跨膜p24 (transmembrane emp24 domain, TMED)蛋白主要参与细胞内蛋白质的运输和囊泡的形成^[1]，在免疫反应、信号传导、胚胎发育和疾病发展等方面发挥重要作用^[2]。鉴定家蚕以及其他昆虫的TMED家族基因，分析其蛋白结构特征和进化关系，并探究相关基因在家蚕中的表达模式，可为深入研究家蚕TMED基因的生物学功能奠定基础，并为后期家蚕的利用以及农林害虫的防控提供线索。

TMED蛋白是一种分子量约为24 kDa的I型跨膜蛋白，广泛存在于真核生物，参与了细胞内分泌途径的早期和晚期，特别是在内质网和高尔基体之间的早期分泌途径中发挥着重要作用^[3-4]。TMED蛋白包含4个特征结构，即高尔基体动力学(Golgi-dynamics, GOLD)结构域、假定的卷曲螺旋(coiled-coil, CC)结构域、单个跨膜结构域和一个胞质侧的短肽段^[5]，其中N端的GOLD结构域和CC结构域共同形成腔内结构，在蛋白质的识别和转运中起着重要的调节作用；C端胞质侧的短肽段包含与外被体蛋白(coat protein, COP)复合物结合的序列，以便其调节蛋白质在内质网和高尔基体之间的双向运输^[1]。TMED家族分为α、β、γ和δ这4种类型，每个类型在进化中独立发展，成员数量因物种而异^[5]。在哺乳动物中，α类包含TMED4、TMED9和TMED11这3个成员，主要参与癌细胞增殖转移和自噬体形成^[6-8]；β类仅TMED2一个成员，在胚胎发育和先天免疫信号传导中发挥着重要作用^[9-10]；γ类有TMED1、TMED3、TMED5、TMED6和TMED7这5个成员，其中TMED1主要参与调节白介素(interleukin, IL)的信号传导^[11]，TMED3和TMED5与结肠癌、肝癌、乳腺癌和宫颈癌等密切相关^[12-13]，TMED6低表达会造成胰岛素分泌下降^[14]，TMED7主要参与Toll样受体4的信号传导调节^[15]；δ类仅有TMED10一个成员与细胞凋亡、无信号肽的胞质蛋白释放以及阿尔茨海默病有关^[16-18]。在昆虫中，迄今仅有黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的TMED报道。黑腹果蝇α类包括eclair和p24-2两个成员，eclair突变个体将无法发育至成虫，并且神经系统中低表达eclair会导致雌性黑腹果蝇繁殖力下降，p24-2主要在成虫中表达^[19-20]；β类成员CG9308在雄性组织中表达，在雌性中表达较低，成员CHOp24的突变能够特异性降低雌性的产卵数量但不影响雄性的生育能力^[19-20]；γ类包括p24-1、logjam、opossum和CG31787这4个成员，p24-1的突变使雌性黑腹果蝇的产卵数减少^[19]，logjam在神经中的表达与雌性排卵行为紧密相关，其突变将上调核因子κB (nuclear factor kappa-B, NF-κB)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)信号通路下游的免疫调节基因^{[19, 21]}，opossum在胚胎发育和Wnt信号通路中发挥着不可或缺的作用^[22]；δ类仅baiser一个成员，它和eclair以及CHOp24参与Wingless/Wnt早期分泌途径^[23]。

昆虫上有关TMED的报道仅局限于黑腹果蝇，其他昆虫TMED研究较为缺乏。本文通过生物信息学手段，从基因组上鉴定昆虫TMED基因，分析其进化历史和蛋白结构特征以及家蚕TMED基因表达模式，为后续研究提供基础和参考。

供试家蚕品系为大造品种，由本实验室保存。蚕卵在温度25 ℃、相对湿度70%−80%条件下催青。幼虫饲养条件：温度28 ℃、12 h光照/12 h黑暗、湿度70%−80%。质粒的提取和目的片段胶回收试剂盒购自Qiagen公司。载体pMD19-T Vector、限制性内切酶和T4 DNA连接酶为TaKaRa公司产品。DNA marker购自Biomed公司。TRIzol、2×Taq Master Mix、2×super-Fidelity Master Mix和反转录试剂盒由ProbeGene公司生产。上样缓冲液3×Gelstain Red Prestain购自苏州恒宇生物科技有限公司。测序和所有引物的合成均由重庆擎科生物科技有限公司完成。放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay, RIPA)裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、一抗稀释液、α-tubulin (TUBA4A)和山羊抗兔二抗购自上海碧云天生物技术有限公司。PAGE凝胶快速制备试剂盒(10%)和三色预染蛋白Marker为上海雅酶生物医药科技有限公司产品。BmTMED6多克隆抗体由武汉金开瑞生物工程有限公司制备。

从GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)检索家蚕(Bombyx mori)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、烟草天蛾(Manduca sexta)、意大利蜂(Apis mellifera)、黑腹果蝇和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)的基因组序列文件、注释文件和蛋白质序列文件。InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/)数据库中获得TMED典型的EMP24_GP25L结构域氨基酸序列模板。利用HMMER 3.0软件的hmm search程序在家蚕、赤拟谷盗、烟草天蛾和意大利蜂基因组中查找TMED蛋白，预测值小于0.1，对昆虫TMED蛋白进行初步筛选。使用Search InterPro在线工具和SMART软件对获得序列进行分析，删除不符合TMED家族结构域的序列。使用ClustalX和DNAMAN软件将筛选到的蛋白质序列反复进行多序列比对，删除多余的重复序列。对鉴定得到的昆虫TMED蛋白进行多序列比对，以秀丽隐杆线虫tmed-13为外群利用MrBayes软件(WAG模型)构建进化树，利用MEGA 11和Adobe Illustrator软件对进化树进行美化和注释。

利用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive)与蛋白质结构数据库(protein data bank, PDB)进行比对，获得已解析三维结构的人类TMED10 (PDB ID: 5azx)、TMED2 (PDB ID: 5azw)和TMED1 (PDB ID: 7rrm)的GOLD结构域，尚未解析GOLD结构域的TMED蛋白用Search InterPro在线工具进行预测。信号肽、CC结构域和跨膜结构域使用SMART软件进行预测。序列比对结果利用Espript (https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)网站进行美化，PowerPoint软件进行注释。在NCBI数据库中获取家蚕TMED基因家族各成员在染色体上的位置信息、DNA序列和cDNA序列信息。在ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)输入家蚕TMED基因DNA序列，预测开放阅读框(open reading frame, ORF)。Splign (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/splign/splign.cgi?textpage=online&level=form)输入cDNA序列和DNA序列，对家蚕TMED基因外显子和内含子分布进行分析。家蚕TMED基因Gene symbol分别为：BmTMED9: LOC733126、BmTMED1: LOC101746327、BmTMED6: LOC101740707、BmTMED3: LOC101744862、BmTMED2: LOC101737070、BmTMED5: LOC101740180和BmTMED10: LOC733098。把克隆测序的序列翻译为氨基酸序列，使用在线工具ExPaSy (https://www.expasy.org/)预测蛋白序列基本理化性质。

除血淋巴直接加入TRIzol外，用液氮研磨卵、1−5龄幼虫(除去消化道内容物)、蛹、雌蛾和雄蛾以及5龄3 d的神经、表皮、头部、中肠、丝腺、马氏管、精巢、卵巢和脂肪体成粉末后加入Trizol，提取总RNA。利用1%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别对RNA的完整性纯度和浓度进行检测。最后用M-MLV反转录酶系统反转录RNA以获得cDNA模板。

根据鉴定的7个家蚕TMED基因，利用Primer 5.0软件设计ORF全长cDNA引物(表 1)。利用表 1引物进行PCR扩增，PCR扩增反应体系：模板200 ng，2×Super-Fidelity Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.7 μL，最终加ddH₂O至总体积为25 μL。反应体系配制完成并瞬时离心后置入PCR仪进行扩增，扩增条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，退火温度50 s，72 ℃ 1 min，共35个循环；72 ℃ 10 min。取全部PCR产物与5 μL上样缓冲液混匀，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，将目的片段进行切胶回收，并与pMD-19 Vector载体连接，转化挑选阳性克隆，经过公司测序，最后得到cDNA序列，将测序正确的阳性菌液扩大培养，提取重组质粒，−20 ℃保存备用。

根据上述克隆的7个家蚕TMED基因序列，利用Primer 5.0软件设计SqRT-PCR的特异性引物，并且以GenBank中家蚕肌动蛋白A3 (Bmactin A3)序列(NCBI序列号：NM_001126254)设计内参引物(表 2)。以上述cDNA为模板sqRT-PCR检测目的基因中的表达情况。PCR扩增反应体系：模板100 ng，2×Taq Master Mix 7.5 μL，上下游引物各0.7 μL，最终加ddH₂O至总体积为15 μL，反应体系配制完成并瞬时离心后置入PCR仪进行扩增。Bmactin A3扩增条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，共28个循环；72 ℃ 10 min。BmTMEDs扩增条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 40 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 30 s，共28个循环；72 ℃ 10 min。取5 μL PCR产物与2 μL上样缓冲液混匀，用1%琼脂糖凝胶进行电泳，Bio-Rad凝胶成像系统成像并分析结果。

取家蚕组织放入提前预冷好的研钵中充分研磨，加入苯基硫脲抑制黑化，按照RIPA裂解液说明书提取总蛋白，用BCA蛋白浓度测定方法测量总蛋白浓度。将各样品蛋白稀释到相同浓度用100 ℃变性10 min后上样(20 μL，蛋白总量40 μg，根据多次WB结果进行微调)，在200 mA恒流下进行SDS-PAGE，转膜45 min至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜，5%脱脂奶粉室温摇床孵育2 h封闭，含有吐温-20去垢剂的三羟甲基氨基甲烷盐缓冲液(Tris buffered saline with Tween-20, TBST)漂洗3次，每次15 min (室温摇床)，一抗和二抗孵育后，化学发光底物(electrochemiluminescence, ECL)显色液显色。

根据已得到的家蚕、赤拟谷盗、烟草天蛾和意大利蜂的基因组序列文件、注释文件和蛋白质序列文件，鉴定了它们的TMED家族基因，发现家蚕有7个TMED家族基因，赤拟谷盗有6个TMED家族基因，烟草天蛾有7个TMED家族基因，意大利蜂有5个TMED家族基因。这4类昆虫TMED各自包含1个α类基因、1个β类基因、1个δ类基因和多个γ类基因(表 3)。

线虫的TMED基因有7个^[2]，黑腹果蝇的TMED基因有9个^[24]。用线虫、家蚕、黑腹果蝇、赤拟谷盗、烟草天蛾和意大利蜂，共41个TMED基因的氨基酸序列构建进化树，结果如图 1所示，所有TMED基因聚为α类、β类、δ类、γ类TMED3-like、γ类TMED5-like和γ类TMED6-like共6个独立的聚集群，其中α类聚集群和δ类聚集群相聚后与β类聚集群汇合，γ类TMED3-like聚集群位于它们的外围，γ类其他2个聚集群(TMED5-like群和TMED6-like群)分布相对较远，平行靠近树根(Cetmed-13，线虫γ类基因)。在α类、δ类、γ类TMED3-like、γ类TMED5-like和γ类TMED6-like聚集群，群内的TMED基因聚集与物种进化关系高度一致。在β类聚集群中，家蚕与烟草天蛾的β类TMED基因(TMED2)聚成一个小支，线虫Cesel-9基因与意大利蜂和赤拟谷盗的TMED2基因相聚成另一个小支，黑腹果蝇的DmCG9308和DmCHOp24依次坐落于两个小支的外围，暗示黑腹果蝇β类TMED基因在进化中可能发生了亚功能化。除γ类TMED5-like聚集群缺失蜜蜂的TMED基因外，每一个聚集群都聚集了所有昆虫的TMED基因。

图 1 TMED家族基因进化树 Fig. 1 Evolutionary tree of the TMED gene family. Ce: Caenorhabditis elegans, Cetmed-4 NP_507861.1, Cetmed-10 NP_505879.1, Cesel-9 NP_001370673.1, Cetmed-3 NP_491892.1, Cetmed-1 NP_502288.1, Cetmed-12 NP_508054.1, Cetmed-13 NP_741426.2.

图选项

分别分析人类、家蚕、黑腹果蝇、赤拟谷盗、烟草天蛾和意大利蜂TMED蛋白的α、β、γ和δ氨基酸序列，预测比对4类蛋白的结构，注释TMED家族典型的4个特征结构：GOLD结构域、CC结构域、单个跨膜结构域和一个胞质侧的短肽段，其中GOLD结构域由8个β折叠构成，C端胞质侧的短肽段长度不等，但是大多数都符合ΦFXXBB(X)_n形式(Φ是大的疏水残基，B是碱性残基，X可以是任何氨基酸，n≥2)。昆虫TMED家族蛋白N端都具有明显的信号肽，属于分泌蛋白，与TMED蛋白参与早期和晚期分泌作用吻合(图 2)。

图 2 昆虫TMED蛋白多序列比对和结构分析 Fig. 2 Multiple sequence alignment and structural analysis of insect TMED proteins. A：α类. B：δ类. C：β类. D：γ类 A: α class. B: δ class. C: β class. D: γ class. Hs: Homo sapiens, HsTMED9 NP_059980.2, HsTMED10 NP_006818.3, HsTMED2 NP_006806.1, HsTMED1 NP_006849.1.

图选项

昆虫α类蛋白的GOLD结构域、CC结构域和跨膜结构域非常保守。除果蝇的α类Dmp24-2蛋白外，其他昆虫α类蛋白的尾部序列都以ΦFFEAKKLV的形式存在，该序列有ΦF的结构，可以结合COPII亚基，参与COPII包被的囊泡运输，同时KKLV是经典的KKXX序列，能够直接参与COPI蛋白包被的囊泡运输。果蝇Dmp24-2蛋白在尾部跨膜区和C端胞质侧的短肽段与其他昆虫α类蛋白存在较大差异，尾部序列不符合ΦFXXBB(X)_n形式，可能无法直接参与囊泡运输(图 2A)。δ类的CC结构域、跨膜结构域和C端胞质侧的短肽段非常保守，但不同目昆虫δ类的GOLD结构域保守性略低。δ类C端胞质侧的短肽段以ΦFKAKKLIE的形式存在，具有ΦF结构参与COPII包被的囊泡运输，同时也能依赖KK序列与COPI蛋白直接结合(图 2B)。β类C端胞质侧的短肽段家蚕和烟草天蛾以FFEVQRVV的形式存在，赤拟谷盗和意大利蜂以FFEVRRVV的形式存在，果蝇则是FFEVKRVV，但三者均符合ΦFXXBB(X)_n形式，都可以与COPII亚基结合。黑腹果蝇TMED的β类有DmCHOp24和DmCG9308两个成员，其蛋白序列在GOLD结构域和CC结构域存在一定差异(图 2C)。γ类序列保守性较低，保守氨基酸残基主要分布在GOLD结构域和跨膜结构域。C端胞质侧的短肽段存在保守的ΦF结构，可能保留了与COPII亚基结合的能力(图 2D)。

利用设计的全长引物，以5龄幼虫cDNA为模板进行PCR扩增成功克隆获得家蚕7个TMED基因全长ORF，结果如图 3所示。

图 3 家蚕TMED家族基因克隆 Fig. 3 Cloning of the TMED gene family in the silkworm. 1：BmTMED9；2：BmTMED2；3：BmTMED3；4：BmTMED5；5：BmTMED6；6：BmTMED1；7：BmTMED10. M：DL2000 marker 1: BmTMED9; 2: BmTMED2; 3: BmTMED3; 4: BmTMED5; 5: BmTMED6; 6: BmTMED1; 7: BmTMED10. M: DL2000 marker.

图选项

将克隆的基因测序后上传至GenBank并获得了相应的登录号，7个基因的ORF分别为654、615、633、735、750、678、618 bp，编码217、204、210、244、249、225、205个氨基酸，外显子数目分别为4、4、4、1、5、6、5个。染色体定位分析发现BmTMED10和BmTMED5均位于25号染色体，剩下的其他5个基因分别分布在家蚕23、16、6、10、24号染色体上。7个TMED基因预测蛋白分子量为25 040.75、23 315.60、23 951.21、27 817.94、28 725.56、26 198.63、23 681.51 kDa，具有TMED分子量大小特征。它们的等电点介于4.70−6.65 (表 4)。

提取家蚕5龄3 d幼虫的头、神经、丝腺、中肠、马氏管、脂肪体、血液、精巢、卵巢和表皮10个组织的总RNA，反转录为cDNA，利用RT-PCR特异性引物检测各个组织中TMED家族基因的表达情况。结果如图 4A所示：BmTMED2、BmTMED1和BmTMED6基因在各组织都有表达，不同组织之间的表达量相近；BmTMED9在丝腺中高量表达，在精巢、中肠、马氏管中有较高表达；BmTMED5除在中肠和血淋巴中不见表达外，在其他8个组织中的表达都较高；BmTMED3仅在丝腺中高表达，在其他组织不表达或低量表达；BmTMED10表达量在丝腺中最高，在马氏管和卵巢中次之，在中肠、血淋巴和精巢中较低。

图 4 家蚕TMED家族基因表达模式 Fig. 4 Expression patterns of the silkworm TMED family genes. A：组织特异性表达模式. B：时期特异性表达模式 A: Tissue-specific expression pattern. B: Developmental stage-specific expression pattern.

图选项

提取家蚕卵、1−5龄幼虫、蛹以及雌蛾和雄蛾的RNA，利用RT-PCR特异性引物检测TMED家族基因在家蚕不同时期的表达情况。结果如图 4B所示：BmTMED2、BmTMED1和BmTMED6基因在各时期均有表达，其中BmTMED2和BmTMED1在不同时期表达量相对稳定，而BmTMED6在1龄幼虫中的表达显著高于其他时期；BmTMED9和BmTMED10表达模式相似，除2龄幼虫和雄蛾中不表达外，其他各时期均有表达，其中又以5龄幼虫中的表达量最高；BmTMED5在2龄和5龄幼虫中高表达，在4龄幼虫和雌雄蛾中有较低表达，其他时期未见明显的表达条带；BmTMED3在4龄高量表达，在1龄和雌蛾微弱表达，在其他时期均未见明显的扩增条带。

Western blotting检测显示，BmTMED6在5龄3 d各组织(图 5A)和各个时期(图 5B)都有蛋白条带，而且组织之间或时期之间的条带深度没有明显差异。这个结果与基因转录水平分析结果相似。

图 5 BmTMED6蛋白水平检测 Fig. 5 BmTMED6 protein level detection. A：各个组织的BmTMED6蛋白. B：各个时期的BmTMED6蛋白 A: BmTMED6 protein in individual tissues. B: BmTMED6 protein at various stages.

图选项

TMED基因广泛存在于植物和动物内，动物中TMED包括α、β、γ和δ这4个类型，植物中TMED仅有β和δ两个类型^[1]，已有研究显示，哺乳动物中共有10个TMED基因，线虫共有7个TMED基因，果蝇共有9个TMED基因^[2]。本研究从家蚕中共鉴定了7个TMED基因，从烟草天蛾中共鉴定了7个TMED基因，赤拟谷盗中共6个TMED基因，意大利蜂中共5个基因，TMED家族基因数目因物种而异。哺乳动物TMED家族的构成模式为3个α类成员、1个β类成员、1个δ类成员和5个γ类成员，同一类型TMED包含的成员数目在物种间差异较小。两栖动物TMED的γ类成员比哺乳动物缺少一个，却在δ类拓展出独有的成员^[25]。分析烟草天蛾、赤拟谷盗、意大利蜂和家蚕，发现它们的TMED家族各自都包含1个α、1个β、1个δ和多个γ类基因，认为这种1个α、1个β、1个δ和多个γ类的TMED家族构成模式产生于鞘翅目、鳞翅目和膜翅目的共同祖先。黑腹果蝇的TMED包括2个α类、2个β类、1个δ类和4个γ类基因^[24]。分析同属双翅目的埃及伊蚊(Aedes aegypti)和冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)，发现它们的TMED成员构成却是α、β和δ类各1个，γ类多个，与前4种昆虫完全相同。鞘翅目昆虫大约于284万亿年(Ma)前分化形成，膜翅目昆虫分化形成早于鞘翅目，鳞翅目和双翅目分化产生晚于鞘翅目^[26]。因此推断，1个α类、1个β类、1个δ类和多个γ类的昆虫TMED家族构成模式产生于约284万亿年(Ma)前，2个α类、2个β类、1个δ类和多个γ类的TMED家族构成模式是果蝇类发展形成的独特模式。人类、黑腹果蝇、烟草天蛾、赤拟谷盗、意大利蜂和家蚕TMED蛋白序列的同源性，在α类、β类和δ类分别为69%、67%和67%，表现出物种间高度的保守性，在γ类为36%，保守性较低，进化速度较快。昆虫TMED的α类、β类、δ类和γ类在构建的进化树中各自独立聚集成群，而且α类聚集群与δ类聚集群关系最近，这与哺乳动物TMED进化树的拓扑结构相似。昆虫TMED的γ类分化成了3个不同的亚类，这与哺乳动物TMED的γ类分化以及γ类与β类关系有很大不同^[25]。进化树中的α类聚集群、β类聚集群、δ类聚集群、γ类TMED3-like聚集群和γ类的TMED6-like聚集群中都聚集了所有昆虫的TMED基因。γ类TMED5-like聚集群缺失蜜蜂的TMED基因，但线虫Cetmed-1与昆虫γ类TMED5-like群聚在一起，显示了它们之间的同源性。同时，分析大黄蜂(Bombus bifarius)、大虎头蜂(Vespa mandarinia)、阿根廷蚁(Linepithema humile)和切叶蚁(Acromyrmex echinatior)，结果在这4种膜翅目昆虫中也没发现γ类TMED5-like基因。于是推定，TMED家族基因在昆虫祖先中就分化形成了α类、β类、δ类、γ类TMED3-like、γ类TMED5-like和γ类TMED6-like这6种类型，膜翅目昆虫在进化中丢失了γ类TMED5-like基因。此外，在TMED5-like聚集群，家蚕TMED5与烟草天蛾TMED5聚成支，家蚕TMED1与烟草天蛾TMED1相聚成支，而黑腹果蝇的2个γ类TMED5-like聚在一起。分析发现冈比亚按蚊和埃及伊蚊都只有1个γ类TMED5-like基因。这可能是γ类TMED5-like基因在鳞翅目昆虫祖先中发生了复制事件、在果蝇类发生了重复引起。

本文鉴定的4类昆虫共25个TMED蛋白均具有TMED家族的典型特征结构(EMP24_GP25L)，它们N端都具有信号肽，属于分泌蛋白，这与TMED家族蛋白存在早期和晚期分泌途径吻合。TMED蛋白的GOLD结构域由两个四股反向平行的β折片组成，主要通过同源寡聚化介导蛋白质的相互作用，并参与物质的识别^[27]。例如：TMED1的GOLD结构域可以以盐依赖的方式在溶液中形成同源二聚体^[28]，同时可以和生长刺激表达基因2蛋白(growth stimulation expressed gene 2, ST2)的白细胞介素受体(Toll/interleukin receptor, TIR)结构域相互作用参与白介素-33 (interleukin-33, IL-33)信号的传导^[11]；TMED3可识别N-糖基化的膜蛋白，并把它们募集到TMED复合物中^[29]。在昆虫中发现不同类型TMED的GOLD结构域的空间结构较相似，但其氨基酸序列长度不等，同一性也较低。α类的GOLD结构域序列非常保守，δ和β类的GOLD结构域序列相对保守，而γ类的GOLD结构域仅有9个保守的氨基酸残基，推测TMED的GOLD结构特征与其生物学功能相关。CC结构域是一种在生物大分子中普遍存在的蛋白质结构域，通过α螺旋形成一种稳定的螺旋卷曲结构^[30]。在TMED蛋白中，CC结构域参与不同亚型TMED蛋白之间的相互作用，以及复合物的形成^[31-32]。本文类比推测了昆虫TMED蛋白CC结构域所处的大致位置，发现CC结构域在TMED蛋白内部形成一个螺旋卷曲区域，认为这个CC结构域可能会增加蛋白质的稳定性，并作为蛋白质相互作用形成二聚体或多聚体的接触界面，为TMED蛋白组合多样性和功能多样性提供物理条件。跨膜结构域通常由17−25个疏水氨基酸残基组成，其主要结构为α螺旋，具有将蛋白质嵌入细胞膜中的功能，在胞内物质分选过程中发挥关键作用^[33]。在TMED蛋白中，跨膜结构域对鞘磷脂具有高度选择性，鞘磷脂能够影响TMED蛋白的跨膜螺旋二聚化^[34-35]，与C端胞质侧的短肽段共同决定TMED蛋白的正确定位^[36-37]。昆虫同类TMED蛋白的跨膜结构域序列非常保守，氨基酸残基数量为20左右，不同类的跨膜氨基酸残基组成却存在差异。这个结果说明昆虫不同类型的TMED蛋白可能有着不同跨膜能力，在其运输途径和分选功能上可能有所不同。C端胞质侧的短肽段指TMED蛋白跨膜区域后面的一段短的氨基酸序列，通常只包含数个氨基酸残基，有与COPI或者COPII复合物相互作用的序列，保守性低，具有类型特异性^[38]。这段短的氨基酸序列调节TMED蛋白在细胞内的分布和定位，参与信号转导、蛋白质的分泌和转运^{[1, 5, 39]}。昆虫γ类TMED蛋白中具有非常保守的ΦF结构而无明显的KKXX特征序列。δ类尾部具有KKLIE序列与α类尾部的KKLV序列相似，但是KKLIE序列与COPI亚基的结合能力可能比KKLV序列与COPI亚基的结合能力弱^[1]。β类尾部则为Q/R/K+RVV序列，植物β类的TMED蛋白C端RV序列被提出参与内质网输出^[1]，因此推测昆虫β类尾部Q/R/K+RVV序列可能影响该类成员在内质网和高尔基体之间的往返运输。有意思的是，果蝇α类Dmp24-2尾部不含ΦF或KKXX序列，推测其无法直接行使相应功能。利用Cell-PLoc 2.0对家蚕TMED蛋白进行亚细胞定位预测，结果发现除TMED2和TMED10定位在细胞膜和微粒体，其他TMED蛋白均定位在内质网中，这符合了TMED蛋白参与蛋白合成转运的特点。

在哺乳动物中，TMED2主要参与胚胎发育和免疫信号传导^[40-41]；TMED1同样与免疫有着密切联系^[11]；而TMED6则影响葡萄糖代谢^{[14, 42]}。果蝇β类成员DmCHOp24主要在Wnt信号途径和雌性生殖中发挥功能，γ类TMED6-like的Dmlogjam则在神经系统中影响雌性排卵行为^[19-20]。因此推测家蚕TMED基因在不同组织和时期表达的差异性，可能源于不同基因负责不同类型的细胞内膜转运、促进不同蛋白质的合成和运输、调控不同的细胞分化过程，最后发挥它们各自不同的生物学功能。BmTMED2、BmTMED1和BmTMED6在各个时期和组织中都有表达，并且表达量相似，暗示它们在家蚕的基础生命活动中发挥了作用。利用BmTMED6蛋白的多克隆抗体进行免疫印迹实验，结果表明其蛋白水平与转录水平一致。BmTMED9在5龄期表达量最高，尤其在丝腺组织表达浓烈，在精巢、马氏管和中肠有明显表达带，推测它与5龄丝腺快速增长扩张密切相关，并与精巢、马氏管和中肠的生物学功能有一定联系。BmTMED5仅在5龄期和2龄期有明显的表达带，其中5龄期更亮，且在除中肠和血淋巴以外的5龄各个组织中都有明亮的表达带，推测BmTMED5在5龄期发挥了多种生物学功能。BmTMED3在整个生命周期中仅在4龄期有明显表达，在5龄幼虫组织中仅在丝腺有明显表达，推测BmTMED3为4龄幼虫生长发育以及5龄丝物质大量积累提供了独特作用。BmTMED10在除2龄以外的各个时期都有明显表达，表明了它在家蚕生长发育中的重要性；在丝腺高量表达，在生殖腺和马氏管也有较高的表达，暗示它可能在丝蛋白合成分泌、生殖腺发育和马氏管排泄上发挥了作用。这些结果为进一步研究每个BmTMED基因的具体生物学功能提供了科学依据。

本研究鉴定了家蚕、烟草天蛾、赤拟谷盗和意大利蜂的TMED家族基因，发现了1个α、1个β、1个δ和多个γ类的昆虫TMED家族成员构成模式，以及2个α类、2个β类、1个δ类和多个γ类的果蝇TMED家族成员构成独特模式，分析了它们的进化历史及蛋白结构特征，克隆了家蚕7个TMED基因的全长ORF，检测了家蚕TMED基因的表达模式。这是继黑腹果蝇后第二个关于昆虫TMED的工作。