生物工程学报  2023, Vol. 39 Issue (2): 653-669 |
表1(Table 1)
引用本文
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杜鹃花(Rhododendron simsii Planch.)是一种常绿落叶灌木，具有很高的观赏价值和巨大的药用价值。在许多观赏植物中，杜鹃花花色是最重要的花卉特征[1-2]。比利时杜鹃花(Rhododendron hybridum Hort.)一年四季花期可以控制，株型优美、花色艳丽、四季常绿和花期长等优点，具有较高的园艺观赏价值和经济价值[3-4]。比利时杜鹃花是世界盆栽花卉生产的主要种类之一，花色主要以红色和白色为主。
花青素(anthocyanin)为类黄酮化合物，包含多种水溶性天然色素，广泛存于自然界植物的花、叶片和果实等器官中[5]。花青素作为植物组织着色的重要色素，植物颜色的种类是由花青素的含量和种类决定的[6]。黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase, F3H)是花青素合成途径中的关键酶，F3H蛋白由Fe2+结合(HxDxnH序列)和2-酮戊二酸结合(RXS序列)的双加氧酶超家族(2OG-FeⅡ_oxy superfamily)组成[7-9]。在金鱼草[10](Antirrhinum majus)中第一次报道黄烷酮3-羟化酶(F3H)可以将柚皮素转化为二氢山柰酚，生成的二氢黄酮醇可以在不同酶的作用下转化为其他类黄酮物质。之后陆续从石榴(Punica granatum L.)[11]、桑树(Mulberry)[12]、滇水金凤(Impatiens uliginosa)[13]和锦鸡儿(Caragana korshinskii)[14]等植物中分离得到F3H基因序列。F3H基因表达量的高低会影响植物花青素的成分以及在环境胁迫下的生理生化状态。研究表明，在日本牵牛花(Ipomoea nil)[15]中F3H突变基因为显性斑点激活因子的等位基因，其序列改变会导致产生淡黄色花朵。在红砂(Reaumuria soongorica)[16]研究中，由于胁迫存在F3H基因表达量增强，导致总黄酮和花青素积累增加，抗氧化能力也随之增强。将枸杞(Lycium chinense)[17] F3H基因在烟草(Nicotiana tabacum)中过表达，与非转基因烟草相比，转基因烟草所含的丙二醛和H2O2含量降低，抗氧化能力增强。利用RNAi技术构建F3H基因载体使草莓(Fragaria ananassa)[18]果体内的F3H基因沉默，发现草莓中的花青素含量和黄酮醇含量大大降低。黄丝瓜藓(Pohlia nutans) F3H基因过表达增加了拟南芥(Arabidopsis thaliana)中对盐和氧化应激的耐受性[19]。Forkmann等[20]发现大丽菊(Dahlia pinnata)、百日草(Zinnia elegans)的白花突变体产生是由于F3H的转录表达被抑制导致的。Chaipanya等[21]利用农杆菌浸润法，将编码发夹式F3H RNA的RNAi基因沉默载体pJA8F3H导入睡莲(Nymphaea)花瓣中，与对照组相比，红色和紫蓝色花瓣品种的F3H基因表达下调，说明F3H基因的表达量与花瓣颜色相关。国内外研究表明，杜鹃花黄烷酮3-羟化酶F3H基因功能尚未报道。
本研究以红色比利时杜鹃花不同发育时期花瓣为实验材料，克隆比利时杜鹃花RhF3H基因的开放阅读框(open reading frame, ORF)全长，并进行生物信息学分析；对比利时杜鹃花不同时期花瓣RhF3H基因表达量进行分析；构建原核表达载体pET-28-RhF3H，通过在大肠杆菌BL21中异源表达，制备出重组蛋白；利用农杆菌介导法进行拟南芥遗传转化研究。在比利时杜鹃花花色形成中RhF3H基因的调控机制尚不清楚。本研究为杜鹃花花色形成的分子机理提供一定的理论基础，为杜鹃花花色分子育种提供参考资料。
1 材料与方法 1.1 实验材料实验材料在我国宁波北仑万景杜鹃良种园中采集。采集后立即置于液氮中，然后放入–80 ℃超低温冰箱内储存备用。选择生长良好的红色比利时杜鹃花4个生长时期(花苞期、初开期、盛开期和衰亡期)作为实验材料。样品均设3次生物学重复。
LB肉汤抗性培养基：50 mg/mL Kan, 50 mg/mL利福平(rifampicin, Rif)，50 mg/mL庆大霉素(gentamicin, Gent)。
Solution培养基：2.2 g/L 1/2 MS培养基、50 g/L蔗糖、0.5 g/L 2-吗啉乙磺酸[2-(4-morpholino) ethanesulfonic acid, MES]、1 μL/mL 6-苄氨基嘌呤(6-benzylaminopurine, 6-BA)和200 μL/L silwet L-77表面活性剂，用1 mol/L NaOH调pH 5.7。
1.2 实验方法 1.2.1 RNA提取和cDNA合成用液氮研磨红色比利时杜鹃花花瓣，使用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取花瓣总RNA。通过1.5%琼脂糖凝胶电泳和SpectraMax 190全波长酶标仪(北京龙跃生物科技发展有限公司)测定总RNA的质量和浓度。按照NovoScript® Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA Purge)反转录试剂盒(上海近岸科技有限公司)逆转录合成cDNA。使用SMARTer® RACE 5′/3′ Kit RACE试剂盒(宝日医生物技术有限公司)逆转录合成3′/5′ cDNA[22]。
1.2.2 RhF3H基因克隆从NCBI数据库中下载与杜鹃花属植物亲缘关系较近浙江红山茶(Camellia chekiangoleosa, JN944581.1)、三七(Panax notoginseng, MN520446.1)和中华猕猴桃(Actinidia chinensis, ACL54955.1)植物的F3H基因部分编码序列(coding sequence, CDS)序列。使用Primer 6.0软件设计简并引物F3H-R1和F3H-F1 (表 1)。以比利时杜鹃花花瓣cDNA为模板，按照2×Fast Pfu Master Mix酶(上海近岸科技有限公司)说明书进行PCR扩增。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，回收与目的片段大小相同的PCR产物，将回收产物与pEASY®-Blunt Cloning Kit (北京全式金生物技术股份有限公司)载体连接并转化到大肠杆菌DH5α菌株中。将DH5α感受态细胞均匀涂布具有卡那霉素(kanamycin, Kan)抗性的LB (Luria-Bertani)琼脂培养基上，将平板置于37 ℃恒温培养箱中，倒置过夜培养。挑选37 ℃过夜培养平板的单一菌落，利用M13F和M13R通用引物进行菌液PCR，筛选阳性克隆菌，进行序列测定(北京擎科生物科技有限公司)。根据简并引物的扩增序列设计RACE引物F3H-5′和F3H-3′ (表 1)。按照2×Fast Pfu Master Mix酶说明书进行PCR扩增。后续实验过程与保守区域克隆相同，使用DNAMAN 8软件进行序列拼接获得目的基因全长序列。使用Primer 6.0软件设计全长引物F3H-R2和F3H-F2 (表 1)，在起始密码子前和终止密码子后设计引物，获得F3H基因全部核苷酸序列[23]。
| Primer name | Use | Primer sequence (5′→3′) |
| F3H-R1 | Conservative zone augmentation | CTTTGAACCTCCCATTGCTTA |
| F3H-F1 | AAGAAAGGTGGATTCATCGT | |
| F3H-3′ | RACE 3′ augmentation | TCGTGTCCAGTCATCTTCAGGGGG |
| F3H-5′ | RACE 5′ augmentation | CTGGCCTGTAAGTTGCTGGGGG |
| F3H-R2 | Cloning the full-length of ORF | ATGGCGCCAACGACCACCACGCT |
| F3H-F2 | CTAAGCAAAAATCTCTTCAACTC | |
| F3H-R3 | Real-time fluorescence quantitative PCR | GCCTGTAAGTTGCTGGGGGTTTT |
| F3H-F3 | GGGTTGTGGGCATTTCGGGTAGA | |
| Action-R | Internal reference genes Action | CTCTTCAGGAGCAACACGGA |
| Action-F | CACTGGTGTCATGGTTGGGA | |
| F3H-R4 | Recombinant protein preparation primer | AGCTTGTCGAGGAGCTCGAAAGCAAAAATCTCTTCAACTC |
| F3H-F4 | AAATGGGTCGCGGATCCGAAATGGCGCCAACGACCACCAC | |
| F3H-R5 | Overexpression primer | CCTTTACTAGTCAGATCTACAGCAAAAATCTCTTCAACTC |
| F3H-F5 | GAACAGGGGGACTCTTGACCATGGCGCCAACGACCACCAC | |
| F: Forward primer; R: Reversed primer. F3H-F4 and F3H-F5: Underscore 20 bp for the vector sequence. Bold characters for the starting codon. F3H-R4 and F3H-R5: Underscore 20 bp for the vector sequence. | ||
采用DNAMAN 8.0软件进行同源蛋白质序列比对；采用MEGA 6.0软件构建系统进化树；采用ProtParam网站对RhF3H蛋白质理化特性进行分析(http://web.expasy.org/protparam)；采用Protscale网站对RhF3H蛋白进行疏水性分析(http://web.expasy.org/protscale)；采用NetPhos网站对RhF3H蛋白磷酸化位点进行分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)；采用SOPMA和Swiss Model网站对RhF3H蛋白质二级和三级结构进行预测(https://npsa-prabi.ibcp.fr/; https://www.swissmodel.expasy.org/)。
1.2.4 RhF3H基因实时荧光定量PCR选择红色比利时杜鹃花花苞期、初开期、盛开期和衰亡期作为实验材料，参考刘小飞等[24]实时荧光定量PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)内参基因筛选及验证的方法，以Action-R和Action-F作为内参引物(表 1)。设计qRT-PCR引物F3H-R3和F3H-F3 (表 1)。提取实验材料总RNA，反转录合成荧光cDNA。参考NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus (上海近岸科技有限公司)说明书，反应体系包括35 μL的2×NovoStart® SYBR qPCR SuperMix Plus酶，正、反向引物各1.4 μL，1.4 μL的cDNA模板，30.8 μL的ddH2O，总体积70 μL，进行qRT-PCR扩增。反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 1 min，30个循环。采用2–ΔΔCT法计算基因相对表达量[25]。每个样品设置3次生物学重复。
1.2.5 RhF3H基因的原核表达使用Primer 6.0软件设计带有酶切位点的上下游引物F3H-F4和F3H-R4，下划线20 bp为载体序列(表 1)。按照2×Fast Pfu Master Mix酶说明书进行PCR扩增，后续实验过程与保守区域克隆相同。用EcoR I-HF酶(纽英伦生物技术有限公司)将pET-28a质粒(武汉淼灵生物科技有限公司)进行单酶切，将酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并进行割胶回收纯化。使用NovoRec® plus One step PCR Cloning Kit (上海近岸科技有限公司)连接酶试剂盒将纯化产物按载体片段和插入片段摩尔比1:2连接。将连接后的pET-28a-RhF3H载体加入DH5α感受态细胞中，将一定量的菌体均匀涂布在含Kan的抗生素平板上，37 ℃倒置培养过夜。挑取重组的单一菌落进行菌液PCR鉴定，将质粒送样测序。
1.2.6 RhF3H重组蛋白制备与纯化将重组质粒pET-28a-RhF3H和空载质粒pET-28a，轻轻混匀加入BL21感受态细胞中。将转化后的BL21加到含Kan抗性的LB琼脂培养基，37 ℃倒置过夜培养。将重组质粒pET-28a-RhF3H和空载质粒pET-28a阳性BL21单一菌落培养于10 mL含有Kan抗性的LB肉汤培养基中，37 ℃、200 r/min培养过夜。当菌液OD600达到0.5−0.8时，加入238 μL 0.5 mmol/L的IPTG溶液，在37 ℃条件下诱导重组蛋白8 h。诱导结束后4 ℃、8 000 r/min离心10 min收菌，用2 mL 0.1%磷酸盐缓冲液(PBS)悬浮沉淀，对沉淀进行超声处理，4 ℃、13 000 r/min离心10 min后吸取上清液，用2 mL 0.1% PBS悬浮沉淀。分别收集上清和沉淀，取20 μL蛋白样品加入20 μL DTT混匀，100 ℃水浴加热5−10 min使蛋白变性。分别进行10% SDS-PAGE电泳和重组蛋白可溶性验证。使用His60镍超流树脂和重力柱对可溶性重组蛋白进行纯化，收集洗脱液，将洗脱液进行10% SDS-PAGE电泳分析[26]。
1.2.7 pCAMBIA1302-RhF3H过表达载体的构建与农杆菌转化使用Primer 6.0软件设计带酶切位点上、下游引物F3H-F5和F3H-R5，下划线20 bp为载体序列(表 1)。按照2×Fast Pfu Master Mix酶说明书进行PCR扩增，后续实验过程与保守区域克隆相同。参照Yuan等[27]的方法，用Nco l-HF酶(纽英伦生物技术有限公司)将pCAMBIA1302质粒进行单酶切，酶切产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，将酶切产物进行割胶回收纯化。使用NovoRec® plus one step PCR Cloning Kit连接酶试剂盒将纯化产物按载体片段和插入片段摩尔比1:2连接。将连接后的p1302-RhF3H载体加入DH5α感受态细胞中，将一定量的菌体均匀涂布在含Kan的LB抗性琼脂培养基上，37 ℃倒置过夜培养。挑取平板上的单一菌落进行PCR鉴定，将质粒送样测序。将p1302-RhF3H重组质粒和p1302空载质粒利用冻融法转化到农杆菌GV3101中，将一定量的菌体均匀涂布在含卡那霉素的LB抗性琼脂培养基上，28 ℃倒置过夜培养。挑取重组的单一菌落进行PCR鉴定。
1.2.8 拟南芥植株遗传转化、纯合体筛选及GUS染色挑取农杆菌平板上重组质粒p1302-RhF3H和空质粒p1302的单一菌落，与5 mL LB肉汤抗性培养基混合，在28 ℃、200 r/min的摇床中培养12 h，菌液呈橘黄色且无白色絮状物。测量菌液OD600=0.8−1.2，吸取2 mL橘黄色菌液接种于150 mL含有3种抗生素的LB肉汤抗性培养基中，在28 ℃、200 r/min摇床中培养8 h，菌液呈橘黄色且有白色絮状物。4 ℃、4 000 r/min离心10 min，去除上清液，加入1 mL Floral Dip Solution培养基，吹打混匀。用Floral Dip Solution培养基重悬，倒入烧杯中备用。在烧杯浸染液中，将生长良好的拟南芥花蕾浸泡1−2 min，保鲜膜保湿暗培养12 h以上，然后置于人工气候培养箱培养。待种子成熟后，收取T0代种子[28-29]。用25 mg/L Kan培养基筛选阳性植株T1代，提取T1代转基因植株总DNA，选取F3H-R5和F3H-F5引物对转基因株系进行PCR鉴定。利用25 mg/L Kan培养基反复筛选阳性植株到T3代。将T3代转基因拟南芥植株生长1周后，当幼苗长至4片左右时，对转基因植株进行β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase, GUS)染色，在体视显微镜下观察照相。
1.2.9 拟南芥植株F3H基因qRT-PCR检测提取野生型(WT)、T3代转空载(p1302)和T3代转基因拟南芥植株总RNA，反转录合成荧光cDNA，进行qRT-PCR分析[30]。
1.2.10 拟南芥植株总黄酮和花青素含量测定根据舍莉萍等[31]测量总黄酮的方法，取出–80 ℃中保存的WT、T3代p1302和T3代转基因拟南芥植株，精确称取0.2 g后，用液氮磨碎，置于50 mL离心管中，加入20 mL 75%乙醇，45 ℃条件下恒温超声1 h，放入离心机6 000 r/min离心10 min，待测；称取芦丁(上海源叶生物科技有限公司)标准品0.5 g，用75%乙醇溶液定容(25 mL容量瓶)，即得浓度为2 mg/mL。依次吸取标准品溶液0、1、2、3、4、5、6、7 mL置于15 mL离心管中，用5%乙醇溶液定容12.5 mL容量瓶，分别配置成浓度为0、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80、0.96、1.12 mg/mL。取标准液1.0 mL置于15 mL离心管中，加入500 μL 5% NaNO2溶液，摇匀静置5 min；加入500 μL 10% Al(NO3)3溶液，摇匀静置6 min；再加入500 μL 40% NaOH溶液，用75%乙醇溶液定容至12.5 mL容量瓶中，摇匀放置15 min。以75%乙醇为空白对照，用SpectraMax 190酶标仪，在510 nm处测定芦丁含量。根据标准曲线y=0.102x–0.001 (R2=0.990)计算总黄酮含量。
根据杨飞芸等[32]和刘长姣等[33]测量花青素的方法，取出–80 ℃中保存的WT、T3代p1302和T3代转基因拟南芥植株，精确称取0.2 g后，用液氮磨，加入5% HCl-80%甲醇溶液4 ℃浸泡过夜，12 000 r/min离心20 min，取上清液，测530 nm处的吸光度值；称取矢车菊素-3-葡萄糖苷(上海源叶生物科技有限公司)标准品5 mg，用5% HCl-80%甲醇溶液定容100 mL容量瓶，即得浓度为0.05 mg/mL。依次吸取标准品溶液0、0.5、1、2、4、5 mL置于10 mL容量瓶中，用5% HCl-80%甲醇溶液定容10 mL容量瓶，分别配置成浓度为0、0.025、0.05、0.10、0.20、0.25 mg/mL。以5% HCl-80%甲醇为空白对照，用SpectraMax 190酶标仪，在530 nm处测定花青素含量。据标准曲线y=0.97x+0.003 (R2=0.994)计算花青素含量。
1.3 系统分析4个发育时期花瓣中RhF3H基因表达量、转基因拟南芥植株F3H基因表达量、总黄酮含量和花青素含量实验重复3次，结果用平均值±标准偏差(x±s)表示。
2 结果与分析 2.1 比利时杜鹃RhF3H基因的克隆以比利时杜鹃花cDNA为模板，利用简并引物进行PCR扩增获得490 bp保守区序列(图 1A)；根据保守区序列进行RACE扩增，分别获得526 bp的5′序列(图 1B)和901 bp的3′序列(图 1C)。利用DNAMAN软件将保守区、5′区和3′区序列进行比对拼接F3H基因全长为1 245 bp，其中包含1 092 bp的完整ORF序列(图 1D)，编码363个氨基酸，GenBank登录号为OP018672。
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| 图 1 比利时杜鹃花F3H基因PCR扩增 Fig. 1 PCR amplification of Rhododendron hybridum Hort. F3H gene. A：保守区序列. B：5′ RACE序列. C：3′ RACE序列. D：F3H基因的完整ORF区域 A: Conserved region sequence. B: 5′ RACE sequence. C: 3′ RACE sequence. D: F3H gene complete ORF region. M: 2 000 bp DNA marker. |
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使用DNAMAN 8软件将比利时杜鹃花RhF3H氨基酸序列与黑茶藨子(Ribes nigrum, AVI16674.1, RnF3H)、苦荞麦(Fagopyrum tataricum, ACQ99190.1, FtF3H)、西洋梨(Pyrus communis, AGL50918.1, PcF3H)、中华猕猴桃(Actinidia chinensis, ACL54955.1, AcF3H)、苹果(Malus domestica, AAX89397.1, MdF3H)、三枝九叶草(Epimedium sagittatum, ABY63660.1, EsF3H)、桑树(Morus alba, AOV62761.1, MaF3H)、金花茶(Camellia nitidissima, ADZ28514.1, CnF3H)、药葵(Althaea officinalis, UOI87842.1, AoF3H)、越橘(Vaccinium corymbosum, AYC35389.1, VcF3H)、钟冠报春苣苔(Primulina swinglei, AYD87888.1, PsF3H)和斑地锦草(Euphorbia maculate, UNO85900.1, EmF3H)的F3H氨基酸序列进行比对(图 2)。其中RhF3H蛋白含有5个保守基序，其中基序4和基序5中的His219、Asp221和His277参与Fe2+的结合；基序5中的Arg287和Ser289参与2-酮戊二酸的结合；基序2和基序3中存在3种保守的脯氨酸(Pro149、Pro205和Pro208)，在F3H蛋白质的折叠过程中起重要作用。RhF3H蛋白具有Fe2+结合(HxDxnH序列)和2-酮戊二酸结合(RXS序列)的双加氧酶超家族(2OG-FeⅡ_oxy superfamily)。通过RhF3H氨基酸序列与其他物种的氨基酸序列进行比对可知，RhF3H氨基酸保守基序与其他物种相类似。
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| 图 2 比利时杜鹃花与其他植物F3H氨基酸序列的多重比较 Fig. 2 Multiple comparison of amino acid sequences of Rhododendron hybridum Hort. with F3H of other plants. Motif 1-5: The 5 conserved motifs of the F3H protein are marked with red lines. ●: Indicates three important proline in the sequence. ▲: Indicates conserved amino acid residues involved in Fe2+ binding. ★: Indicates conserved amino acid residues involved in the binding of 2-ketoglutaric acid |
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使用MEGA 6.0软件将比利时杜鹃花RhF3H氨基酸与黑茶藨子(Ribes nigrum, AVI16674.1, RnF3H)、苦荞麦(Fagopyrum tataricum, ACQ99190.1, FtF3H)、西洋梨(Pyrus communis, AGL50918.1, PcF3H)、中华猕猴桃(Actinidia chinensis, ACL54955.1, AcF3H)、苹果(Malus domestica, AAX89397.1, MdF3H)、三枝九叶草(Epimediumsagittatum, ABY63660.1, EsF3H)、桑树(Morus alba, AOV62761.1, MaF3H)、金花茶(Camellia nitidissima, ADZ28514.1, CnF3H)、药葵(Althaea officinalis, UOI87842.1, AoF3H)、越橘(Vaccinium corymbosum, AYC35389.1, VcF3H)、钟冠报春苣苔(Primulina swinglei, AYD87888.1, PsF3H)和斑地锦草(Euphorbia maculate, UNO85900.1, EmF3H) 12种植物F3H氨基酸序列构建进化树(图 3)。结果表明，比利时杜鹃花RhF3H蛋白与越橘F3H蛋白亲缘关系最近。
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| 图 3 比利时杜鹃花和其他物种F3H蛋白质的系统进化树 Fig. 3 Phylogenetic tree of F3H of Rhododendron hybridum Hort. and other species. |
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ProtParam分析表明，RhF3H蛋白分子式为C1 803H2 849N483O547S15、相对分子质量为40 525.26 Da、理论等电点为5.24、总的负电荷残基(Asp+Glu)为55、总的正电荷残基(Arg+Lys)为44、不稳定指数(Ⅱ)为42.08和脂肪系数为83.53。比利时杜鹃RhF3H蛋白为不稳定带负电荷的酸性蛋白质。
Protscale对RhF3H进行蛋白疏水性分析(图 4)。RhF3H蛋白质存在明显的疏水区和亲水区，其中第44位最高，为2.278；第147位最低，为–2.722。结果表明，RhF3H蛋白质为亲水性蛋白质。
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| 图 4 比利时杜鹃花F3H蛋白质疏水性/亲水性预测 Fig. 4 Prediction of the hydrophobic/hydrophilic of F3H protein in Rhododendron hybridum Hort. |
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利用NetPhhos 3.0推测比利时杜鹃花RhF3H蛋白质磷酸化位点，结果见图 5。存在22个磷酸化位点，其中丝氨酸(serine, Ser) 9个，苏氨酸(threonine, Thr) 8个，酪氨酸(tyrosine, Tyr) 5个。
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| 图 5 比利时杜鹃花F3H蛋白质氨基酸翻译后磷酸化修饰预测 Fig. 5 Prediction of phosphorylation site after amino acid translation of F3H protein in Rhododendron hybridum Hort. |
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利用SOPMA预测RhF3H蛋白的二级结构(图 6A)，有146个氨基酸参与形成α-螺旋，占总氨基酸的40.22%；有68个氨基酸参与形成延伸链，占总氨基酸的18.73%；有19个氨基酸参与β-转角，占总氨基酸的5.32%；有130个氨基酸参与形成无规则卷曲，占总氨基酸的35.81%。结果表明，比利时杜鹃花F3H蛋白主要由无规则卷曲、α-螺旋和延伸链结构组成。采用Swiss Model预测RhF3H蛋白的三级结构(图 6B)，在蛋白质数据库中选择与F3H蛋白质序列一致性最高的蛋白质为模板进行同源模建，得到杜鹃F3H蛋白质的结构模型。结果表明，比利时杜鹃花F3H蛋白质三级结构与二级结构预测结果相符，由无规则卷曲、α-螺旋和延伸链结构组成。
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| 图 6 比利时杜鹃花F3H蛋白二级和三级结构预测 Fig. 6 Prediction of secondary and tertiary structures of Rhododendron hybridum Hort. F3H protein. A: Protein secondary structure (blue for alpha helix, red for beta bridge, green for beta turn and purple for random coil). B: Protein tertiary structure. |
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如图 7所示，在4个花期的花瓣中，RhF3H基因的表达水平呈先上升后下降的趋势，且具有显著差异性(P < 0.05)。RhF3H基因表达量在初开期最高，其次是盛开期，在花苞期时期表达量最低。花苞期与衰亡期的表达量无显著差异，随着花序的开放，在初开期比花苞期约为6.45倍。这与汪庆昊等[34]在红比利时杜鹃花花朵发育过程中，花青素的含量呈现先上升后下降的趋势，在盛开期花青素含量最高。与RhF3H基因表达量的变化规律基本符合。
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| 图 7 比利时杜鹃花花瓣不同发育阶段F3H基因表达量 Fig. 7 Expression of F3H genes in Rhododendron hybridum Hort. petals at different developmental stage. Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level. |
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如图 8A所示，将测序正确的重组质粒pET-28-RhF3H和空载质粒pET-28转入大肠杆菌BL21中，以空载质粒pET-28转入BL21作为蛋白阴性对照。10% SDS-PAGE凝胶电泳结果显示，可溶性重组蛋白大小约为40 kDa，与生物信息学预期大小相近。
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| 图 8 重组RhF3H蛋白纯化前后10% SDS-PAGE分析 Fig. 8 10% SDS-PAGE analysis before and after purification of recombinant RhF3H protein. A: 10% SDS-PAGE analysis before purification of recombinant RhF3H protein. 1, 3 and 5: Suspension precipitates at 37 ℃; 2, 4 and 6: Supernatants at 37 ℃. 1‒2: Empty plasmids; 3‒4: Recombinant plasmids without IPTG; 5‒6: Recombinant plasmids with IPTG added. B: 10% SDS-PAGE analysis after purification of recombinant RhF3H protein. 1: The purified recombinant protein expressed using plasmid pET-28-RhF3H. M: Molecular mass standards (kDa). |
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如图 8B所示，使用His60镍超流树脂和重力柱对诱导后重组蛋白进行纯化。10% SDS-PAGE凝胶电泳结果显示，纯化后的RhF3H蛋白大小约为40 kDa，证实了RhF3H蛋白在BL21中成功表达。
2.5 转基因拟南芥筛选鉴定如图 9所示，提取WT、T3代p1302和T3代转基因拟南芥DNA进行PCR鉴定，对目的基因RhF3H进行扩增，WT和p1302拟南芥均未扩增出条带，1、2和重组质粒(CK+)都扩增出条带，说明RhF3H基因已整合到拟南芥的基因组DNA中。
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| 图 9 转基因RhF3H拟南芥的筛选及纯合株系DNA分子鉴定 Fig. 9 Screening of transgenic RhF3H Arabidopsis thaliana and molecular identification of pure strain DNA. M: 2 000 bp DNA marker; CK+: Recombinant plasmid as positive control; CK–: Sterile water as negative control; p1302: Transgenic null plasmid Arabidopsis thaliana; 1‒2: p1302-RhF3H transgenic Arabidopsis thaliana. |
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如图 10所示，p1302-RhF3H基因编码区前的启动子是CaMV 35S启动子(增强型)；p1302载体是组成型表达；基因表达组织定位是整株植物遍在表达。利用WT、T3代p1302和T3代转基因拟南芥植株中GUS的表达情况，WT拟南芥未携带GUS基因，整个植株呈无色，p1302和转基因拟南芥携带GUS基因，整个植株呈蓝色。说明目的基因整合到转基因拟南芥基因组中。
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| 图 10 转基因拟南芥和野生型拟南芥GUS染色 Fig. 10 GUS staining of transgenic and wild-type Arabidopsis thaliana. WT: Wild-type Arabidopsis thaliana plants; p1302: Transgenic null-loaded plasmid Arabidopsis thaliana; p1302-RhF3H: Transgenic Arabidopsis thaliana plants. |
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如图 11A所示，野生型(WT)拟南芥植株共种植20株，其中18株存活(叶片为绿色)，植株存活率为90%。T3代p1302拟南芥植株一共种植15株，其中12株存活(叶片为绿色)，植株存活率为80%。T3代转基因拟南芥植株共种植40株，其中39株存活(叶片为红褐色)，植株存活率为97.5%。其中WT和p1302拟南芥叶片颜色呈绿色，而转基因拟南芥叶片颜色呈红褐色。
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| 图 11 野生型和转基拟南芥植株qRT-PCR、总黄酮和花青素含量分析 Fig. 11 qRT-PCR, total flavonoid and anthocyanin content analysis of wild-type and transgenic Arabidopsis thaliana plants. A: Phenotypes of wild-type (WT), transgenic null-loaded plasmid (p1302) and transgenic Arabidopsis thaliana plants. B: qRT-PCR detection of F3H gene in WT, p1302 and transgenic Arabidopsis thaliana plants. C: Analysis of total flavonoids in WT, p1302 and transgenic Arabidopsis thaliana plants. D: Analysis of total anthocyanins in WT, p1302 and transgenic Arabidopsis thaliana plants. Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 level. |
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如图 11B所示，WT和p1302转空载拟南芥植物不含RhF3H基因，T3代转基因拟南芥植物含RhF3H基因。从NCBI中查找到拟南芥植株F3H基因(NM_114983.3)，说明拟南芥植株中也含有F3H基因。DNAMAN 8软件对比拟南芥F3H基因和比利时杜鹃花RhF3H基因具有72.07%相似度，两者荧光定量PCR引物相近，说明选择的荧光定量PCR引物不是特异性引物，AtF3H和RhF3H无法区分，但不影响试验结果。提取WT、T3代p1302和T3代转基因拟南芥总RNA，合成荧光cDNA，通过qRT-PCR分析。结果表明，在WT与p1302拟南芥植株中AtF3H表达量相近，转基因拟南芥植株中RhF3H基因表达量高于WT和p1302拟南芥植株。
如图 11C所示，提取WT、T3代p1302和T3代转基因拟南芥植株的总黄酮含量，采用芦丁标准溶液的校准曲线法检测总黄酮含量。结果表明，在WT和T3代p1302拟南芥植株总黄酮含量相近。转基因拟南芥植株高于WT和p1302拟南芥植株总黄酮含量，比WT和p1302拟南芥植株总黄酮含量约增加4.3倍。
如图 11D所示，提取WT、T3代p1302和T3代转基因拟南芥植株的花青素含量，采用校准曲线法检测花青素含量。结果表明，WT和p1302拟南芥植株花青素含量相近，转基因拟南芥植株花青素含量较WT和p1302拟南芥株花青素含量高，比WT和p1302拟南芥植株花青素含量约增加3.0倍。
3 讨论与结论杜鹃花作为重要的观赏性植物，其花色艳丽具有重要的商业和观赏价值。而杜鹃花花色形成过程中花青素的合成通路相关基因报道较少。为进一步探究其花色形成的生物学特性，本研究在比利时杜鹃花中克隆得到1个F3H基因，并在杜鹃花转录组中有一个黄烷酮3-羟化酶RhF3H基因[35-36]。本研究克隆比利时杜鹃花黄烷酮3-羟化酶(RhF3H)基因，并进行生物信息学分析。结果表明，比利时杜鹃花RhF3H基因全长1 245 bp，包含1 092 bp的完整ORF序列，编码363个氨基酸。生物信息学分析表明，比利时杜鹃RhF3H蛋白为不稳定带负电荷的酸性蛋白质。RhF3H蛋白由Fe2+结合(HxDxnH序列)和2-酮戊二酸结合(RXS序列)的双加氧酶超家族(2OG-FeⅡ_oxy superfamily)组成。与王海竹等[7]的预测结果相符，红穗和白穗醋栗RrF3H和RaF3H蛋白结构域由2-O-酮戊二酸和Fe2+依赖的双加氧酶超家族组成，属于双加氧酶家族；与许明等[8]发现的藤茶黄烷酮3-羟化酶AgF3H蛋白含有His217、Asp219和His275参与Fe2+的结合(HxDxnH序列)，Arg285和Ser287参与2-酮戊二酸的结合(RXS序列)预测结果相符。系统进化树分析表明，比利时杜鹃花RhF3H蛋白与越橘F3H蛋白亲缘关系较最近。
不同发育阶段花瓣RhF3H基因相对表达量呈先上升后下降的变化趋势，在初开期的表达量最高，其次是盛开期。与王蕊等[37]在华北紫丁香(Syringa oblata)中，SoF3H基因表达水平的研究结果基本一致，随着花序的逐渐开放基因表达量逐渐降低；与陈丽琦等[38]威氏绿绒蒿(Meconopsis wilsonii) MwF3H基因相对表达量呈现先下降再上升的趋势相同，MwF3H基因相对表达量在花发育不同过程存在明显差异。
构建原核表达载体pET-28a-RhF3H，在大肠杆菌BL21中成功表达重组蛋白，且表达的重组蛋白在上清液中，RhF3H蛋白属于可溶性蛋白。通过His60镍超流树脂和重力柱获得纯化重组蛋白。比利时杜鹃花RhF3H蛋白大小约为40 kDa，与理论值相近。与胡晓婧等[39]发现茶树(Camellia sinensis) CsF3H蛋白诱导表达蛋白大小约为40 kDa结果相同；与赵乐等[40]在独行菜(Lepidium apetalum) LaF3H蛋白大小和经纯化LaF3H重组蛋白的研究结果相同。本研究为RhF3H蛋白进行体外酶促反应、酶学活性和底物特异性奠定基础。
构建比利时杜鹃花p1302-RhF3H过表达载体，采用花絮侵染法转化拟南芥植株，并进行DNA分子鉴定和GUS染色初步检测。野生型(WT)和T3代转空载(p1302)拟南芥植株无扩增条带，T3代转基因拟南芥植株带有目的条带。与郑世仲等[28]将茶树CsbHLH基因转入拟南芥植株也检测到目的条带，与本研究结果相同；转基因拟南芥经GUS染色初步检测，WT拟南芥植株未携带GUS基因，整个植株呈无色。T3代p1302和转基因拟南芥植株携带GUS基因，整个植株呈蓝色。与王立光等[41]将拟南芥AtNHX6基因启动子与GUS的融合表达载体成功构建并正常启动GUS基因表达结果相同。与李兵等[30]蓝型油菜(Brassicanapus) BnPHL12基因在转基因阳性植株的根、茎和叶器官中检测到GUS染色，与本研究结果相似。说明比利时杜鹃花RhF3H基因整合到拟南芥基因组中；通过qRT-PCR分析，在WT、p1302拟南芥植株AtF3H表达量相近，转基因拟南芥植株中RhF3H基因表达量高于WT和p1302拟南芥植株。杨飞芸等[32]的研究也发现锦鸡儿CiF3H转基因拟南芥的表达量也高于对照组。Song等[17]将枸杞LcF3H基因转入烟草中，与对照组烟草比较，转基因烟草LcF3H基因的表达量比野生型中表达量高；转基因拟南芥总黄酮和花青素含量分析，WT和p1302拟南芥植株总黄酮和花青素含量相近，转基因拟南芥植株总黄酮和花青素含量较WT和p1302拟南芥株高。Han等[42]在山茶中过表达CsF3Ha和CsF3Hb基因拟南芥类黄酮，转基因拟南芥中大部分黄酮醇苷和低聚原花青素的含量显著增加，而单儿茶素衍生物的含量降低。以上报道表明，过表达RhF3H基因的拟南芥植株影响黄酮和花青素的含量变化，从而影响拟南芥植株颜色。
本研究首次克隆出比利时杜鹃花RhF3H基因，并利用荧光定量法对RhF3H基因表达量进行分析；利用原核表达技术获得RhF3H纯化蛋白；利用过表达技术的拟南芥植株总黄酮和花青素含量都有所增加。为进一步深入研究RhF3H基因在比利时杜鹃花花青素合成过程中奠定一定的理论基础。
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