中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 阳文龙, 徐楚, 韩嘉琪, 张晓辉, 宋江萍, 贾会霞, 王海平
- YANG Wenlong, XU Chu, HAN Jiaqi, ZHANG Xiaohui, SONG Jiangping, JIA Huixia, WANG Haiping
- 芥菜WOX基因家族的全基因组鉴定与分析
- Genome-wide identification and characterization of the WOX gene family in Brassica juncea
- 生物工程学报, 2023, 39(2): 537-551
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(2): 537-551
- 10.13345/j.cjb.220774
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文章历史
- Received: September 26, 2022
- Accepted: November 1, 2022
- Published: November 25, 2022
2. 山西农业大学, 山西 太谷 030801
2. Shanxi Agricultural University, Taigu 030801, Shanxi, China
WUSCHEL相关-同源盒(WUSCHEL related-homeobox, WOX)蛋白家族是真核生物转录因子同源异型结构域(homeodomain, HD)蛋白homeobox (HOX)大家族中植物特有的1个亚支,在植物胚胎发生、干细胞维护和根的形成等关键发育过程中起着重要作用[1-2]。典型的HD包括60–66个氨基酸残基,组成helix1-loop-helix2-turn-helix3的空间结构,起到与特异DNA序列结合的作用[3]。系统发育分析发现,WOX家族可分为3支:WUS支/现代支、中间支和古老支[4-5]。Lian等和Ikeda等通过对50种植物中350个WOX基因的生物信息学分析发现,低等植物中的WOX成员仅来自古老支;现代支的WOX成员仅存在于高等植物中;中间支在维管植物中开始出现,暗示中间支和现代支可能是经过古老支成员复制和分化形成的[6-7]。自1996年Laux等[2]克隆得到了WUS基因以来,很多物种如拟南芥、水稻、小麦、玉米、油菜、棉花、大豆、菜豆、番茄、黄瓜、大蒜等都已克隆到WOX家族基因[8-18]。拟南芥中共有15个WOX基因,其中WUS和WOX1–WOX7属于WUS支/现代支,中间支包括WOX8、WOX9、WOX11和WOX12,古老支包括WOX10、WOX13和WOX14[5]。功能分析发现,WUS和WOX5分别在茎尖分生组织(shoot apical meristem, SAM)和根尖分生组织(root apical meristem, RAM)的中心细胞中表达,具有维持干细胞分裂的功能[3, 19-20]。WOX2和WOX8、WOX9均在合子中表达,与胚胎早期顶—基部的形成相关[21]。WOX3主要在分生组织的外围表达,对营养时期和生殖时期干细胞的表达调控有重要作用[22]。WOX4参与SAM和RAM中维管束的形成与发育[23]。WOX6主要在胚珠中表达并调节胚珠的发育,在珠被和卵细胞的形成过程中防止细胞的提前分化[24],WOX6也参与冷胁迫的应答[25]。WOX13、WOX14在根部及花药表达,并且受到严格调控,具有防止提前分化的功能[26]。其他植物中的研究也表明,WOX家族基因在植物生长发育过程中发挥着重要作用,且具有时空表达特异性,此外还参与激素、生物和非生物逆境胁迫的响应[27-28]。
芥菜(Brassica juncea)是我国重要的加工蔬菜作物,常年种植面积达100万hm2,在人们生活和国民经济中占有重要地位。芥菜按食用器官可分为叶用、茎用、根用、薹用芥菜和籽芥,不同类型的芥菜生长发育特性存在较大差异,因此研究对其生长发育起重要调控作用的WOX基因是至关重要的。但由于芥菜是异源四倍体(AABB),基因组比较复杂,给芥菜WOX基因的研究带来了挑战,目前还未见芥菜WOX基因相关的研究报道。鉴于此,本研究利用芥菜基因组信息通过生物信息学方法对芥菜WOX基因家族的组成在全基因组水平进行鉴定,并进一步对基因结构、染色体分布、启动子顺式作用元件、表达谱进行分析,以期为后续芥菜WOX基因的功能研究提供参考。
1 材料与方法 1.1 芥菜WOX基因的全基因组鉴定从TAIR网站(https://www.arabidopsis.org/)下载拟南芥蛋白质氨基酸序列数据,从BRAD网站(http://brassicadb.cn/#/)下载芥菜蛋白质氨基酸序列数据。用TBTools软件(https://github.com/CJ-Chen/TBtools/releases)提取已报道的拟南芥15个WOX蛋白质氨基酸序列。将拟南芥的WOX蛋白质氨基酸序列作为query序列BLASTP比对(e‒ value < 1e‒5)芥菜蛋白数据,获得这些序列的同源序列并删除其中的重复序列。同时,在Pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)下载WOX保守结构域(PF00046)作为模板序列,利用HMM3.0比对得到含有保守结构域的蛋白质氨基酸序列。将上述2种比对方法获得的候选蛋白质氨基酸序列合并,去除重复序列。进一步利用Pfam序列搜索(http://pfam.xfam.org/)、Batch CD-Search分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和HMMER序列分析(https://www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/hmmscan)验证候选蛋白是否含有WOX保守结构域,删除不完整或者缺失WOX结构域的候选基因,最终获得芥菜WOX基因。
1.2 系统发育进化树的构建和基因结构分析利用Clustal_W工具将拟南芥和芥菜的WOX蛋白质氨基酸序列进行多重比对,将比对结果放入MEGA 7.0软件,在p-distance模型、bootstrap参数1 000和成对删除选项下采用邻接法(neighbor-joining method, NJ)构建系统发育进化树。从BRAD数据库(http://brassicadb.cn/#/)下载的芥菜基因组数据提取芥菜WOX基因的DNA query和CDS query,利用TBTools进行基因结构展示。
1.3 芥菜WOX基因编码蛋白的理化性质分析、二级结构分析和亚细胞定位利用Expasy (https://web.expasy.org/protparam/)在线软件预测芥菜WOX蛋白的氨基酸长度、分子量和等电点。利用SOPMA在线软件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)预测分析α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲。利用cello软件[19]对芥菜WOX基因或蛋白进行亚细胞定位预测。
1.4 芥菜WOX基因染色体定位和顺式作用元件分析利用TBTools软件分析获得芥菜WOX基因在染色体上的物理位置,并绘制WOX基因在染色体上的分布图。用TBTools软件截取芥菜各WOX基因上游2 kb序列,并将其提交至PlantCARE (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和NEWPLACE在线软件(https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?sid=&lang=en&pj=640&action=page&page=newplace)进行启动子顺式作用元件的预测并手动整理。
1.5 芥菜WOX基因的表达分析从芥菜转录组数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE64242)下载芥菜干旱和高温胁迫的转录组数据FPKM (fragments per kilobase of transcript per million mapped reads)值[29],标准化后作为表达分析数据。用TBtools软件构建基因表达热图。
分别在叶芥A960 (安徽叶芥)的盛花期取成长叶、花和花茎,盛果期取灌浆角果,立即液氮速冻,存放于–80 ℃冰箱。使用Trizol试剂(天根生化科技有限公司)提取芥菜叶、花、花茎和角果的总RNA,使用FASTKING一步法除基因组cDNA第一链合成预混试剂(KR118) (天根生化科技有限公司)按说明书进行cDNA合成。以cDNA的5倍稀释液为模板进行扩增,于荧光定量PCR仪(ABI QuantStudio 6 Flex)中进行实时荧光定量PCR (real-time fluorescence quantitative PCR, qRT-PCR)检测芥菜BjuWOX基因的表达情况,所用引物见表 1,每个样品进行3次生物学重复实验。以芥菜的GADPH基因为内参基因,使用2‒ΔΔCT方法计算BjuWOX基因的相对表达量,将数据导入SPSS 22.0软件分析差异显著性,利用Excel2007和Origin8.5制作图表。
Gene name | Forward primer (5′→3′) | Reverse primer (5′→3′) |
BjuWOX01 | GTGGTGGTGTTGGTGGTTCTTCTAA | TCAGCCTGACATGCCATACTCCT |
BjuWOX04 | GGACTAAGTGTGGACGGTGGAATC | ACACGTTCTTGCTCTCGATCTTACC |
BjuWOX08 | GCAACTTCACCAACAACAACTCCAA | AGCAGCAAGCGAAAGACGAATGA |
BjuWOX09 | GCCTGTCTCAATAGCGATGGTAGC | CTCTGTGTTCCTTGCTCCTCTTGTC |
BjuWOX10 | GGCTCAGGCTCAGGAGGAATGTA | TTGATCTTCTGCTTGCTCGGTGTC |
BjuWOX14 | GGTGGAATGCGGACTCCTAACG | GGTTGTTCCTCTTCTGCTTCTGTCT |
BjuWOX17 | GCTCGCTCTCCTCCACAACTCT | TGTCTCCGTTATCTGTCCGTGTTCA |
BjuWOX19 | AAGAAGAGATTCAACGGCACAGTCA | ACGCATTAAGAGCACCACATTCAGT |
BjuWOX22 | ACTACAACAACGGAGTTCGGTCAC | GGTGCTGAAGAAGAGGATGATGGTT |
BjuWOX25 | ACCGAGCACCGATCAGATTCAGA | TGCAACGTCTCTATCACCTTCTCCT |
BjuWOX26 | ACTCGCTAAGCAACTTCACCAACAA | ACAGATGGGAGAAGGCTGAGAACA |
BjuWOX27 | GCCTGTCTCAATAGCGATGGTAGC | TCCTGTGTTCGTTGCTGCTCTTG |
BjuWOX32 | GACACCGAGCAAGCAGAAGATCAA | CTCCACCTCAGACTCACCATTGTTG |
BjuWOX33 | GCATAGGAACACCGAGCAAGCAA | CGACCTCAGACTCACCATTGTTGTT |
BjuWOX36 | AATCACGGCTCCAGTGTCGAATG | TCGGCTTCTTCTTCTTGCTCAACAT |
BjuWOX48 | AGTCAATCTTCAACAGCGGTATGGT | GGTCTGGTCACAAGTATTGGTGGTT |
BjuWOX49 | GCATAGGAACACCGAGCAAGCAA | CGACCTCAGACTCACCATTGTTGTT |
BjuWOX51 | GAGCCACCGCAACATCATCATCA | TGACTGTGCCGTTGAATCTCTTCTT |
GAPDH | ACCACTAACTGCCTTGCTCC | AGCTCTTCCACCTCTCCAGT |
根据拟南芥15个WOX基因的蛋白质氨基酸序列,利用BLASTP和HMM比对搜索,在BRAD芥菜基因组数据库中鉴定出57个WOX候选基因。进一步利用Pfam、Batch CD-Search、HMMER结构域搜索检验WOX候选基因是否含有完整结构域,发现其中的6个WOX基因结构域不完整。例如芥菜WOX候选基因BjuA035902结构域片段仅含有32个氨基酸残基,BjuB031427结构域只含有17个氨基酸残基,推测这些WOX结构域不完整的候选基因可能是假基因。最后,在芥菜基因组中鉴定出51个WOX基因,并根据基因在染色体上的位置命名(表 2)。
Gene name | Gene ID | Chromosome | Chromosome position | Strand | Coding region (bp) | Amino acids (aa) | Molecular weight (Da) | Theoretical isoelectric point |
BjuWOX01 | BjuA002999 | A01 | 1 587 679–1 589 000 | + | 768 | 255 | 25 171.32 | 5.72 |
BjuWOX02 | BjuA006339 | A01 | 39 454 734–39 456 108 | + | 792 | 263 | 28 874.85 | 5.97 |
BjuWOX03 | BjuA006340 | A01 | 39 461 309–39 462 686 | + | 795 | 264 | 28 988.01 | 5.97 |
BjuWOX04 | BjuA040937 | A02 | 1 069 012–1 069 673 | + | 576 | 191 | 21 816.30 | 6.66 |
BjuWOX05 | BjuA008004 | A02 | 24 034 244–24 035 803 | + | 957 | 318 | 35 431.00 | 6.96 |
BjuWOX06 | BjuA010056 | A03 | 9 755 181–9 760 662 | + | 1 248 | 415 | 46 591.30 | 6.81 |
BjuWOX07 | BjuA010055 | A03 | 9 767 947–9 770 228 | + | 1 248 | 415 | 46 591.30 | 6.81 |
BjuWOX08 | BjuA010821 | A03 | 14 022 850–14 023 889 | – | 681 | 226 | 26 159.11 | 9.33 |
BjuWOX09 | BjuA012587 | A03 | 22 170 851–22 172 911 | – | 1 059 | 352 | 40 126.50 | 6.97 |
BjuWOX10 | BjuA014157 | A03 | 38 167 646–38 168 718 | – | 801 | 266 | 29 341.50 | 5.30 |
BjuWOX11 | BjuA016365 | A04 | 17 857 804–17 858 891 | + | 705 | 234 | 27 143.24 | 9.32 |
BjuWOX12 | BjuA020101 | A05 | 2 291 619–2 293 569 | + | 1 059 | 352 | 40 161.95 | 8.58 |
BjuWOX13 | BjuA018465 | A05 | 7 020 644–7 022 218 | + | 1 173 | 390 | 43 341.87 | 8.35 |
BjuWOX14 | BjuA016427 | A05 | 10 685 603–10 686 681 | + | 756 | 251 | 28 555.10 | 9.63 |
BjuWOX15 | BjuA020524 | A05 | 28 438 973–28 439 717 | + | 432 | 143 | 16 441.62 | 9.20 |
BjuWOX16 | BjuA046118 | A05 | 31 462 268–31 463 673 | – | 789 | 262 | 28 708.67 | 6.10 |
BjuWOX17 | BjuA022314 | A06 | 9 510 474–9 511 543 | – | 612 | 203 | 22 850.21 | 5.43 |
BjuWOX18 | BjuA023426 | A06 | 20 100 027–20 101 694 | – | 861 | 286 | 32 505.86 | 8.45 |
BjuWOX19 | BjuA001259 | A07 | 3 017 519–3 019 087 | + | 909 | 302 | 34 319.65 | 6.85 |
BjuWOX20 | BjuA028186 | A08 | 4 803 512–4 804 874 | + | 774 | 257 | 29 308.82 | 9.27 |
BjuWOX21 | BjuA029662 | A08 | 19 131 437–19 132 415 | + | 708 | 235 | 26 861.00 | 5.33 |
BjuWOX22 | BjuA032954 | A09 | 9 560 803–9 562 506 | – | 912 | 303 | 34 484.58 | 6.51 |
BjuWOX23 | BjuA033941 | A09 | 19 747 090–19 762 688 | – | 1 401 | 466 | 52 374.33 | 8.26 |
BjuWOX24 | BjuA044155 | A09 | 51 413 871–51 414 954 | – | 705 | 234 | 27 252.76 | 6.26 |
BjuWOX25 | BjuA039918 | A10 | 18 251 214–18 251 887 | – | 579 | 192 | 22 073.82 | 8.99 |
BjuWOX26 | BjuB026308 | B01 | 14 632 679–14 633 820 | – | 714 | 237 | 27 520.75 | 9.33 |
BjuWOX27 | BjuB025530 | B01 | 38 461 645–38 463 570 | + | 1 059 | 352 | 40 214.64 | 7.73 |
BjuWOX28 | BjuB023627 | B01 | 42 713 843–42 714 615 | – | 435 | 144 | 16 447.6 | 8.95 |
BjuWOX29 | BjuB033714 | B02 | 3 399 613–3 401 251 | + | 870 | 289 | 32 614.77 | 8.22 |
BjuWOX30 | BjuB035507 | B02 | 42 724 373–42 726 395 | + | 906 | 301 | 33 301.96 | 6.29 |
BjuWOX31 | BjuB048545 | B02 | 51 571 515–51 576 500 | – | 828 | 275 | 31 415.07 | 9.54 |
BjuWOX32 | BjuB049008 | B02 | 65 938 186–65 939 206 | – | 780 | 259 | 28 815.91 | 5.52 |
BjuWOX33 | BjuB043771 | B03 | 5 590 229–5 591 299 | + | 792 | 263 | 29 556.91 | 5.77 |
BjuWOX34 | BjuB032260 | B03 | 14 476 095–14 477 263 | + | 792 | 263 | 30 819.65 | 5.75 |
BjuWOX35 | BjuB018002 | B03 | 16 565 015–16 566 608 | + | 621 | 206 | 23 222.65 | 6.17 |
BjuWOX36 | BjuB027615 | B04 | 4 511 951–4 520 759 | – | 1 347 | 448 | 50 515.52 | 4.84 |
BjuWOX37 | BjuB027817 | B04 | 6 876 330–6 881 849 | + | 1 029 | 342 | 39 510.81 | 5.66 |
BjuWOX38 | BjuB028686 | B04 | 17 008 402–17 008 746 | + | 348 | 115 | 13 412.76 | 10.00 |
BjuWOX39 | BjuB045340 | B05 | 3 918 951–3 920 185 | + | 795 | 264 | 29 387.54 | 5.72 |
BjuWOX40 | BjuB003204 | B05 | 17 864 066–17 864 745 | – | 585 | 194 | 22 255.93 | 6.25 |
BjuWOX41 | BjuB011697 | B05 | 28 469 134–28 470 185 | – | 804 | 267 | 30 038.34 | 9.61 |
BjuWOX42 | BjuB004417 | B06 | 15 414 851–15 415 913 | – | 741 | 246 | 27 941.44 | 9.54 |
BjuWOX43 | BjuB005294 | B07 | 681 725–651 145 | – | 798 | 265 | 28 954.85 | 5.97 |
BjuWOX44 | BjuB008508 | B07 | 23 697 585–23 699 547 | – | 1 038 | 345 | 39 476.79 | 6.74 |
BjuWOX45 | BjuB002871 | B07 | 34 355 689–34 356 734 | – | 774 | 257 | 29 337.01 | 9.51 |
BjuWOX46 | BjuB016205 | B08 | 18 159 955–18 161 926 | – | 1 080 | 359 | 40 313.44 | 7.88 |
BjuWOX47 | BjuB046140 | B08 | 30 950 917–30 951 993 | + | 681 | 226 | 26 129.09 | 9.39 |
BjuWOX48 | BjuO000931 | Contig118_1274036_ 2398663_1051118_ 1124627 | 9 969–11 389 | + | 789 | 262 | 28 925.90 | 5.76 |
BjuWOX49 | BjuO004268 | Contig254_106612_ 1426954_1_97414 | 87 066–88 136 | – | 792 | 263 | 29 572.86 | 5.67 |
BjuWOX50 | BjuO007820 | Contig533 | 1 085 294–1 086 916 | + | 1 179 | 392 | 43 447.02 | 8.36 |
BjuWOX51 | BjuO012621 | Super_scaffold_41_ 1_1402938 | 67 707–69 429 | – | 933 | 310 | 35 086.44 | 6.79 |
+: Sense strand; ‒: Antisense strand. |
为了构建芥菜WOX基因家族的进化树,分别利用拟南芥15个和芥菜51个WOX基因编码的蛋白质氨基酸序列进行系统发育进化分析。结果发现(图 1),根据进化树拓扑结构可将WOX蛋白分为3个亚家族,分别为:WUS支/现代支、中间支和古老支。在3个亚家族中均包含拟南芥和芥菜的WOX基因,同时在进化树拓扑结构中发现,芥菜WOX基因在亚家族中分布不均匀,WUS支/现代支中包含29个WOX基因,中间支具有13个,而古老支只含有9个WOX基因。为了研究芥菜WOX基因结构的多样性和系统发生情况,我们仅对来自芥菜的51个WOX基因的蛋白质氨基酸序列构建系统发育进化树,结果也分为3个亚家族(图 2)。对这些蛋白质的保守基序分析发现,所有51个WOX蛋白都含有motif 1和motif 3,而motif 4和motif 6为古老支特有基序,motif 2为中间支特有基序。通过比较芥菜WOX基因结构,发现除BjuWOX38没有内含子外,其余WOX基因均含有1–7个内含子,同一亚家族的芥菜WOX基因具有相似的基因结构。
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图 1 芥菜和拟南芥WOX基因家族的系统进化树 Fig. 1 Phylogenetic tree of WOX genes in Brassica juncea and Arabidopsis thaliana. 蓝色圆形代表芥菜WOX基因,红色三角形代表拟南芥WOX基因 The blue circles represent the mustard WOX genes, and the red triangles represent the Arabidopsis WOX genes. |
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图 2 芥菜WOX基因家族的系统进化和基因结构 Fig. 2 Phylogenetic relationships and gene structure of WOX genes in Brassica juncea. A:芥菜WOX基因系统发育进化树. B:芥菜WOX基因编码蛋白质保守结构域. C:芥菜WOX基因外显子和内含子结构 A: Phylogenetic tree of mustard WOX genes. B: Protein conservative domains of mustard WOX genes. C: Exon and intron structure of WOX genes in mustard. |
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蛋白质氨基酸序列一级结构理化性质分析显示(表 2),芥菜51个WOX基因编码区长度在348–1 401 bp之间,编码长度为115–466个氨基酸残基的蛋白质,分子量为13.4–52.4 kDa,等电点范围为4.84–10.00。不同BjuWOX蛋白氨基酸数目和理化性质存在一定的差异,如BjuWOX23氨基酸残基数目最多为466个,BjuWOX38的氨基酸残基数目最少为115个。其中有22个WOX基因的氨基酸序列理论等电点在碱性范围内,其余29个WOX基因的氨基酸序列理论等电点都在酸性范围内。SOPMA预测蛋白质二级结构显示(表 3),芥菜51个WOX基因的氨基酸序列均含有α-螺旋、随机卷曲、扩展链和β-转角,各WOX基因编码蛋白质二级结构中α-螺旋含量在12.58%–45.82%之间、随机卷曲含量在36.91%–68.88%之间、扩展链含量在5.22%–21.70%之间以及β-转角含量在2.33%–9.57%之间,表明51个WOX基因氨基酸序列二级结构主要以α-螺旋和随机卷曲为主。同时,亚细胞定位预测显示51个芥菜WOX基因均定位在细胞核中。
Gene name | α-helix | Extended strand | β-turn | Random coil | Gene name | α-helix | Extended strand | β-turn | Random coil | |
BjuWOX01 | 34.12 | 8.63 | 3.92 | 53.33 | BjuWOX27 | 25.00 | 12.50 | 3.69 | 58.81 | |
BjuWOX02 | 17.49 | 15.59 | 7.22 | 59.70 | BjuWOX28 | 33.33 | 15.97 | 4.17 | 46.53 | |
BjuWOX03 | 17.05 | 16.29 | 7.20 | 59.47 | BjuWOX29 | 17.99 | 11.42 | 4.84 | 65.74 | |
BjuWOX04 | 30.89 | 12.04 | 3.66 | 53.40 | BjuWOX30 | 25.58 | 15.61 | 7.97 | 50.83 | |
BjuWOX05 | 12.58 | 21.70 | 5.03 | 60.69 | BjuWOX31 | 45.82 | 11.64 | 5.09 | 37.45 | |
BjuWOX06 | 22.89 | 18.31 | 5.30 | 53.49 | BjuWOX32 | 34.75 | 9.65 | 5.41 | 50.19 | |
BjuWOX07 | 22.89 | 18.31 | 5.30 | 53.49 | BjuWOX33 | 30.42 | 9.51 | 5.32 | 54.75 | |
BjuWOX08 | 30.09 | 7.08 | 3.10 | 59.73 | BjuWOX34 | 30.80 | 18.25 | 4.94 | 46.01 | |
BjuWOX09 | 25.85 | 11.08 | 3.12 | 59.94 | BjuWOX35 | 37.38 | 6.80 | 4.85 | 50.97 | |
BjuWOX10 | 33.83 | 8.65 | 4.89 | 52.63 | BjuWOX36 | 29.91 | 13.62 | 3.79 | 52.68 | |
BjuWOX11 | 27.35 | 16.24 | 6.41 | 50.00 | BjuWOX37 | 31.87 | 17.84 | 7.31 | 42.98 | |
BjuWOX12 | 25.28 | 11.93 | 3.41 | 59.38 | BjuWOX38 | 24.35 | 5.22 | 9.57 | 60.87 | |
BjuWOX13 | 18.72 | 16.15 | 6.67 | 58.46 | BjuWOX39 | 37.88 | 7.20 | 4.92 | 50.00 | |
BjuWOX14 | 39.84 | 8.37 | 3.59 | 48.21 | BjuWOX40 | 27.32 | 19.59 | 4.12 | 48.97 | |
BjuWOX15 | 39.16 | 11.89 | 4.90 | 44.06 | BjuWOX41 | 20.22 | 13.48 | 5.62 | 60.67 | |
BjuWOX16 | 14.12 | 13.74 | 6.49 | 65.65 | BjuWOX42 | 31.30 | 7.32 | 4.47 | 56.91 | |
BjuWOX17 | 37.44 | 7.39 | 4.43 | 50.74 | BjuWOX43 | 14.72 | 15.09 | 6.79 | 63.40 | |
BjuWOX18 | 17.48 | 11.19 | 2.45 | 68.88 | BjuWOX44 | 27.25 | 9.57 | 3.48 | 59.71 | |
BjuWOX19 | 22.52 | 7.28 | 3.97 | 66.23 | BjuWOX45 | 35.02 | 8.17 | 2.33 | 54.47 | |
BjuWOX20 | 27.24 | 7.00 | 4.28 | 61.48 | BjuWOX46 | 14.21 | 15.60 | 3.90 | 66.30 | |
BjuWOX21 | 35.32 | 9.36 | 4.68 | 50.64 | BjuWOX47 | 28.76 | 11.95 | 3.10 | 56.19 | |
BjuWOX22 | 21.12 | 7.26 | 3.96 | 67.66 | BjuWOX48 | 16.41 | 12.60 | 5.73 | 65.27 | |
BjuWOX23 | 40.99 | 15.02 | 7.08 | 36.91 | BjuWOX49 | 32.32 | 9.89 | 4.18 | 53.61 | |
BjuWOX24 | 36.75 | 14.10 | 5.98 | 43.16 | BjuWOX50 | 19.90 | 18.37 | 7.14 | 54.59 | |
BjuWOX25 | 30.73 | 13.54 | 4.17 | 51.56 | BjuWOX51 | 18.39 | 11.61 | 3.55 | 66.45 | |
BjuWOX26 | 27.00 | 17.72 | 5.91 | 49.37 |
根据染色体定位结果(表 2,图 3),芥菜的47个WOX基因不均匀地分布在18条染色体上,其中A05染色体上分布的WOX基因最多(5个),而A04、A07、A10和B06染色体上分布的WOX基因最少(1个),另外4个WOX基因(BjuWOX48–BjuWOX51)分别位于Contig118_ 1274036_2398663_1051118_1124627、Contig254_106612_1426954_1_97414、Contig533和Super_scaffold_41_1_1402938上。
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图 3 芥菜WOX基因在染色体上的位置 Fig. 3 Chromosomal position of WOX genes in Brassica juncea. 最左侧标尺表示染色体长度;A01–A10、B01–B08分别表示芥菜的18条染色体名称 The leftmost scales represent the chromosome length; A01–A10 and B01–B08 represent the names of 18 chromosomes of mustard respectively. |
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利用PLANTCARE和NEWPLACE在线软件分析芥菜WOX基因启动子序列的顺式作用元件,结果共鉴定到了42种5 856个顺式作用元件,除了含有启动子基础作用元件CAAT-Box、GATA-Box、TATA-Box等之外,还含有多种与激素应答、组织特异性表达、生物和非生物胁迫诱导等相关的顺式作用元件(图 4)。其中,芥菜51个WOX基因都含有光照响应元件,暗示芥菜WOX基因表达可能受光调节。除BjuWOX51外,BjuWOX01–BjuWOX50均含有赤霉素响应元件;有28、19、39个WOX基因分别含有生长素、玉米素和脱落酸响应元件;此外有33、19个WOX基因分别含有茉莉酸和水杨酸响应元件;有45、29、20个WOX基因分别含有缺氧、干旱和低温响应元件;有8、6和5个WOX基因分别含有胚乳、分生组织和种子特异性响应元件。推测芥菜WOX基因参与多个信号通路调控芥菜的生长发育过程和对环境刺激的响应。
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图 4 芥菜WOX基因家族启动子顺式作用元件分布 Fig. 4 Cis-acting element distribution in the promoters of the WOX genes in Brassica juncea. 芥菜WOX基因上游启动子2 000 bp区段含有的各种顺式作用元件,包括光反应元件,激素反应元件,干旱、低温、缺氧、伤害等反应元件,以及分生组织、种子、胚乳等特异性元件 The 2 000 bp promoter sequences of mustard WOX genes contain a variety of cis-acting elements, including photo responsive elements, hormone responsive elements, drought, low temperature, anaerobic, wound and other response elements, as well as specific elements of meristem, seed, and endosperm. |
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利用RNA-Seq数据分析了芥菜WOX基因在高温和干旱胁迫下的表达情况。结果显示(图 5),共有12个WOX基因在高温和干旱处理后检测到表达,与未经高温和干旱处理相比,在干旱处理后,有2个基因(BjuWOX10和BjuWOX32)明显上调表达,另有3个基因(BjuWOX09、BjuWOX27和BjuWOX31)下调表达。在高温处理后,也有2个基因(BjuWOX11和BjuWOX23)明显上调表达,3个基因(BjuWOX09、BjuWOX32和BjuWOX33)下调表达。其余基因在干旱或高温胁迫处理后未检测到表达,推测这些基因的表达可能不受干旱和高温胁迫的影响。
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图 5 BjuWOXs在干旱及高温胁迫下的表达 Fig. 5 Expression profiles of BjuWOXs under drought and high temperature stresses. BDS:干旱胁迫处理12 h. BDS:高温胁迫处理4 h BDS: Treatment for 12 h under drought stress; BHS: Treatment for 4 h under high temperature stress. |
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对18个BjuWOXs基因在芥菜叶片、花、花茎和角果中的实时荧光定量PCR分析发现(图 6),除BjuWOX26外,其余WOX基因在幼嫩的角果中的表达水平明显高于叶片、花和花茎,其中BjuWOX25、BjuWOX33、BjuWOX49的相对表达量分别是内参基因的10、25、30倍,说明这3个基因在芥菜角果的发育过程中起着十分重要的作用,其余基因也发挥一定的作用。BjuWOX14、BjuWOX25、BjuWOX32、BjuWOX33、BjuWOX36、BjuWOX49在叶片、花和花茎也有较高水平的表达,说明这些基因对芥菜叶片、花和花茎的生长发育也具有一定的作用。BjuWOX01、BjuWOX04、BjuWOX08、BjuWOX09、BjuWOX10、BjuWOX17、BjuWOX19、BjuWOX22、BjuWOX26、BjuWOX27、BjuWOX48、BjuWOX51在叶片、花和花茎中有很低水平的表达,推测它们可能参与其他生理活动,这需要进一步的实验验证。
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图 6 BjuWOXs在芥菜不同组织中的表达 Fig. 6 Expression profiles of BjuWOXs in different tissues of Brassica juncea. A和B分别表示在芥菜花薹、叶、花、角果中表达水平相对较低和相对较高的部分WOX基因. 不同小写字母表示差异达显著水平P < 0.05 A and B represent some WOX genes with relatively low expression level and relatively high expression level in mustard bolting stem, leaf, flower and siliques, respectively. Different lowercase letters showed significant difference at 0.05 level. |
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本研究从芥菜基因组中成功鉴定出51个WOX基因,其中47个WOX基因不均匀分布于芥菜的18条染色体上(A01–A10、B01–B08),另外4个未能定位到染色体上,相比于同为十字花科植物的拟南芥只有15个WOX基因,作为异源四倍体(AABB基因组)的芥菜,具有了更多的WOX基因,这可能是芥菜在进化过程中出现多次加倍事件和基因丢失导致的[30]。而甘蓝型油菜(异源四倍体,AACC基因组,A01–A10,C01–C09)具有58个WOX基因,其中49个WOX基因不均匀分布于19条染色体上,其余9个未能定位[13]。芥菜和油菜的基因组大小比较接近,进化过程也有一定的相似性(出现过多倍化事件),但是由于其重复序列占比较大,基因组序列还存在不少缺失(gap),因此芥菜基因组中可能还有一些WOX基因未能被鉴定出来,这需要进一步的研究。
系统发育分析表明,芥菜WUS支/现代支中有多个WOX基因分别与拟南芥的AtWOX1、AtWOX3、AtWOX4、AtWOX6、AtWOX7亲缘关系较近,如BjuWOX09、BjuWOX12、BjuWOX27、BjuWOX44与AtWOX1亲缘关系最近;BjuWOX08、BjuWOX11、BjuWOX26、BjuWOX47与AtWOX3亲缘关系最近。中间支中,BjuWOX02、BjuWOX03、BjuWOX16、BjuWOX43、BjuWOX48与AtWOX11亲缘关系最近;BjuWOX06、BjuWOX07、BjuWOX13、BjuWOX46、BjuWOX50与AtWOX9亲缘关系最近,等等,油菜WOX基因也具有类似情况[30],进一步说明芥菜基因组的多倍化事件导致WOX基因数量大大增加。
表达模式分析发现,BjuWOX10、BjuWOX32在干旱处理后上调表达,而BjuWOX09、BjuWOX27、BjuWOX31下调表达,这几个基因的启动子区均含有干旱相关的DRE顺式作用元件。BjuWOX11、BjuWOX23在高温处理后上调表达,而BjuWOX09、BjuWOX32、BjuWOX33下调表达,这几个基因的启动子区均含有ABRE顺式作用元件,推测其对高温的响应可能涉及到ABA信号途径。BjuWOX14、BjuWOX25、BjuWOX32、BjuWOX33、BjuWOX36、BjuWOX49在发育的花、花茎和角果中有较高水平的表达,分析这几个基因的启动子发现它们均具有赤霉素或生长素或玉米素顺式作用元件,推测这几个基因可能参与了芥菜分生组织的维持。BjuWOX14与拟南芥AtWOX4亲缘关系很近,据报道,AtWOX4基因主要参与SAM与RAM维管束的发育与形成[31];突变体研究发现TDIF-TDR-WOX4信号在拟南芥次生生长过程中的维管分生组织的维持具有重要角色[32],据此推测BjuWOX14也可能具有类似的功能。BjuWOX32、BjuWOX33、BjuWOX49与AtWOX13同属于古老支,且亲缘关系较近,在拟南芥中,WOX13在主根和侧根以及花药中表达,具有防止提前分化的功能[19],AtWOX13功能缺失突变体表现出胚座框变小的表型[33],推测BjuWOX32、BjuWOX33、BjuWOX49在功能上可能也有着相似的作用,但还需要进一步的实验验证。
本研究在全基因组水平上鉴定了异源四倍体芥菜的WOX基因家族成员,并分析了其理化性质、基因结构、染色体定位、进化关系和表达特征等,为利用基因工程技术改良芥菜生长发育特性和逆境抗性提供了一定的依据和候选基因。
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