank登录号：MK333180.1)，合成含限制性酶切位点EcoRⅠ (GAATTC) 和KpnⅠ (GGTACC) 的ASFV p17序列，通过双酶切连接将目的片段插入到pCMV-N-Flag、pEGFP-C3载体中，经测序验证正确。
1.3 细胞样品制备将HEK293T细胞铺至两个直径10 cm的细胞培养皿中，待单层细胞密度生长达到80%‒90%，分别转染pCMV-N-Flag空载和pCMV-Flag-p17至上述细胞中，36 h后收集细胞进行后续实验。
1.4 免疫共沉淀取上述步骤的细胞，加入600 μL含PMSF的NP40细胞裂解液，4 ℃裂解2 h后12 000 r/min离心5 min，取上清蛋白液，加入35 μL protein G，4 ℃孵育2 h，除去非特异性结合。再3 500 r/min离心5 min，弃protein G沉淀，取上清60 μL并且加入20 μL 4×蛋白上样液作为Input，剩下上清加入10 μL抗Flag琼脂糖凝珠，于4 ℃孵育4 h。3 500 r/min离心5 min，弃去上清，收集琼脂糖凝珠。用预冷PBS洗涤5次琼脂糖凝珠，最后用45 μL NP40重悬，加入4×蛋白上样液15 μL；100 ℃煮沸变性15 min，12 000 r/min离心5 min，取上清备用。
1.5 Western blotting检测取免疫共沉淀样品进行SDS-PAGE，将蛋白条带转印至硝酸纤维膜上，用5%脱脂奶在室温封闭2 h，然后使用PBST洗3次，分步进行一抗和二抗孵育，并于化学发光成像仪中进行显色。使用的抗体为Flag鼠单抗(1︰1 000)、Flag兔多抗(1︰1 000)、HRP-羊抗鼠二抗(1︰8 000)、HRP-羊抗兔二抗(1︰8 000)。
1.6 SDS-PAGE及银染剩余免疫沉淀样品进行SDS-PAGE，蛋白凝胶使用双蒸水冲洗3次，加入固定液(无水乙醇︰冰乙酸︰双蒸水=4︰1︰5) 室温固定2 h，结束固定后取出用双蒸水清洗3次，每次3 min；加入敏化液(硫代硫酸钠1.57 g，醋酸钠34 g，无水乙醇0.15 L，加入双蒸水定容至0.5 L) 敏化30 min，敏化结束用双蒸水冲洗5次，每次3 min；加入银染液(硝酸银1.75 g，37%甲醛50 μL，加入双蒸水定容至0.5 L) 室温避光银染30 min，再使用双蒸水清洗5次，每次3 min；加入显色液(硫代硫酸钠0.015 7 g，甲醛200 μL，无水碳酸钠12.5 g，加入双蒸水定容至0.5 L) 避光显色，观察染色程度，直至大部分目的条带出现加入终止液(5%冰乙酸) 终止显色。
1.7 质谱鉴定切取对照组和实验组之间的差异蛋白条带，送至上海中科新生命公司进行质谱鉴定。
1.8 宿主蛋白真核载体的构建针对猪源宿主蛋白TOMM70设计含限制性酶切位点EcoRⅠ (GAATTC) 和KpnⅠ (GGTACC) 的特异性引物TOMM70-上游(5′-C GGAATTCCGATGGCCGCCTCTAAACCT-3′) 和TOMM70-下游(5′-CGGGGTACCTTACAATGT TGGTGGTTTTAAT-3′)，利用实验室保存的猪源cDNA扩增出目的基因片段，构建pCMV-Myc-TOMM70真核质粒，并送至杭州尚亚生物公司测序验证，转染HEK293T细胞中检测表达。
1.9 免疫共沉淀鉴定蛋白互作分别将pCMV-Flag-p17 (Flag-p17) 和pCMV-Myc-TOMM70 (Myc-TOMM70)、pCMV-Flag-p17和pCMV-Myc-TRAP1 (Myc-TRAP1)、pCMV-Flag-p17和pCMV-Myc-HSPA1L (Myc-HSPA1L)、pCMV-Myc-p17和pCMV-Flag-HSPA8 (Flag-HSPA8)共同转染HEK293T细胞进行免疫共沉淀和Western blotting分析。
1.10 激光共聚焦显微镜实验3D4/21细胞传代铺于六孔板中，待细胞密度约70%，分别将Flag-p17和Myc-TOMM70、Myc-p17和Flag-HSPA8共同转染细胞，待转染24 h后铺板于共聚焦小皿。转染48 h后使用4%多聚甲醛室温固定10 min，0.1% Triton X-100透化细胞10 min，经5%脱脂奶封闭30 min后，孵育一抗Flag和Myc抗体，并用FITC羊抗鼠和A546驴抗兔二抗(1︰500) 指示目的蛋白，DAPI指示细胞核，使用激光共聚焦显微镜观察。
2 结果与分析 2.1 真核表达载体的构建与表达将PCR方法扩增获得的p17基因和TOMM70基因分别克隆至pCMV-N-Flag和pCMV-N-Myc载体中，经测序验证载体构建成功。将构建成功的质粒转染至HEK293T细胞中，通过Western boltting验证TOMM70和p17成功表达(图 1)。
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| 图 1 Flag-p17 (A)、Myc-p17 (B) 和Myc-TOMM70 (C) 重组质粒表达验证 Fig. 1 Western blotting analysis of the expression of recombinant plasmid Flag-p17 (A), Myc-p17 (B) and Myc-TOMM70 (C). |
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检验免疫共沉淀Input和IP样品，p17质粒转染细胞在15‒25 kDa显示一目的条带，说明抗Flag琼脂糖凝珠成功结合了带Flag标签的p17蛋白(图 2A)。进一步通过SDS-PAGE和银染分析免疫共沉淀产物，结果显示，在p17质粒转染细胞中可检测到约17 kDa、70 kDa的蛋白条带(图 2B)。
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| 图 2 免疫共沉淀Western blotting (A)、SDS-PAGE和银染分析(B) Fig. 2 Western blotting (A), SDS-PAGE and silver staining assays (B) of co-immunoprecipitated products. |
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取Co-IP产物的银染产物进行质谱分析，根据覆盖肽段的百分率，筛选出4个与p17潜在互作的宿主蛋白，它们分别是线粒体外膜蛋白(TOMM70)、肿瘤坏死因子受体相关蛋白1 (TRAP1)、热休克蛋白家族成员8蛋白(HSPA8)、热休克蛋白家族成员1样蛋白(HSPA1L)，信息见表 1和图 3。
| Protein ID | Gene name | Unique peptide | Cover percent (%) | Mass (Da) | Score |
| O94826 | TOMM70 | 6 | 7.24 | 67 454.07 | 44.78 |
| K0A7K7 | TRAP1 | 6 | 6.36 | 76 927.11 | 42.47 |
| E9PNE6 | HSPA8 | 4 | 6.00 | 54 975.39 | 52.23 |
| P34931 | HSPA1L | 3 | 3.90 | 70 375.16 | 50.74 |
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| 图 3 潜在宿主互作蛋白TOMM70 (A)、TRAP1 (B)、HSPA8 (C) 和HSPA1L (D) 的质谱图 Fig. 3 Mass spectrum of potential P17 interacting host proteins TOMM70 (A), TRAP1 (B), HSPA8 (C) and HSPA1L (D). |
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在免疫共沉淀实验中用抗Flag琼脂糖凝珠验证ASFV p17蛋白与候选蛋白之间的相互作用，如图 4所示，ASFV p17蛋白可以与TOMM70、HSPA8蛋白互作，但是与HSPA1L、TRAP1蛋白没有互作。
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| 图 4 p17与宿主蛋白TOMM70 (A)、HSPA8 (B)、HSPA1L (C) 和TRAP1 (D) 互作验证 Fig. 4 Confirmation of the interaction between p17 and host proteins TOMM70 (A), HSPA8 (B), HSPA1L (C) and TRAP1 (D). |
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将Flag-p17和Myc-TOMM70、Myc-p17和Flag-HSPA8质粒共转染3D4/21细胞，转染后对样品进行处理，如图 5所示，TOMM70/ HSPA8可以与p17在细胞质内存在共定位现象，进一步说明了TOMM70/HSPA8可以与p17相互作用。
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| 图 5 激光共聚焦TOMM70/HSPA8与p17共定位验证 Fig. 5 Confocal laser co-localization validation of TOMM70/HSPA8 and p17. |
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2018年以来，我国暴发非洲猪瘟(ASF)，公共卫生环境和养殖业受到巨大冲击，研发治疗ASF的药物、疫苗迫在眉睫。研究病毒蛋白与宿主蛋白之间的相互作用可以解析ASFV的致病分子机制，并取得了一定进展。已有报道ASFV通过激活eIF4F复合物增加病毒mRNA的翻译[15]，E120R蛋白与IRF3相互作用达到抑制干扰素的目的[9]，E199L通过与PYRC2的相互作用促进自噬[16]。深入挖掘病毒与宿主蛋白相互作用机制、解析病毒逃逸宿主免疫反应机制，是解决ASFV防控难题的重要途径。
作为ASFV二十面体结构形成的必要基因，p17蛋白能够影响细胞增殖，但是调控宿主细胞功能的分子机制有待深入研究。本研究通过免疫共沉淀技术与质谱鉴定，鉴定出与p17有潜在相互作用的宿主蛋白HSPA8、TOMM70、HSPA1L和TRAP1。进一步验证，仅发现AFSV p17蛋白与线粒体外膜蛋白TOMM70、热休克蛋白HSPA8存在相互作用，而与HSPA1L、TRAP1没有互作。HSPA8作为分子伴侣帮助多肽进行正确折叠和转运，依赖于含有特定KFERQ基序的蛋白与溶酶体相关膜蛋白2A (lysosomal-associated membrane proteins 2A, LAMP2A) 的结合发挥分子伴侣介导自噬作用[17]，同时也是传染性支气管炎的粘附因子[18]，参与猪繁殖和呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 的附着和内化[19]。TOMM70是线粒体外膜的输入受体，作为分子伴侣参与线粒体前体蛋白的识别与输入[20]，SARS-CoV-2 Orf9b与TOMM70互作降低IFN-Ⅰ表达，抑制了Hsp90和伴侣相关蛋白的募集[21]。仙台病毒(SeV) 通过TOMM70/Hsp90/IRF3/Bax蛋白复合物诱导细胞色素c释放到细胞质中，诱导细胞凋亡[22]。本研究首次通过质谱技术筛选到与p17相互作用的宿主蛋白HSPA8、TOMM70，为进一步解析p17的生物学效应提供了信息，提供一些在ASFV感染过程中发挥先天免疫作用机制研究的方向。
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