2023, Vol. 39中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 罗艳, 张静超
- LUO Yan, ZHANG Jingchao
- Ⅳ型菌毛可视化方法及其在菌毛功能研究中的应用
- Visualization method of type Ⅳ pili and its application in the study of pili function
- 生物工程学报, 2023, 39(11): 4534-4549
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(11): 4534-4549
- 10.13345/j.cjb.230082
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文章历史
- Received: February 7, 2023
- Accepted: April 13, 2023
引用本文
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2. 电子科技大学 四川省人民医院 医学遗传中心, 四川 成都 610054
2. Medical Genetics Center, Sichuan Provincial People's Hospital, University of Electronic Science and Technology of China, Chengdu 610054, Sichuan, China
细菌的运动性和致病能力与细胞的表面附属物尤其是突出的纤维结构密切相关。突出纤维结构主要包括菌毛、淀粉样纤维和纳米线[1-3]。其中菌毛是细菌表面的线状结构聚合物，由共价或非共价相互作用的重复菌毛亚基组成。菌毛的分类方法多样，例如根据凝血能力、血清学或结构等进行分类[4-7]，其中基于菌毛组装系统的生物化学和遗传学的分类方法是应用较多且最普遍的方法[8]。这种方法是基于菌毛组装机制，并根据编码菌毛生物发生所需基因序列的同源性对菌毛进行分类。
菌毛结构广泛存在于革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及古细菌中，对于革兰氏阴性菌，其菌毛可分为伴侣蛋白-推进蛋白途径类菌毛、Ⅴ型菌毛、Ⅳ型菌毛、细菌淀粉样纤维和Ⅳ型分泌菌毛。其中，Ⅳ型菌毛(type Ⅳ pili, TFP)是最常见的形式之一，它可以通过胞质三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)驱动其反复伸展、黏附和收缩，灵活地完成不同生物功能。现有研究表明，TFP在细胞黏附、宿主细胞入侵、DNA摄取、蛋白质分泌、生物被膜形成、细胞运动和电子传递中都发挥了重要作用。此外，TFP还是坚固的分子机器，可通过一种跨越两层革兰氏阴性菌膜的复杂蛋白质机制，每秒完成约1 000个亚单位的伸展和收缩[9]，并以微小结构(6–9 nm)承受超过100 pN的力[10]。TFP丰富的生物功能与优秀的力学特性吸引着广大学者不断探索，而活细胞中的TFP可视化技术则为研究TFP相关功能和机制提供了重要支持和关键性证据。
本课题组长期从事TFP在细菌运动行为方面的研究。本文根据课题组当前研究重点以及对TFP的已有研究，并结合文献报道介绍了TFP可视化方法以及其在功能方面的应用。图 1为TFP的可视化方法及主要生物学功能示意图，本文首先介绍了TFP从显微镜的直接观察发展到通过分子生物学方法包括基因改造和外援物辅助进行TFP动态化捕捉。TFP可视化技术的不断提升，为探究TFP功能及机制提供了有力的支持。其次在TFP可视化的基础上介绍了其主要的生物学功能，包括介导细菌运动、生物被膜形成、DNA摄取、电子传递以及作为毒力因子在致病菌中的作用。最后对TFP未来发展的方向提出了展望，期待为利用其生物学功能开发出更加全面多元的应用奠定基础和提供思路。
TFP最初是由电子显微镜直接观察，常见的电子显微镜，如扫描电子显微镜、透射电子显微镜和冷冻电子显微镜，通常需要固定细胞和干扰菌毛活性来表征菌毛(图 2A)[15]。这种方法会错失菌毛活性以及部分结构的真实性。后来低温电子显微镜的使用极大地缓解了细胞表面剪切的缺点，并提供了菌毛分子机器复杂结构和高分辨率3D模型[16-18]。然而，这种方法需要通过冷冻来固定细胞，并要对大量结构图像进行平均以编译结构模型，而无法提供有关菌毛的机械动力学信息。随着显微成像技术的提高，几种光学显微镜技术也可以用来观察菌毛，其中最简单的方法是使用免疫荧光显微镜技术，该方法使用连接荧光的抗体标记TFP，但荧光抗体会与延长的菌毛结合，导致菌毛聚集并阻碍细胞活动[19]。以上观察菌毛的技术都会对菌毛正常生理功能造成一定干扰，为解决这一问题，后来出现一种称为干涉散射显微镜(interference scattering microscope, iSCAT)的无标记光学技术[20-21]，可以在无需标记的情况下以高空间和时间分辨率直接可视化活细胞的菌毛运动[21]。然而，这种非遗传方法需要特定的光学仪器，该方法只能观测到细菌在表面运动时TFP的动态，不能观察TFP在液体环境的动态，目前尚缺乏运用该方法在溶液中对于菌毛在表面的运动进行观测的报道。也有研究报道了使用荧光纳米珠可视化蓝藻(Cyanobacteria) TFP的方法，并展示了在趋光运动中菌毛的时空动态与细胞运动方向的相关性[22]。同时光学陷阱(optical trap)也被用于表征菌毛的运动特性和测量TFP与表面之间的吸引力[10, 23-25]。
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| 图 2 TFP可视化方法 Fig. 2 TFP visualization methods. A：PilS对菌毛的贡献，金黄色葡萄球菌KK03和KK03pilS的负染色透射电镜观察[15]. B：铜绿假单胞菌非鞭毛细胞Cy3标记TFP的观察[26]. C：不同浓度阿拉伯糖诱导下铜绿假单胞菌PBAD-pilAS99C菌株染色菌毛的荧光图像[29] A: Contribution of PilS to pili, negative staining transmission electron microscopy of Staphylococcus aureus KK03 and KK03pilS[15]. B: Observation of Cy3-labeled TFP on nonflagella cells of Pseudomonas aeruginosa[26]. C: Fluorescence image of stained TFP of P. aeruginosa PBAD-pilAS99C strain induced at different concentrations of arabinose[29]. |
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通过荧光染料染色是一种较好的菌毛可视化方法，根据染色机理不同分为两种方法。一种是对菌毛附件进行染色，例如使用氨基特异性花青素荧光染料(cyanine 3, Cy3)标记(图 2B)[22, 26]。该方法荧光染料与菌毛的结合特异性低，表面积远大于菌毛的细胞体也会与荧光染料结合并具有更强的荧光强度，从而影响对菌毛的观察。另一种方法是TFP的氨基特异性荧光标记，实现TFP伸长和收缩的直接可视化。有研究表明，通过将甘露糖敏感的血凝素Ⅳ型菌毛(mannose sensitive hemagglutinin, MSHA)或霍乱弧菌(Vibrio cholerae) Ⅳ型菌毛的主要菌毛蛋白的丝氨酸改为半胱氨酸，用特异性较好的马来酰亚胺染料进行染色[27-28]。但是使用文献报道的方法会修改细菌基因组，通过这种遗传操作在细菌基因组中获得的PilA无法还原为原始PilA，并且在研究pilin池的补充动态方面有一定限制。
笔者团队基于半胱氨酸替代方法，以铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)为例，引入了一种简单的、可切换的方法，在保持原有细菌基因组的情况下，使用含有诱导启动子和半胱氨酸替代菌毛基因的质粒能够在需要时标记菌毛，此方法是对P. aeruginosaa来源的pilA基因进行定点突变，用半胱氨酸替代丝氨酸并以重组质粒的形式导入宿主P. aeruginosaa中，由于重组质粒本身含有阿拉伯糖诱导型启动子araBAD序列，因此只有阿拉伯糖存在时，才能诱导目的基因的表达。由此突变pilA组装后的TFP可以成功地用硫醇反应性马来酰亚胺染料染色，而从培养基中去除阿拉伯糖后，具有突变TFP的细胞则可以转换回具有原始TFP的类型，从而实现菌毛可视化(图 2C)，此外，本团队还探究了菌毛牵引的P. aeruginosaa在介质表面的蹭行运动行为，以及生物被膜形成过程中菌毛的作用[29]。同样地，基于这种便捷的菌毛标记方法，本团队也实现了多种细菌的菌毛可视化，并在此基础上针对菌毛介导的各种生物行为进行了深入探究，例如通过V. cholerae的菌毛可视化，本团队详细记录并分析了其黏附表面的过程及其在液体环境中的菌毛驱动机制[30]；通过黄色黏球菌(Myxococcus xanthus)的菌毛可视化，探究其运动以及捕食行为等。
在多种菌毛可视化工具涌现的背景下，着眼于微观单细胞层面的研究蓬勃发展，而TFP这一亚细胞结构的功能和机理也变得更加清晰直观。下文将对TFP的功能进行综述。
2 TFP的功能研究进展TFP是多功能细胞器，通过可逆聚合和解聚而具有灵活的伸缩能力。随着菌毛可视化工具的开发和应用，对于TFP的功能研究从宏观走向微观，从表象转向细节。它们在细胞运动、生物被膜形成、DNA摄取、电子转移和毒力因子中发挥的重要作用也逐渐被揭示。
2.1 运动原核生物使用TFP在固体表面的爬行称为蹭行运动[31-32]。早期研究提出蹭行运动是由细菌表面的菌毛系统完成的：菌毛伸展与表面结合，然后收缩，从而拉动细菌运动[33]。在多种细菌中都可以观察到TFP的蹭行运动，如 P. aeruginosa、M. xanthus、V. cholerae等。其中P. aeruginosa的运动行为是典型的蹭行运动，它利用TFP作为线性致动器进行表面探索，实现定向爬行。细菌附着到表面后，TFP驱动两种表面运动机制：当细菌平行于表面时，沿着其身体轴线“爬行”，方向持久性高；当它处于站立状态，身体轴线垂直于表面时，可向任意方向“行走”，方向持续性低[31]。并且不同的运动机制在特定场景中发挥优势，直立行走对细菌即时搜索环境更有效，而爬行运动对远距离趋化行为更有效[34]，此外，TFP与其他运动器官的博弈与配合决定细菌的运动模式，细菌的站立状态更有利于细菌的表面脱离，细菌首先通过菌毛的收缩由匍匐状态转变为站立状态，然后通过鞭毛的旋转实现表面脱离。在V. cholerae中，菌毛还能够在运动中起到锚定的作用[30]，然而对于TFP如何从鞭毛介导的游泳运动到靠近表面从而依靠TFP的牵引黏附于表面的具体机制尚不清楚。
得益于TFP可视化质粒工具的开发，结合细菌显微追踪技术，可以直观地观测到TFP在细胞运动中的牵引方式。在细胞运动中存在少数主导菌毛，它们的伸缩可以牵动细胞的移动，也存在着一些菌毛进行无效伸缩，无法牵动细胞的移动，而这些无效伸缩的TFP是否能够介导其他的生物功能，则需要更详细的研究。
除了蹭行运动，TFP还介导细菌完成一些其他形式的运动，如群集运动。该运动发生在黏度低于标准蹭行运动的介质上，例如0.3%的琼脂板上。群集运动的特征是群集扩展形成精细的树枝状图案[35-36]。在特定的营养条件下，TFP是群集运动所必需的，但在某些条件下，TFP缺失的菌株不会失去群集运动，反而表现出超群集表型[37]。TFP在不同营养条件下对群集运动的影响不同，可能是因为在不同条件下细菌的代谢路径和信号转导机制不同。TFP对群集运动影响的确切机制尚不清楚，但计算机模拟表明TFP是促进细胞间相互作用、限制单个细菌运动和减缓群集运动扩张的主要机制。尽管TFP减缓了群集运动的扩张，但体外研究表明TFP有助于改变群集运动的方向，以避免有毒化合物的伤害，如抗生素羧苄青霉素[38]，TFP除了作为运动器官发挥功能外，可能在细菌群体感应中也具有一定作用。
M. xanthus具有单独(A)和社会(S)运动系统，TFP是S运动所必需的，但不是A运动所必需。没有菌毛的细胞在聚集、S运动和细胞凝集方面存在缺陷[39]。S运动系统主要负责群体协调运动，该运动中极性定位可能是由TFP延伸、黏附到原纤维部分以及随后的收缩所驱动的[40]。位于前导细胞极的TFP将自身锚定在相邻细胞的碳水化合物部分(或A运动细胞留下的黏液轨迹上)，并通过延伸、附着和缩回的循环来推进细胞。为了扭转方向，细菌将一极的TFP解聚，另一极重新组装[41]。
TFP驱动的蹭行运动在细菌趋化、趋光性中具有控制运动方向的作用。在P. aeruginosa中，随着趋化因子浓度的改变，TFP介导的运动方向会发生逆转，细胞会向二甲基亚砜(dimethylsulfoxide, DMSO)或琥珀酸浓度增加的方向运动。细胞运动中的方向反转如细胞停止运动随后向相反的方向运动与活跃的TFP有关(图 3A)[42]。细长聚球菌(Synechococcus elongatus) PCC 6803的蹭行运动方向受TFP定位控制。有学者通过荧光纳米珠吸附的方式来标记Syn6803的TFP，进而研究细胞在趋光过程中的TFP行为，Syn6803通过TFP定位到远离光源的一侧来实现负趋光运动，TFP的伸展和收缩在照明的前侧被激活以远离光源(图 3B)[22]，该趋光运动依赖于Ⅳ型粗菌毛[43]。单个细胞的运动性是有限的，但当细胞分裂或聚集到一定的群体大小时，可以观察到运动性和趋光性的增加。在运动的后期，会有明显的趋光性，呈现手指状突出[44]。
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| 图 3 TFP功能举例 Fig. 3 Examples of TFP functions. A：当细菌离开趋化剂溶液时，细菌通过蹭行运动逆转运动方向进行趋化[42]. B：TFP主要分布在光照区[22]. C：ΔpilA生物被膜有簇(左边)，WT生物被膜均匀(右边)[31]. D：不锈钢上不动杆菌CLSM成像生物被膜的三维重建[55]. E：用AF488 mal标记的pilA和荧光标记的DNA共培养的延时成像[61]. F：金属呼吸过程中的TFP动力学[73]. G：菌毛在脑膜炎球菌发病机制中作用的示意图[86]. H：新药导致几种病原菌TFP解体[91] A: Twitching bacteria chemotax by reversing their motility when traveling away from the chemoattractant source[42]. B: TFP are mainly distributed in the light area[22]. C: ΔpilA biofilm has clusters (left), WT biofilm uniform (right)[31]. D: Three-dimensional reconstruction of Acinetobacter CLSM imaging biofilms on stainless steel[55]. E: Time-lapse imaging of co-culture with AF488 mal-labeled pilA and fluorescently labeled DNA[61]. F: TFP dynamics during metal respiration[73]. G: Schematic diagram of the role of TFP in the pathogenesis of Meningococcus[86]. H: The new drug led to the disintegration of several pathogenic bacteria TFP[91]. |
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TFP是一种重要的黏附素，有助于细菌最初附着到各种固体表面，在这些表面上附着、聚集，逐步形成有组织的、多细胞甚至是多物种的群落，这种群落又被称为生物被膜。TFP在生物被膜的形成中起关键作用，它参与了表面黏附和微菌落的形成。没有菌毛的细胞会形成异常的生物被膜，这表明完整功能的TFP对生物被膜结构很重要(图 3C)[31]。而更有趣的是，在实验过程中，经常观察到在生物被膜微聚体会有很多断裂菌毛的存在，它们虽然脱离了菌体，但互相搭建，辅助细菌及胞外聚合物形成了生物被膜基础骨架。通过菌毛标记，可以追踪生物被膜微聚体中的菌毛细胞，细胞在TFP的牵动下规避其他细胞，不断爬行从而扩大繁殖领地，逐渐形成成熟的生物被膜。也有研究者将半胱氨酸残基引入主要菌毛ComP，再用硫醇反应性马来酰亚胺荧光染料进行标记以观察贝利不动杆菌(Acinetobacter baylyi)的TFP，发现TFP的亚细胞定位可以驱动复杂细菌群落的多细胞发育，控制多细胞相互作用[45]。P. aeruginosa能够形成蘑菇状多细胞结构，帽子和柄由不同亚群组成。之前的研究表明P. aeruginosa生物被膜中蘑菇状结构帽子部分是通过细菌运动导致的，并取决于TFP；据后续研究报道，TFP连接的化学感觉系统中的PilH和ChpA突变体在帽子形成中也显示出轻微缺陷[46-48]，因此TFP以及相关的调控对P. aeruginosa生物被膜均有一定影响。有研究表明TFP在生物被膜形成的早期具有重要作用，在艰难梭菌(Clostridium difficile)中，TFP缺乏菌株在其初始生物被膜中存在缺陷，形成了厚度和生物量降低的生物被膜，并且与野生菌株相比具有较低的聚集趋势[49]。此后，在许多细菌和古菌中也发现了类似的现象，包括V. cholerae、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、新月弯曲杆菌(Campylobacter crescent)、气单胞假单胞菌(Aeromonas pseudomonas)和嗜酸链球菌(Streptococcus acidophilus)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii) (图 3D)等[50-55]。
生物被膜的形成不仅需要菌毛的表达，还需要菌毛收缩[39]。在P. aeruginosa中，缺乏PilT的突变细胞形成变厚且未分化的生物被膜[56]。TFP的正常回缩对生物被膜结构的影响具有重要意义，有计算机模拟研究了淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)菌毛收缩蛋白缺失菌株(ΔpilT)和野生菌共培养后形成微菌落的状态，TFP不能收缩的细菌分布在微菌落的边缘，而能够进行收缩的细菌则分布在微菌落的中心[57]。TFP的收缩状态会影响细菌的分布位置，因此，收缩蛋白不仅会影响TFP的动态活性，而且TFP-TFP的相互作用还可能有助于细菌完成不同种类细菌的分选。
TFP的存在以及动态收缩都会影响生物被膜的结构，TFP介导的蹭行运动也对于生物被膜具有一定影响，丧失蹭行运动和过度的蹭行运动都会破坏生物被膜的形成[58]，菌毛的完整生理功能对于生物被膜的形成具有重要作用，可能包括以下原因：(1) 菌毛的正常伸缩以及相互作用有助于细菌选择适合的空间位置；(2) 菌毛伸展感应到外界变化收缩，从而产生的信号转导对于细菌形成生物被膜具有指示作用。由于细菌显微追踪技术很难追踪生物被膜中的单个细菌以及TFP的状态，因此TFP在生物被膜形成中的具体作用阶段或机制仍然未知，未来可通过可视化技术来捕捉TFP在生物被膜形成中的动态过程。
2.3 DNA摄取自然转化是细菌从环境中吸收DNA的水平基因转移形式之一。TFP除了拉动细菌在表面进行运动，还能够辅助细菌摄取细胞外DNA完成自然转化，菌毛介导的DNA摄取对于细菌产生耐药性具有重要作用，且可能对感染期间体内和非生物表面的生物被膜形成很重要。有研究表明DNA摄取是TFP的保守功能，TFP有助于细菌吸收细胞外DNA以供自己使用[12, 59]，这种现象发生在许多细菌中，包括N. gonorrhoeae、脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis)、V. cholerae等。
TFP在不同细菌中DNA摄取的机制也有差异。肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是第一个被报道自然转化现象的革兰氏阳性菌，研究者提出2种DNA摄取模型：回缩模型和墙孔模型，收缩模型中，转化的菌毛将直接捕获DNA，在收缩的ATP酶的帮助下，DNA被拉过细胞壁，在细胞质膜中被ComEA捕获[60]。菌毛可视化技术使回缩模型更具有说服力，将半胱氨酸密码子基因引入ComGC后用AF488-mal标记肺炎链球菌菌毛，发现它是高度动态的结构[61]。TFP与细胞外DNA结合，并通过收缩ATP酶的作用将DNA拉入周质空间，然后DNA进一步转移到胞质溶胶中，在那里可以发生同源重组，由此说明菌毛的收缩对于自然转化至关重要[61]。革兰氏阳性菌其他物种的菌毛也可能具有可伸缩性，且在DNA摄取中发挥积极作用(图 3E)[61]。在革兰氏阳性菌中，DNA摄取机制与Ⅳ型菌毛和Ⅱ型分泌系统有基本相似之处。革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌在构成转化机制所需的蛋白质方面具有基本的相似性，在大多数细菌中，所需蛋白质与Ⅱ型分泌(T2S)系统和Ⅳ型菌毛(TFP)系统同源，这些系统的关键成分是主要和次要的蛋白、前肽酶和ATP酶[62-64]。虽然这3个系统在功能上有很大的不同，但它们都是由主要的菌毛蛋白组成的纤维结构。
TFP在DNA摄取过程中的具体作用机制不断被发现。在革兰氏阴性菌中，N. meningitidis膜分离的菌毛复合物能够与DNA显著结合，PilQ的N-末端区域能够与DNA相互作用，并且ssDNA比dsDNA与PilQ结合具有更高的亲和力，TFP在伸缩过程中，PilQ蛋白打开通道，外源DNA可进入通道与相应受体结合并被转运进细胞周间质[65-66]。天然活性的V. cholerae对DNA的摄取至少经历2个步骤：进入的DNA通过外膜依赖于菌毛的易位，以及DNA通过周质进入细胞质的不依赖于菌毛的穿梭。Ellison等利用TFP可视化明确了TFP在自然转化过程中介导DNA摄取的机制，TFP通过其尖端与细胞外双链DNA结合，菌毛收缩将尖端结合的DNA带到细胞表面，菌毛收缩与DNA内化时空耦合[9, 67]。随后的研究中发现V. cholerae的DNA摄取菌毛与几丁质表面结合，是几丁质定殖所必需的，并通过序列特异性的自我相互作用实现亲属识别[68]。
TFP在自然转化中发挥的作用已在很多菌株中有详细研究，但不同菌株的摄取机制不同，尚有许多菌株自然转化机制不明。自然转化导致细菌产生耐药，甚至多重耐药，并且多重耐药菌株可能具有更强的自然转化能力，因此在多种耐药菌中关于TFP在DNA摄取中的功能是未来研究的一个重点。
2.4 电子传递TFP还在特定时期起着导电的作用，它能够在细胞和细胞外电子受体间传递电子，这对土壤和沉积物中有机物的降解和养分循环至关重要。目前已报道的TFP导电的细菌包括硫还原地杆菌(Geobacter sulfurreducens)和氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)，然而这2种菌TFP导电的电子受体和供体不同。有研究报道T. ferrooxidan TFP可能作为生物纳米线将电子从氧化亚铁表面转移到细胞表面[69]。在固体介质上，T. ferrooxidan需要TFP来氧化Fe(Ⅱ)，TFP是细胞表面与Fe(Ⅱ)氧化物之间的电子连接，负责将Fe(Ⅱ)氧化物表面的电子转移到细胞表面[69]，然而T. ferrooxidan中哪些pilin蛋白参与了Fe(Ⅱ)氧化物向细胞的电子转移，以及进行电子转移过程中是否有其他物质的参与尚不明确。
与T. ferrooxidan相比，G. sulfurreducens以其TFP的“金属样”导电性而闻名[70]，早期有学者使用导电探针原子力显微镜观察发现 G. sulfurreducens菌毛具有很高的导电性，它能够将电子从细胞表面转移到氧化物表面，菌毛缺陷突变体不能还原铁(Ⅲ)氧化物并且芳香族氨基酸在菌毛导电中起关键作用[71-72]。有研究者提出电子传递中PilT发挥重要作用[73]。TFP回缩释放了还原的矿物质，并回收了膜中的菌毛蛋白，为新一轮的菌毛蛋白聚合和电子释放做好了准备，菌毛伸出和缩回的拮抗循环允许细胞继续“呼吸” (图 3F)[73]。除了作为电子转移到Fe(Ⅲ)氧化物的通道外，菌毛还可能参与其他电子转移反应。例如，单个地杆菌细胞的菌毛通常缠绕在一起，增加了细胞间电子通过菌毛转移的可能性[74-75]。然而近期有几项研究报道G. sulfurreducens中真正发挥导电作用的是细胞色素而不是TFP[76-78]，打破了人们的固有认知，但不论是TFP还是其负载的色素蛋白具有导电功效，未来可以通过基因编辑改变菌毛结构和组成，进而产生功能多样的生物纳米线。生物纳米线具有许多吸引人的材料特性，很容易大规模生产且不含有毒成分，可回收[79]。此外，生物纳米线能够对其他环境参数作出反应，将来可应用于纳米线传感装置中[72]。生物纳米线具有在细胞之间或细胞与传统电子设备之间建立电子连接的潜力，为生物电子应用提供了广阔的可能性。
2.5 致病因子TFP是许多致病菌的毒力因子，促进其黏附宿主细胞、形成生物被膜并激活炎症通路。多项研究中发现TFP是细菌致病的重要因素。在土拉热弗朗西斯菌(Francis tularensis)皮下感染中，无菌毛突变体致死感染所需的剂量是野生型菌株的105倍[80-82]。在P. aeruginosa中，TFP通过结合宿主来源的N-葡聚糖介导与肺上皮细胞的黏附从而引起感染，但相关的糖蛋白尚不清楚[83]。TFP介导的蹭行运动参与 P. aeruginosa的发病机制，在体外使用多层角膜上皮细胞证实，在上皮细胞易位过程中，pilT或pilU突变体的蹭行运动受损，表现出类似菌毛缺失菌株的表型，因此与细胞的相互作用减弱，细胞逃逸感染[84-85]。
N. meningitidis可有效黏附在宿主上，该能力与多种细胞成分有关，包括外膜蛋白，如TFP、Opa和Opc等，其中TFP的作用已得到了充分研究。N. meningitidis依靠TFP黏附后，在宿主内皮细胞表面快速复制，形成大而封闭的微菌落，进而引起血管内凝固和过度炎症，迅速导致坏死(图 3G)[86]。也有研究表明菌毛回缩在脑膜炎球菌致病和感染中具有重要作用，菌毛回缩缺陷型脑膜炎球菌(ΔpilT)能有效地在人体移植微血管上繁殖，但这种突变菌由于减弱了与宿主的黏附，进而使细菌从定殖的微血管中释放出来，因此不会引发持续的菌血症导致小鼠死亡，毒性较低[87]。在肺炎链球菌(Streptococcus pneummoniae)中，有菌毛菌株在全身感染期间诱发更高的肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)反应[88]。因此TFP不仅有助于黏附和毒力，而且能够刺激宿主的炎症反应。
TFP协助细菌感染的过程包括菌毛收缩并与宿主细胞紧密接触，从而促进细菌毒素通过Ⅲ型分泌系统转移；蹭行运动使细菌在感染组织中传播；TFP转导传递宿主细胞黏附的信号，然后触发导致细菌感染的基因表达。最近的几项研究报道了几种化合物能够抑制TFP活性，一种是三氟拉嗪和相关的吩噻嗪，它们通过改变钠梯度快速诱导TFP的分解(图 3H)，另一种是能够抑制TFP组装所需的PilF活性分子供给(化合物B)[89-91]。基于PilF的模型结构，有学者发现2种化合物(COCONUT IDs CNP0030078和CNP0051517)具有抑制ATP酶的潜力，以上化合物不仅能够指导今后开发抗TFP药物，也可能具有对抗神经系统相关疾病的生物活性[92]。除化学药物外，也有研究报道天然产物也能够抑制TFP功能，有研究通过高通量筛选鉴定出槲皮素是M. xanthus PilB的抑制剂，能够降低TFP依赖运动性和TFP组装[93]。也有研究表明天然产物侧柏叶颗粒剂能够抑制产气荚膜梭菌(Clostridium perfringen) TFP相关基因的转录，阻止菌毛蛋白的合成，进而抑制TFP介导的功能[94]。许多细菌病原菌使用其TFP促进和维持对人类宿主的感染，因此研发抑制TFP组装或功能的药物在治疗和预防感染方面具有广阔的应用前景。
3 总结与展望在日益进步的观测技术加持下，TFP这一纳米级的亚细胞结构的神秘面纱逐渐被揭开，人们开始了解该细微结构在微生物运动、聚集、导电、捕获外源DNA和侵染宿主等方面发挥的至关重要的作用。但是，关于TFP还有更多已知方面需要去挖掘和探索。例如，(1) 引入自动化图像识别与处理技术提高数据采集效率，总结TFP在执行具体行为(如DNA摄取)时的状态变化，在纳米尺度与毫秒量级展示TFP分子机器的工作方式；(2) 在不断开发的可视化方法基础上测量其长度、数量和力等物理量，进而通过计算机构建其在不同状态中的运动模型，探究TFP在不同条件(如pH、温度、溶液浓度等)的运动模式，为合成和开发仿生运动体、微型机器人等提供理论模型；(3) TFP的不断伸展和收缩使细菌在表面上的运动已经被详细地描述，TFP介导的细菌在表面的蹭行运动已有较多研究，但对于TFP在液体环境中的作用及其动力学研究较少，未来有望与更有效的TFP可视化工具相结合，进而了解TFP在液体环境中的对细菌游泳运动的贡献；(4) 将微流控技术与显微追踪技术相结合，在短时间、有限空间且不受其他因素干扰的情况下更加详细观察TFP在趋化、趋光以及细胞相互作用中发挥的具体作用；(5) TFP的导电性实现了微生物与其胞外环境之间的长距离电子交换，TFP的导电性具有易产生、可降解和可改性的优点，未来可作为电子传感元件和可再生电子材料；(6) TFP的毒力在于黏附、蹭行运动以及生物被膜，目前已经开发出几种药物可以阻断TFP的功能，在未来的致病菌的防治研究中，可以开发更多针对TFP的药物以及结合包括TFP在内的多种蛋白质疫苗，与抗生素的联合将有助于解决细菌耐药性问题；(7) TFP的研究大多聚焦于单种菌株，对于不同菌株相互作用中TFP会发生哪些行为变化以及作用机制研究较少。目前有研究报道P. aeruginosa感应到S. aureus分泌物后从集体运动转变为单细胞运动，同时速度和方向性都有所增加，并发现这种探索性运动是由TFP所驱动[95]，但具体机制尚不清楚。研究不同菌属之间以及病原菌与宿主之间的相互作用将有助于理解致病菌的侵染方式以及为细菌耐药性的治疗提供策略；(8) 目前关于TFP的调控研究多基于测序、代谢组学等宏观生物手段，或用细胞运动等侧面表征TFP，缺乏基于实时直观可视化的TFP调控研究，探究TFP的调控将有助于更深入地了解其生理活动。
综上所述，TFP的研究在多个领域取得了长足发展，人们对于TFP的形态结构、生物功能等已有一定的了解，但都处在早期基础研究阶段，还未得到实际的应用，相信在未来的研究中，随着科技的发展与进步，TFP的更多功能和机制将被揭示，TFP有望在生物学、医学以及生态学等领域具有广泛的应用。
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WAKSMAN G, HULTGREN SJ. Structural biology of the chaperone-usher pathway of pilus biogenesis[J]. Nature Reviews Microbiology, 2009, 7(11): 765-774. DOI:10.1038/nrmicro2220
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