生物工程学报  2023, Vol. 39 Issue (2): 537-551
http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.220774
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
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文章信息

阳文龙, 徐楚, 韩嘉琪, 张晓辉, 宋江萍, 贾会霞, 王海平
YANG Wenlong, XU Chu, HAN Jiaqi, ZHANG Xiaohui, SONG Jiangping, JIA Huixia, WANG Haiping
芥菜WOX基因家族的全基因组鉴定与分析
Genome-wide identification and characterization of the WOX gene family in Brassica juncea
生物工程学报, 2023, 39(2): 537-551
Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(2): 537-551
10.13345/j.cjb.220774

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Received: September 26, 2022
Accepted: November 1, 2022
Published: November 25, 2022
 Abstract              PDF               Figures               Tables
引用本文
阳文龙, 徐楚, 韩嘉琪, 张晓辉, 宋江萍, 贾会霞, 王海平. 芥菜WOX基因家族的全基因组鉴定与分析[J]. 生物工程学报, 2023, 39(2): 537-551.
YANG Wenlong, XU Chu, HAN Jiaqi, ZHANG Xiaohui, SONG Jiangping, JIA Huixia, WANG Haiping. Genome-wide identification and characterization of the WOX gene family in Brassica juncea[J]. Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(2): 537-551.
芥菜WOX基因家族的全基因组鉴定与分析
阳文龙1 , 徐楚1,2 , 韩嘉琪1,2 , 张晓辉1 , 宋江萍1 , 贾会霞1 , 王海平1     
1. 中国农业科学院蔬菜花卉研究所, 北京 100081;
2. 山西农业大学, 山西 太谷 030801
收稿日期：2022-09-26；接收日期：2022-11-01；网络出版时间：2022-11-25
基金项目：财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系项目(CARS-24-A-01)；中国农业科学院创新工程项目(CAAS-ASTIP-2022-IVFCAAS)；国家园艺种质北京蔬菜分库运行服务项目(NHGRC2022-NH01)
摘要：WUSCHEL相关-同源盒(WUSCHEL related-homeobox, WOX)基因家族是一类植物特有的转录因子基因家族，在植物的生长发育过程中发挥重要作用。本研究利用芥菜(Brassica juncea)基因组数据，通过HUMMER、Smart等软件进行检索筛选，共鉴定出51个WOX基因家族成员。利用Expasy在线软件对这些家族成员的蛋白质分子量、氨基酸序列长度、等电点等进行分析，并利用生物信息学软件对芥菜WOX基因家族进化关系、保守区域、基因结构等进行系统性分析，将芥菜WOX基因家族分为古老支、中间支和WUS支/现代支3个亚家族。结构分析表明，同一亚家族内的WOX转录因子家族成员的保守结构域的种类、组织形式以及基因结构具有高度的一致性，而不同亚家族之间呈现一定的多样性。51个WOX基因不均匀分布于芥菜18条染色体上，这些基因的启动子大多含有响应光、激素和非生物逆境胁迫相关的顺式作用元件。利用转录组数据和实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)分析发现，芥菜WOX基因的表达具有时空特异性，其中BjuWOX25、BjuWOX33、BjuWOX49可能在角果的发育中发挥重要作用，BjuWOX10、BjuWOX32和BjuWOX11、BjuWOX23分别在干旱和高温胁迫响应中具有重要功能。上述结果为芥菜WOX基因家族的功能研究奠定了基础。
关键词：芥菜    WOX基因家族    生物信息学分析    
Genome-wide identification and characterization of the WOX gene family in Brassica juncea
YANG Wenlong1 , XU Chu1,2 , HAN Jiaqi1,2 , ZHANG Xiaohui1 , SONG Jiangping1 , JIA Huixia1 , WANG Haiping1     
1. Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;
2. Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China
Received: September 26, 2022; Accepted: November 1, 2022; Published: November 25, 2022
Supported by: This work was supported by the China Agriculture Research System of Ministry of Finance and Ministry of Agriculture and Rural Affairs (CARS-24-A-01), the Science and Technology Innovation Project of Chinese Academy of Agricultural Sciences (CAAS-ASTIP-2022-IVFCAAS), and the National Horticultural Germplasm Centre Project (NHGRC2022-NH01)
Corresponding author: YANG Wenlong, E-mail: yangwenlong@caas.cn;
WANG Haiping, E-mail: wanghaiping@caas.cn.
Abstract: The WUSCHEL related-homeobox (WOX) family is one of the plant-specific transcription factor families, playing important roles in plant growth and development. In this study, 51 WOX gene family members were identified from the genome data of Brassica juncea by searching and screening with HUMMER, Smart and other software. Their protein molecular weight, amino acids numbers, and isoelectric point were analyzed by using Expasy online software. Furthermore, bioinformatics software was used to systematically analyze the evolutionary relationship, conservative region, and gene structure of the WOX gene family. The mustard WOX gene family was divided into three subfamilies: ancient clade, intermediate clade, and WUS clade/modern clade. Structural analysis showed that the type, organization form and gene structure of the conservative domain of WOX transcription factor family members in the same subfamily were highly consistent, while there was a certain diversity among different subfamilies. 51 WOX genes are distributed unevenly on 18 chromosomes of mustard. Most of the promoters of these genes contain cis acting elements related to light, hormone and abiotic stress. Using transcriptome data and real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR) analysis, it was found that the expression of mustard WOX gene was spatio-temporal specific, among which BjuWOX25, BjuWOX33, and BjuWOX49 might play an important role in the development of silique, and BjuWOX10, BjuWOX32, and BjuWOX11, BjuWOX23 respectively might play an important role in the response to drought and high temperature stresses. The above results may facilitate the functional study of mustard WOX gene family.
Keywords: Brassica juncea    WOX gene family    bioinformatics analysis    

WUSCHEL相关-同源盒(WUSCHEL related-homeobox, WOX)蛋白家族是真核生物转录因子同源异型结构域(homeodomain, HD)蛋白homeobox (HOX)大家族中植物特有的1个亚支，在植物胚胎发生、干细胞维护和根的形成等关键发育过程中起着重要作用[1-2]。典型的HD包括60–66个氨基酸残基，组成helix1-loop-helix2-turn-helix3的空间结构，起到与特异DNA序列结合的作用[3]。系统发育分析发现，WOX家族可分为3支：WUS支/现代支、中间支和古老支[4-5]。Lian等和Ikeda等通过对50种植物中350个WOX基因的生物信息学分析发现，低等植物中的WOX成员仅来自古老支；现代支的WOX成员仅存在于高等植物中；中间支在维管植物中开始出现，暗示中间支和现代支可能是经过古老支成员复制和分化形成的[6-7]。自1996年Laux等[2]克隆得到了WUS基因以来，很多物种如拟南芥、水稻、小麦、玉米、油菜、棉花、大豆、菜豆、番茄、黄瓜、大蒜等都已克隆到WOX家族基因[8-18]。拟南芥中共有15个WOX基因，其中WUS和WOX1–WOX7属于WUS支/现代支，中间支包括WOX8、WOX9、WOX11和WOX12，古老支包括WOX10、WOX13和WOX14[5]。功能分析发现，WUS和WOX5分别在茎尖分生组织(shoot apical meristem, SAM)和根尖分生组织(root apical meristem, RAM)的中心细胞中表达，具有维持干细胞分裂的功能[3, 19-20]。WOX2和WOX8、WOX9均在合子中表达，与胚胎早期顶—基部的形成相关[21]。WOX3主要在分生组织的外围表达，对营养时期和生殖时期干细胞的表达调控有重要作用[22]。WOX4参与SAM和RAM中维管束的形成与发育[23]。WOX6主要在胚珠中表达并调节胚珠的发育，在珠被和卵细胞的形成过程中防止细胞的提前分化[24]，WOX6也参与冷胁迫的应答[25]。WOX13、WOX14在根部及花药表达，并且受到严格调控，具有防止提前分化的功能[26]。其他植物中的研究也表明，WOX家族基因在植物生长发育过程中发挥着重要作用，且具有时空表达特异性，此外还参与激素、生物和非生物逆境胁迫的响应[27-28]。

芥菜(Brassica juncea)是我国重要的加工蔬菜作物，常年种植面积达100万hm2，在人们生活和国民经济中占有重要地位。芥菜按食用器官可分为叶用、茎用、根用、薹用芥菜和籽芥，不同类型的芥菜生长发育特性存在较大差异，因此研究对其生长发育起重要调控作用的WOX基因是至关重要的。但由于芥菜是异源四倍体(AABB)，基因组比较复杂，给芥菜WOX基因的研究带来了挑战，目前还未见芥菜WOX基因相关的研究报道。鉴于此，本研究利用芥菜基因组信息通过生物信息学方法对芥菜WOX基因家族的组成在全基因组水平进行鉴定，并进一步对基因结构、染色体分布、启动子顺式作用元件、表达谱进行分析，以期为后续芥菜WOX基因的功能研究提供参考。

1 材料与方法 1.1 芥菜WOX基因的全基因组鉴定

从TAIR网站(https://www.arabidopsis.org/)下载拟南芥蛋白质氨基酸序列数据，从BRAD网站(http://brassicadb.cn/#/)下载芥菜蛋白质氨基酸序列数据。用TBTools软件(https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases)提取已报道的拟南芥15个WOX蛋白质氨基酸序列。将拟南芥的WOX蛋白质氨基酸序列作为query序列BLASTP比对(e‒ value < 1e‒5)芥菜蛋白数据，获得这些序列的同源序列并删除其中的重复序列。同时，在Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)下载WOX保守结构域(PF00046)作为模板序列，利用HMM3.0比对得到含有保守结构域的蛋白质氨基酸序列。将上述2种比对方法获得的候选蛋白质氨基酸序列合并，去除重复序列。进一步利用Pfam序列搜索(http://pfam.xfam.org/)、Batch CD-Search分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和HMMER序列分析(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan)验证候选蛋白是否含有WOX保守结构域，删除不完整或者缺失WOX结构域的候选基因，最终获得芥菜WOX基因。

1.2 系统发育进化树的构建和基因结构分析

利用Clustal_W工具将拟南芥和芥菜的WOX蛋白质氨基酸序列进行多重比对，将比对结果放入MEGA 7.0软件，在p-distance模型、bootstrap参数1 000和成对删除选项下采用邻接法(neighbor-joining method, NJ)构建系统发育进化树。从BRAD数据库(http://brassicadb.cn/#/)下载的芥菜基因组数据提取芥菜WOX基因的DNA query和CDS query，利用TBTools进行基因结构展示。

1.3 芥菜WOX基因编码蛋白的理化性质分析、二级结构分析和亚细胞定位

利用Expasy (https://web.expasy.org/protparam/)在线软件预测芥菜WOX蛋白的氨基酸长度、分子量和等电点。利用SOPMA在线软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测分析α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲。利用cello软件[19]对芥菜WOX基因或蛋白进行亚细胞定位预测。

1.4 芥菜WOX基因染色体定位和顺式作用元件分析

利用TBTools软件分析获得芥菜WOX基因在染色体上的物理位置，并绘制WOX基因在染色体上的分布图。用TBTools软件截取芥菜各WOX基因上游2 kb序列，并将其提交至PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和NEWPLACE在线软件(https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?sid=&lang=en&pj=640&action=page&page=newplace)进行启动子顺式作用元件的预测并手动整理。

1.5 芥菜WOX基因的表达分析

从芥菜转录组数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE64242)下载芥菜干旱和高温胁迫的转录组数据FPKM (fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)值[29]，标准化后作为表达分析数据。用TBtools软件构建基因表达热图。

分别在叶芥A960 (安徽叶芥)的盛花期取成长叶、花和花茎，盛果期取灌浆角果，立即液氮速冻，存放于–80 ℃冰箱。使用Trizol试剂(天根生化科技有限公司)提取芥菜叶、花、花茎和角果的总RNA，使用FASTKING一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂(KR118) (天根生化科技有限公司)按说明书进行cDNA合成。以cDNA的5倍稀释液为模板进行扩增，于荧光定量PCR仪(ABI QuantStudio 6 Flex)中进行实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)检测芥菜BjuWOX基因的表达情况，所用引物见表 1，每个样品进行3次生物学重复实验。以芥菜的GADPH基因为内参基因，使用2‒ΔΔCT方法计算BjuWOX基因的相对表达量，将数据导入SPSS 22.0软件分析差异显著性，利用Excel2007和Origin8.5制作图表。

表 1 实时荧光定量PCR引物 Table 1 Primers used for real time fluorescence quantitative PCR
Gene name Forward primer (5′→3′) Reverse primer (5′→3′)
BjuWOX01 GTGGTGGTGTTGGTGGTTCTTCTAA TCAGCCTGACATGCCATACTCCT
BjuWOX04 GGACTAAGTGTGGACGGTGGAATC ACACGTTCTTGCTCTCGATCTTACC
BjuWOX08 GCAACTTCACCAACAACAACTCCAA AGCAGCAAGCGAAAGACGAATGA
BjuWOX09 GCCTGTCTCAATAGCGATGGTAGC CTCTGTGTTCCTTGCTCCTCTTGTC
BjuWOX10 GGCTCAGGCTCAGGAGGAATGTA TTGATCTTCTGCTTGCTCGGTGTC
BjuWOX14 GGTGGAATGCGGACTCCTAACG GGTTGTTCCTCTTCTGCTTCTGTCT
BjuWOX17 GCTCGCTCTCCTCCACAACTCT TGTCTCCGTTATCTGTCCGTGTTCA
BjuWOX19 AAGAAGAGATTCAACGGCACAGTCA ACGCATTAAGAGCACCACATTCAGT
BjuWOX22 ACTACAACAACGGAGTTCGGTCAC GGTGCTGAAGAAGAGGATGATGGTT
BjuWOX25 ACCGAGCACCGATCAGATTCAGA TGCAACGTCTCTATCACCTTCTCCT
BjuWOX26 ACTCGCTAAGCAACTTCACCAACAA ACAGATGGGAGAAGGCTGAGAACA
BjuWOX27 GCCTGTCTCAATAGCGATGGTAGC TCCTGTGTTCGTTGCTGCTCTTG
BjuWOX32 GACACCGAGCAAGCAGAAGATCAA CTCCACCTCAGACTCACCATTGTTG
BjuWOX33 GCATAGGAACACCGAGCAAGCAA CGACCTCAGACTCACCATTGTTGTT
BjuWOX36 AATCACGGCTCCAGTGTCGAATG TCGGCTTCTTCTTCTTGCTCAACAT
BjuWOX48 AGTCAATCTTCAACAGCGGTATGGT GGTCTGGTCACAAGTATTGGTGGTT
BjuWOX49 GCATAGGAACACCGAGCAAGCAA CGACCTCAGACTCACCATTGTTGTT
BjuWOX51 GAGCCACCGCAACATCATCATCA TGACTGTGCCGTTGAATCTCTTCTT
GAPDH ACCACTAACTGCCTTGCTCC AGCTCTTCCACCTCTCCAGT
表选项
2 结果与分析 2.1 芥菜WOX基因全基因组鉴定

根据拟南芥15个WOX基因的蛋白质氨基酸序列，利用BLASTP和HMM比对搜索，在BRAD芥菜基因组数据库中鉴定出57个WOX候选基因。进一步利用Pfam、Batch CD-Search、HMMER结构域搜索检验WOX候选基因是否含有完整结构域，发现其中的6个WOX基因结构域不完整。例如芥菜WOX候选基因BjuA035902结构域片段仅含有32个氨基酸残基，BjuB031427结构域只含有17个氨基酸残基，推测这些WOX结构域不完整的候选基因可能是假基因。最后，在芥菜基因组中鉴定出51个WOX基因，并根据基因在染色体上的位置命名(表 2)。

表 2 BjuWOX基因家族成员信息 Table 2 The characteristics of BjuWOX gene family members
Gene name Gene ID Chromosome Chromosome position Strand Coding region (bp) Amino acids (aa) Molecular weight (Da) Theoretical isoelectric point
BjuWOX01 BjuA002999 A01 1 587 679–1 589 000 + 768 255 25 171.32 5.72
BjuWOX02 BjuA006339 A01 39 454 734–39 456 108 + 792 263 28 874.85 5.97
BjuWOX03 BjuA006340 A01 39 461 309–39 462 686 + 795 264 28 988.01 5.97
BjuWOX04 BjuA040937 A02 1 069 012–1 069 673 + 576 191 21 816.30 6.66
BjuWOX05 BjuA008004 A02 24 034 244–24 035 803 + 957 318 35 431.00 6.96
BjuWOX06 BjuA010056 A03 9 755 181–9 760 662 + 1 248 415 46 591.30 6.81
BjuWOX07 BjuA010055 A03 9 767 947–9 770 228 + 1 248 415 46 591.30 6.81
BjuWOX08 BjuA010821 A03 14 022 850–14 023 889 – 681 226 26 159.11 9.33
BjuWOX09 BjuA012587 A03 22 170 851–22 172 911 – 1 059 352 40 126.50 6.97
BjuWOX10 BjuA014157 A03 38 167 646–38 168 718 – 801 266 29 341.50 5.30
BjuWOX11 BjuA016365 A04 17 857 804–17 858 891 + 705 234 27 143.24 9.32
BjuWOX12 BjuA020101 A05 2 291 619–2 293 569 + 1 059 352 40 161.95 8.58
BjuWOX13 BjuA018465 A05 7 020 644–7 022 218 + 1 173 390 43 341.87 8.35
BjuWOX14 BjuA016427 A05 10 685 603–10 686 681 + 756 251 28 555.10 9.63
BjuWOX15 BjuA020524 A05 28 438 973–28 439 717 + 432 143 16 441.62 9.20
BjuWOX16 BjuA046118 A05 31 462 268–31 463 673 – 789 262 28 708.67 6.10
BjuWOX17 BjuA022314 A06 9 510 474–9 511 543 – 612 203 22 850.21 5.43
BjuWOX18 BjuA023426 A06 20 100 027–20 101 694 – 861 286 32 505.86 8.45
BjuWOX19 BjuA001259 A07 3 017 519–3 019 087 + 909 302 34 319.65 6.85
BjuWOX20 BjuA028186 A08 4 803 512–4 804 874 + 774 257 29 308.82 9.27
BjuWOX21 BjuA029662 A08 19 131 437–19 132 415 + 708 235 26 861.00 5.33
BjuWOX22 BjuA032954 A09 9 560 803–9 562 506 – 912 303 34 484.58 6.51
BjuWOX23 BjuA033941 A09 19 747 090–19 762 688 – 1 401 466 52 374.33 8.26
BjuWOX24 BjuA044155 A09 51 413 871–51 414 954 – 705 234 27 252.76 6.26
BjuWOX25 BjuA039918 A10 18 251 214–18 251 887 – 579 192 22 073.82 8.99
BjuWOX26 BjuB026308 B01 14 632 679–14 633 820 – 714 237 27 520.75 9.33
BjuWOX27 BjuB025530 B01 38 461 645–38 463 570 + 1 059 352 40 214.64 7.73
BjuWOX28 BjuB023627 B01 42 713 843–42 714 615 – 435 144 16 447.6 8.95
BjuWOX29 BjuB033714 B02 3 399 613–3 401 251 + 870 289 32 614.77 8.22
BjuWOX30 BjuB035507 B02 42 724 373–42 726 395 + 906 301 33 301.96 6.29
BjuWOX31 BjuB048545 B02 51 571 515–51 576 500 – 828 275 31 415.07 9.54
BjuWOX32 BjuB049008 B02 65 938 186–65 939 206 – 780 259 28 815.91 5.52
BjuWOX33 BjuB043771 B03 5 590 229–5 591 299 + 792 263 29 556.91 5.77
BjuWOX34 BjuB032260 B03 14 476 095–14 477 263 + 792 263 30 819.65 5.75
BjuWOX35 BjuB018002 B03 16 565 015–16 566 608 + 621 206 23 222.65 6.17
BjuWOX36 BjuB027615 B04 4 511 951–4 520 759 – 1 347 448 50 515.52 4.84
BjuWOX37 BjuB027817 B04 6 876 330–6 881 849 + 1 029 342 39 510.81 5.66
BjuWOX38 BjuB028686 B04 17 008 402–17 008 746 + 348 115 13 412.76 10.00
BjuWOX39 BjuB045340 B05 3 918 951–3 920 185 + 795 264 29 387.54 5.72
BjuWOX40 BjuB003204 B05 17 864 066–17 864 745 – 585 194 22 255.93 6.25
BjuWOX41 BjuB011697 B05 28 469 134–28 470 185 – 804 267 30 038.34 9.61
BjuWOX42 BjuB004417 B06 15 414 851–15 415 913 – 741 246 27 941.44 9.54
BjuWOX43 BjuB005294 B07 681 725–651 145 – 798 265 28 954.85 5.97
BjuWOX44 BjuB008508 B07 23 697 585–23 699 547 – 1 038 345 39 476.79 6.74
BjuWOX45 BjuB002871 B07 34 355 689–34 356 734 – 774 257 29 337.01 9.51
BjuWOX46 BjuB016205 B08 18 159 955–18 161 926 – 1 080 359 40 313.44 7.88
BjuWOX47 BjuB046140 B08 30 950 917–30 951 993 + 681 226 26 129.09 9.39
BjuWOX48 BjuO000931 Contig118_1274036_ 2398663_1051118_ 1124627 9 969–11 389 + 789 262 28 925.90 5.76
BjuWOX49 BjuO004268 Contig254_106612_ 1426954_1_97414 87 066–88 136 – 792 263 29 572.86 5.67
BjuWOX50 BjuO007820 Contig533 1 085 294–1 086 916 + 1 179 392 43 447.02 8.36
BjuWOX51 BjuO012621 Super_scaffold_41_ 1_1402938 67 707–69 429 – 933 310 35 086.44 6.79
+: Sense strand; ‒: Antisense strand.
表选项
2.2 系统发育进化树的构建和基因结构分析

为了构建芥菜WOX基因家族的进化树，分别利用拟南芥15个和芥菜51个WOX基因编码的蛋白质氨基酸序列进行系统发育进化分析。结果发现(图 1)，根据进化树拓扑结构可将WOX蛋白分为3个亚家族，分别为：WUS支/现代支、中间支和古老支。在3个亚家族中均包含拟南芥和芥菜的WOX基因，同时在进化树拓扑结构中发现，芥菜WOX基因在亚家族中分布不均匀，WUS支/现代支中包含29个WOX基因，中间支具有13个，而古老支只含有9个WOX基因。为了研究芥菜WOX基因结构的多样性和系统发生情况，我们仅对来自芥菜的51个WOX基因的蛋白质氨基酸序列构建系统发育进化树，结果也分为3个亚家族(图 2)。对这些蛋白质的保守基序分析发现，所有51个WOX蛋白都含有motif 1和motif 3，而motif 4和motif 6为古老支特有基序，motif 2为中间支特有基序。通过比较芥菜WOX基因结构，发现除BjuWOX38没有内含子外，其余WOX基因均含有1–7个内含子，同一亚家族的芥菜WOX基因具有相似的基因结构。

图 1 芥菜和拟南芥WOX基因家族的系统进化树 Fig. 1 Phylogenetic tree of WOX genes in Brassica juncea and Arabidopsis thaliana. 蓝色圆形代表芥菜WOX基因，红色三角形代表拟南芥WOX基因 The blue circles represent the mustard WOX genes, and the red triangles represent the Arabidopsis WOX genes.
图选项
图 2 芥菜WOX基因家族的系统进化和基因结构 Fig. 2 Phylogenetic relationships and gene structure of WOX genes in Brassica juncea. A：芥菜WOX基因系统发育进化树. B：芥菜WOX基因编码蛋白质保守结构域. C：芥菜WOX基因外显子和内含子结构 A: Phylogenetic tree of mustard WOX genes. B: Protein conservative domains of mustard WOX genes. C: Exon and intron structure of WOX genes in mustard.
图选项
2.3 芥菜WOX基因编码蛋白的理化性质、二级结构分析和亚细胞定位

蛋白质氨基酸序列一级结构理化性质分析显示(表 2)，芥菜51个WOX基因编码区长度在348–1 401 bp之间，编码长度为115–466个氨基酸残基的蛋白质，分子量为13.4–52.4 kDa，等电点范围为4.84–10.00。不同BjuWOX蛋白氨基酸数目和理化性质存在一定的差异，如BjuWOX23氨基酸残基数目最多为466个，BjuWOX38的氨基酸残基数目最少为115个。其中有22个WOX基因的氨基酸序列理论等电点在碱性范围内，其余29个WOX基因的氨基酸序列理论等电点都在酸性范围内。SOPMA预测蛋白质二级结构显示(表 3)，芥菜51个WOX基因的氨基酸序列均含有α-螺旋、随机卷曲、扩展链和β-转角，各WOX基因编码蛋白质二级结构中α-螺旋含量在12.58%–45.82%之间、随机卷曲含量在36.91%–68.88%之间、扩展链含量在5.22%–21.70%之间以及β-转角含量在2.33%–9.57%之间，表明51个WOX基因氨基酸序列二级结构主要以α-螺旋和随机卷曲为主。同时，亚细胞定位预测显示51个芥菜WOX基因均定位在细胞核中。

表 3 芥菜WOX基因编码蛋白的二级结构 Table 3 Secondary structure of the proteins encoded by mustard WOX genes
Gene name α-helix Extended strand β-turn Random coil Gene name α-helix Extended strand β-turn Random coil
BjuWOX01 34.12 8.63 3.92 53.33 BjuWOX27 25.00 12.50 3.69 58.81
BjuWOX02 17.49 15.59 7.22 59.70 BjuWOX28 33.33 15.97 4.17 46.53
BjuWOX03 17.05 16.29 7.20 59.47 BjuWOX29 17.99 11.42 4.84 65.74
BjuWOX04 30.89 12.04 3.66 53.40 BjuWOX30 25.58 15.61 7.97 50.83
BjuWOX05 12.58 21.70 5.03 60.69 BjuWOX31 45.82 11.64 5.09 37.45
BjuWOX06 22.89 18.31 5.30 53.49 BjuWOX32 34.75 9.65 5.41 50.19
BjuWOX07 22.89 18.31 5.30 53.49 BjuWOX33 30.42 9.51 5.32 54.75
BjuWOX08 30.09 7.08 3.10 59.73 BjuWOX34 30.80 18.25 4.94 46.01
BjuWOX09 25.85 11.08 3.12 59.94 BjuWOX35 37.38 6.80 4.85 50.97
BjuWOX10 33.83 8.65 4.89 52.63 BjuWOX36 29.91 13.62 3.79 52.68
BjuWOX11 27.35 16.24 6.41 50.00 BjuWOX37 31.87 17.84 7.31 42.98
BjuWOX12 25.28 11.93 3.41 59.38 BjuWOX38 24.35 5.22 9.57 60.87
BjuWOX13 18.72 16.15 6.67 58.46 BjuWOX39 37.88 7.20 4.92 50.00
BjuWOX14 39.84 8.37 3.59 48.21 BjuWOX40 27.32 19.59 4.12 48.97
BjuWOX15 39.16 11.89 4.90 44.06 BjuWOX41 20.22 13.48 5.62 60.67
BjuWOX16 14.12 13.74 6.49 65.65 BjuWOX42 31.30 7.32 4.47 56.91
BjuWOX17 37.44 7.39 4.43 50.74 BjuWOX43 14.72 15.09 6.79 63.40
BjuWOX18 17.48 11.19 2.45 68.88 BjuWOX44 27.25 9.57 3.48 59.71
BjuWOX19 22.52 7.28 3.97 66.23 BjuWOX45 35.02 8.17 2.33 54.47
BjuWOX20 27.24 7.00 4.28 61.48 BjuWOX46 14.21 15.60 3.90 66.30
BjuWOX21 35.32 9.36 4.68 50.64 BjuWOX47 28.76 11.95 3.10 56.19
BjuWOX22 21.12 7.26 3.96 67.66 BjuWOX48 16.41 12.60 5.73 65.27
BjuWOX23 40.99 15.02 7.08 36.91 BjuWOX49 32.32 9.89 4.18 53.61
BjuWOX24 36.75 14.10 5.98 43.16 BjuWOX50 19.90 18.37 7.14 54.59
BjuWOX25 30.73 13.54 4.17 51.56 BjuWOX51 18.39 11.61 3.55 66.45
BjuWOX26 27.00 17.72 5.91 49.37
表选项
2.4 芥菜WOX基因染色体定位和顺式作用元件分析

根据染色体定位结果(表 2，图 3)，芥菜的47个WOX基因不均匀地分布在18条染色体上，其中A05染色体上分布的WOX基因最多(5个)，而A04、A07、A10和B06染色体上分布的WOX基因最少(1个)，另外4个WOX基因(BjuWOX48–BjuWOX51)分别位于Contig118_ 1274036_2398663_1051118_1124627、Contig254_106612_1426954_1_97414、Contig533和Super_scaffold_41_1_1402938上。

图 3 芥菜WOX基因在染色体上的位置 Fig. 3 Chromosomal position of WOX genes in Brassica juncea. 最左侧标尺表示染色体长度；A01–A10、B01–B08分别表示芥菜的18条染色体名称 The leftmost scales represent the chromosome length; A01–A10 and B01–B08 represent the names of 18 chromosomes of mustard respectively.
图选项

利用PLANTCARE和NEWPLACE在线软件分析芥菜WOX基因启动子序列的顺式作用元件，结果共鉴定到了42种5 856个顺式作用元件，除了含有启动子基础作用元件CAAT-Box、GATA-Box、TATA-Box等之外，还含有多种与激素应答、组织特异性表达、生物和非生物胁迫诱导等相关的顺式作用元件(图 4)。其中，芥菜51个WOX基因都含有光照响应元件，暗示芥菜WOX基因表达可能受光调节。除BjuWOX51外，BjuWOX01–BjuWOX50均含有赤霉素响应元件；有28、19、39个WOX基因分别含有生长素、玉米素和脱落酸响应元件；此外有33、19个WOX基因分别含有茉莉酸和水杨酸响应元件；有45、29、20个WOX基因分别含有缺氧、干旱和低温响应元件；有8、6和5个WOX基因分别含有胚乳、分生组织和种子特异性响应元件。推测芥菜WOX基因参与多个信号通路调控芥菜的生长发育过程和对环境刺激的响应。

图 4 芥菜WOX基因家族启动子顺式作用元件分布 Fig. 4 Cis-acting element distribution in the promoters of the WOX genes in Brassica juncea. 芥菜WOX基因上游启动子2 000 bp区段含有的各种顺式作用元件，包括光反应元件，激素反应元件，干旱、低温、缺氧、伤害等反应元件，以及分生组织、种子、胚乳等特异性元件 The 2 000 bp promoter sequences of mustard WOX genes contain a variety of cis-acting elements, including photo responsive elements, hormone responsive elements, drought, low temperature, anaerobic, wound and other response elements, as well as specific elements of meristem, seed, and endosperm.
图选项
2.5 芥菜WOX基因在逆境下和不同组织中的表达分析

利用RNA-Seq数据分析了芥菜WOX基因在高温和干旱胁迫下的表达情况。结果显示(图 5)，共有12个WOX基因在高温和干旱处理后检测到表达，与未经高温和干旱处理相比，在干旱处理后，有2个基因(BjuWOX10和BjuWOX32)明显上调表达，另有3个基因(BjuWOX09、BjuWOX27和BjuWOX31)下调表达。在高温处理后，也有2个基因(BjuWOX11和BjuWOX23)明显上调表达，3个基因(BjuWOX09、BjuWOX32和BjuWOX33)下调表达。其余基因在干旱或高温胁迫处理后未检测到表达，推测这些基因的表达可能不受干旱和高温胁迫的影响。

图 5 BjuWOXs在干旱及高温胁迫下的表达 Fig. 5 Expression profiles of BjuWOXs under drought and high temperature stresses. BDS：干旱胁迫处理12 h. BDS：高温胁迫处理4 h BDS: Treatment for 12 h under drought stress; BHS: Treatment for 4 h under high temperature stress.
图选项

对18个BjuWOXs基因在芥菜叶片、花、花茎和角果中的实时荧光定量PCR分析发现(图 6)，除BjuWOX26外，其余WOX基因在幼嫩的角果中的表达水平明显高于叶片、花和花茎，其中BjuWOX25、BjuWOX33、BjuWOX49的相对表达量分别是内参基因的10、25、30倍，说明这3个基因在芥菜角果的发育过程中起着十分重要的作用，其余基因也发挥一定的作用。BjuWOX14、BjuWOX25、BjuWOX32、BjuWOX33、BjuWOX36、BjuWOX49在叶片、花和花茎也有较高水平的表达，说明这些基因对芥菜叶片、花和花茎的生长发育也具有一定的作用。BjuWOX01、BjuWOX04、BjuWOX08、BjuWOX09、BjuWOX10、BjuWOX17、BjuWOX19、BjuWOX22、BjuWOX26、BjuWOX27、BjuWOX48、BjuWOX51在叶片、花和花茎中有很低水平的表达，推测它们可能参与其他生理活动，这需要进一步的实验验证。

图 6 BjuWOXs在芥菜不同组织中的表达 Fig. 6 Expression profiles of BjuWOXs in different tissues of Brassica juncea. A和B分别表示在芥菜花薹、叶、花、角果中表达水平相对较低和相对较高的部分WOX基因. 不同小写字母表示差异达显著水平P < 0.05 A and B represent some WOX genes with relatively low expression level and relatively high expression level in mustard bolting stem, leaf, flower and siliques, respectively. Different lowercase letters showed significant difference at 0.05 level.
图选项
3 讨论与结论

本研究从芥菜基因组中成功鉴定出51个WOX基因，其中47个WOX基因不均匀分布于芥菜的18条染色体上(A01–A10、B01–B08)，另外4个未能定位到染色体上，相比于同为十字花科植物的拟南芥只有15个WOX基因，作为异源四倍体(AABB基因组)的芥菜，具有了更多的WOX基因，这可能是芥菜在进化过程中出现多次加倍事件和基因丢失导致的[30]。而甘蓝型油菜(异源四倍体，AACC基因组，A01–A10，C01–C09)具有58个WOX基因，其中49个WOX基因不均匀分布于19条染色体上，其余9个未能定位[13]。芥菜和油菜的基因组大小比较接近，进化过程也有一定的相似性(出现过多倍化事件)，但是由于其重复序列占比较大，基因组序列还存在不少缺失(gap)，因此芥菜基因组中可能还有一些WOX基因未能被鉴定出来，这需要进一步的研究。

系统发育分析表明，芥菜WUS支/现代支中有多个WOX基因分别与拟南芥的AtWOX1、AtWOX3、AtWOX4、AtWOX6、AtWOX7亲缘关系较近，如BjuWOX09、BjuWOX12、BjuWOX27、BjuWOX44与AtWOX1亲缘关系最近；BjuWOX08、BjuWOX11、BjuWOX26、BjuWOX47与AtWOX3亲缘关系最近。中间支中，BjuWOX02、BjuWOX03、BjuWOX16、BjuWOX43、BjuWOX48与AtWOX11亲缘关系最近；BjuWOX06、BjuWOX07、BjuWOX13、BjuWOX46、BjuWOX50与AtWOX9亲缘关系最近，等等，油菜WOX基因也具有类似情况[30]，进一步说明芥菜基因组的多倍化事件导致WOX基因数量大大增加。

表达模式分析发现，BjuWOX10、BjuWOX32在干旱处理后上调表达，而BjuWOX09、BjuWOX27、BjuWOX31下调表达，这几个基因的启动子区均含有干旱相关的DRE顺式作用元件。BjuWOX11、BjuWOX23在高温处理后上调表达，而BjuWOX09、BjuWOX32、BjuWOX33下调表达，这几个基因的启动子区均含有ABRE顺式作用元件，推测其对高温的响应可能涉及到ABA信号途径。BjuWOX14、BjuWOX25、BjuWOX32、BjuWOX33、BjuWOX36、BjuWOX49在发育的花、花茎和角果中有较高水平的表达，分析这几个基因的启动子发现它们均具有赤霉素或生长素或玉米素顺式作用元件，推测这几个基因可能参与了芥菜分生组织的维持。BjuWOX14与拟南芥AtWOX4亲缘关系很近，据报道，AtWOX4基因主要参与SAM与RAM维管束的发育与形成[31]；突变体研究发现TDIF-TDR-WOX4信号在拟南芥次生生长过程中的维管分生组织的维持具有重要角色[32]，据此推测BjuWOX14也可能具有类似的功能。BjuWOX32、BjuWOX33、BjuWOX49与AtWOX13同属于古老支，且亲缘关系较近，在拟南芥中，WOX13在主根和侧根以及花药中表达，具有防止提前分化的功能[19]，AtWOX13功能缺失突变体表现出胚座框变小的表型[33]，推测BjuWOX32、BjuWOX33、BjuWOX49在功能上可能也有着相似的作用，但还需要进一步的实验验证。

本研究在全基因组水平上鉴定了异源四倍体芥菜的WOX基因家族成员，并分析了其理化性质、基因结构、染色体定位、进化关系和表达特征等，为利用基因工程技术改良芥菜生长发育特性和逆境抗性提供了一定的依据和候选基因。

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