2023, Vol. 39中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 邹丹阳, 董雨萌, 陈晶瑜
- ZOU Danyang, DONG Yumeng, CHEN Jingyu
- 活体生物药：生物技术推动的创新药研发前沿
- Live biotherapeutic products: the forefront of innovative drug development driven by biotechnology
- 生物工程学报, 2023, 39(4): 1275-1289
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(4): 1275-1289
- 10.13345/j.cjb.220669
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文章历史
- Received: August 22, 2022
- Accepted: November 2, 2022
- Published: November 9, 2022
引用本文
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2. 苏州优信合生技术有限公司, 江苏 苏州 215000
2. U-Synbio Technologies Co., Ltd., Suzhou 215000, Jiangsu, China
人体是多种微生物群落的宿主，宿主与微生物之间复杂的相互作用对人类健康有着重要的影响[1]。人体胃肠道内的微生物群落可能会导致多种代谢和免疫相关的疾病，例如肥胖、营养不良、炎症性肠病等[2-7]。这些宿主-微生物之间相互作用的发现为通过调节微生物群落的结构和功能来解决疾病提供了新的思路，将微生物以一种具有针对性和可控性的方式递送至人体内进行疾病的治疗[8]。益生菌是活的细菌物种，能够在胃的酸性环境中生存和繁衍，并对宿主的健康产生有益的影响[9]。在益生菌被发现和应用的前100年里，人们只将益生菌作为食品或者膳食补充剂使用。进入21世纪，人们逐渐认识到微生物特别是细菌在疾病治疗上的潜力，同时受生命科学领域组学技术、DNA合成与测序、基因编辑等技术的推动，一个创新药研发的新领域逐渐崭露头角，即活体生物药(live biotherapeutic products, LBP)，也被称为“下一代益生菌”。活体生物药是利用正常微生物或促进微生物生长的物质制成的活的微生物制剂[10]，具有安全性高、疗效好、成本低的优势，有望成为未来创新药研发领域的一匹“黑马”。活体生物药主要分为天然活菌药物和基因编辑活菌药物两类，前者又可细分为单菌种药物和多菌种复配药物[11]。目前，LBP的研发已在癌症、炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)、艾滋病、糖尿病、焦虑症、苯丙酮尿症等多种类型疾病中有所报道[12-17]。活体生物药应用范围之广，极具开发的潜力和价值。本文将从生物技术角度介绍活体生物药的研究进展，并对活体生物药在疾病治疗上的发展前景以及所面临的挑战进行讨论，以期为活体生物药的开发提供参考。
1 活体生物药概述 1.1 活体生物药的定义与开发指导原则2016年美国食品药品监督管理局生物制品评价与研究中心(Food and Drug Administration Center for Biologics Evaluation and Research, FDA/CBER)发布了全球第一部明确将活体生物药作为药物使用的指南[10]，该指南侧重的是活体生物药早期临床阶段化学制造和控制(chemical manufacturing and control, CMC)相关技术要求，明确了活体生物药的定义。活体生物药是一种生物活性药物，具有以下的特点：(1) 含有活的生物体，如细菌；(2) 具有预防、治疗人类疾病或适应证的功能；(3) 不是疫苗。其核心要素是要按新药的标准开发，明确适应症并进行系统的菌株安全性、药效、CMC以及临床评价。除了生物制品的一些共同特征以外，食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)指南突出了活菌药物特有的研究重点，如鉴定菌株的稳定性、抗生素敏感性、耐药性、是否转移以及存在移位的可能，还有产品的生产控制与稳定性等[18]。
1.2 活体生物药的主要类型目前开发的活体生物药可分为单菌药物、复合菌药物、工程菌药物3类。单菌药物即利用天然的单菌种微生物制成活体生物药，其药效明确、成分单一。复合菌药物由2种或多种天然菌种复配而成，成分和药效模型都更为复杂。随着合成生物学的发展，人们开始着力于人工设计和改造微生物，使之具有疾病治疗功效，并可实现靶向给药、生物遏制等功能，称为工程菌药物[19-20]。工程菌活体生物药相较于前2种药物具有智能响应、表达高效、靶向明确、功能多样等优势。这3种类型的活体生物药在疾病治疗方面已逐步展现出明确的疗效和临床应用价值。例如：单菌药物脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilus) BF839在肿瘤、自闭症、癫痫、银屑病、帕金森等疾病的治疗中均有报道[21-22]；著名的活体生物药公司Seres Therapeutics正在研制的复合菌药物SER-109可有效治疗复发性艰难梭菌感染(Clostridium difficile infections, CDI)[23]；美国合成生物学公司Synlogic研制的工程菌药物SYNB1618能显著降低苯丙酮尿症患者血清中苯丙氨酸水平[14]。
2 活体生物药的研究进展利用微生物来干预疾病是目前基础和转化研究的热门方向，国际上涌现了一批科研机构及企业正致力于将活菌作为治疗手段开发利用，特别是开发成活体生物药。严格按照FDA或欧洲药典对活体生物药的标准衡量，目前全球活体生物药研发尚处于临床前和临床阶段。
2.1 天然菌株LBP研发现状近年来，随着测序与分离技术的发展，人们不断发现了更多与疾病密切相关、但尚无人体应用历史的天然新菌种，并将其按照药物进行开发，成为天然菌株LBP，其包含单菌LBP和复合菌LBP，这2种类型的LBP已在多种疾病治疗的临床试验中有所报道。表 1总结了目前天然菌株LBP研发项目的进展情况。
| Type | Drug name/No. | Disease | Microbe | References |
| Singal-strain LBPs | MSB-01 | Atopic dermatitis | Staphylococcus hominis | [24] |
| Thetanix | Crohn’s disease | Bacteroides thetaiotaomicron | [25] | |
| MRx-4DP0004 | Asthma | Bifidobacterium breve | [25] | |
| MRx-0518 | Tumour | Enterococcus gallinarum | [25] | |
| SK08 | IBS/UC | Bacteroides fragilis | [26] | |
| LACTIN-V | Bacterial vaginosis | Lactobacillus crispatus | [27] | |
| XIa1 | Obesity | Christensenella minuta | [27] | |
| GEN-001 | Tumour | Lactobacillus lactis | [27] | |
| Blautix | IBS | ND | [27] | |
| MRx-0005 | Parkinson’s disease | Parabacteroides distasonis | [25] | |
| MRx-0029 | Parkinson’s disease | Megasphaera massiliensis | [25] | |
| MRx-1299 | Tumour | Megasphaera massiliensis | [25] | |
| Multi-strain LBPs | SER109 | CDI | Firmicutes | [23] |
| SER401 | Melanoma | ND | [27] | |
| RBX2660 | CDI | ND | [28] | |
| CP-101 | CDI | ND | [28] | |
| MaaT013 | Graft versus host disease | ND | [29] | |
| US-APR2020 | Chronic kidney disease | ND | [27] | |
| VE800 | Tumour | ND | [28] | |
| VE202 | UC | ND | [28] | |
| VE303 | CDI | ND | [28] | |
| VE416 | Food allergy | ND | [28] | |
| BMC128 | Tumour | ND | [27] | |
| ND: Not detected; IBS: Irritable bowel syndrome; UC: Ulcerative colitis. Whether fecal microbiota transplantation (FMT) is LBP is still controversial, but more and more literatures attribute FMT to LBP, so this paper also summarizes it as LBP. | ||||
单菌LBP已在癌症、消化道疾病等多种疾病的研究领域中有所报道。在癌症治疗方面，英国4D pharma plc公司基于鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)开发了活体生物药MRx0518，该药物可以与pembrolizumab单抗联合治疗实体瘤，其机理是MRx0518的鞭毛蛋白可以激活细胞受体TLR5和核因子(nuclear factor kappa-B, NF-κB)并诱导HT29-MTX细胞产生IL-8，引发强烈的促炎反应，从而抑制肿瘤细胞的生长[30]。目前，在一项正在进行的Ⅰ/Ⅱ期临床试验中已初步取得成效[25]。还有研究报道，MRx0518可以与放射疗法联合治疗胰腺癌[25]，受试者将在放射治疗开始前一周时每天服用MRx0518，且在整个放射治疗期间一直服用直至患者进行肿瘤切除手术，该研究现处于临床Ⅰ期阶段。
在消化道疾病方面，广州知易生物科技有限公司基于脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)开发了SK08药物，该药物可有效治疗肠应激综合征(irritable bowel syndrome, IBS)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)，并在临床前研究中展现出了良好的药效与安全性，目前已启动Ⅱ期临床研究。前期多项研究表明，脆弱拟杆菌产生的多聚糖可调节辅助性T细胞1(Th1)/(Th2)比例的平衡，增强机体T细胞的功能，同时可以诱导Treg细胞分化并产生IL-10，抑制炎症因子IL-17，从而达到调节机体的免疫功能的效果[26]。4D pharma plc公司开发了一种治疗克罗恩病(Crohn’s disease, CD)的LBP药物——thetanix[25]，该药物由一株多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)构成，其作用机理是抑制与多种炎症性疾病相关的NF-κB活化，产生的pirin-like蛋白已成为候选效应分子[31]，该药物在Ⅰb期临床试验中展现出良好的安全性，达到了预期结果，更大规模的Ⅱ期临床试验正在进行中。
除此之外，单菌LBP在呼吸系统疾病、妇科疾病以及神经系统疾病的治疗中也有所报道，由短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)制成的单菌药物MRx-4DP0004可治疗哮喘，目前研究人员正在通过Ⅰ/Ⅱ期临床研究进一步评估该药物的安全性、耐受性和免疫调节功效[27, 32]。OSel公司基于干酪乳杆菌(Lactobacillus crispatus)开发了一种活体生物药Lactin-V，该药物可以治疗复发性阴道炎，研究人员在228名接受过甲硝唑阴道凝胶治疗的患者阴道中施用了该药物，结果表明，经过11周的施用，患者复发阴道炎的概率显著降低[27]。由马赛巨型球菌(Megasphaera massiliensis)构成的MRx-0029以及由狄氏副拟杆菌(Parabacteroides distasonis)构成的MRx-0005在临床前均表现出治疗帕金森症的潜力，这2种菌株可以降低神经系统炎症反应，保护神经元免受氧化应激损伤并且恢复肠壁屏障完整性，目前这2款LBP的在研新药(investigational new drug, IND)申报已获得了FDA批准，即将进入临床试验阶段[33-34]。
综上所述，单菌LBP作为肿瘤免疫治疗的辅助用药极具开发前景；同时，其消化道给药的特点使其在治疗消化道相关疾病方面具有突出的优势；而对于像阴道炎这类菌群失调类型的疾病来说，相比于抗生素，单菌LBP更加安全、不易产生耐药性，而且可以迅速恢复菌群之间的平衡，减轻患者的生理和心理负担；MRx-0029和MRx-0005的IND申报获得批准也标志着LBP的临床项目已扩展到神经系统疾病领域。
2.1.2 复合菌LBP的开发宿主-微生物群落的相互作用构成了微生物和宿主免疫系统之间的复杂生态系统，而免疫系统功能紊乱是多种疾病的病因，因此利用菌群干预进行疾病治疗成为了当下的另一个新药研发热点，许多研究人员开始致力于复合菌LBP的开发。
21世纪初以来，CDI一直是全球主要的公共卫生问题之一[35-36]，基于粪菌移植(fecal microbiota transplantation, FMT)的微生物组疗法在临床试验中对CDI疗效显著。Seres Therapeutics公司研发的复合菌药物SER-109是一种由纯化的厚壁菌门孢子组成的微生物组治疗剂，可以有效治疗CDI，其核心逻辑是厚壁菌孢子有机体与艰难梭菌竞争性代谢生长所必需的营养素和胆汁酸，从而抑制艰难梭菌的繁殖[37]。Ⅲ期床结果显示，SER-109可显著降低CDI的复发率，且其安全性与安慰剂相似[23]。类似地，Rebiotix公司研发的复合菌药物RBX2660是一种广谱微生物群混悬液，也可以治疗CDI，该复合菌药物中的克劳氏芽孢杆菌和罗伊氏乳杆菌所分泌的化合物能抑制艰难梭菌的生长，此外该复合菌药物中的梭状芽孢杆菌代谢产生的次级胆汁酸能够增强艰难梭菌定殖抗性，同时提供营养生态位竞争的无毒艰难梭菌也会抑制艰难梭菌感染，该药物在Ⅲ期临床试验中已取得了关键积极的数据[27-28]。Finch Therapeutics公司正在研发的CP-101是一种胶囊给药的微生物组疗法，基于冻干保存的粪便，也用来防止CDI复发，目前该药物处于临床Ⅱ期阶段[28]。
还有许多复合菌LBP是从唾液或粪便等生物样本中分离出来的微生物组治疗剂，这些细菌被分离以后可以在克隆细胞库中繁殖。VEDANTA公司研发的VE303包含8种共生梭状芽孢杆菌菌株，可以治疗CDI，该复合菌药物在Ⅱ期临床试验达到了预期效果，Ⅲ期试验计划于2022年启动[27-28]。该公司的另一款药物VE800是从健康人类供体粪便中分离出的由11种细菌菌株组成的联合体，这些菌株可以诱导CD8+ T细胞的激活、增强免疫系统对肿瘤细胞的攻击能力并显著增强抗PD-1治疗的效果[38]，该药物与Nivolumab联合治疗多种肿瘤已经取得了一定进展，目前正在进行Ⅱ期临床试验，进一步评估其安全性、耐受性和疗效[27]。VE202含有经试验鉴定后的11株粪便来源的菌株，该药物可以通过调节肠道菌群诱导免疫耐受进而治疗自身免疫性疾病，例如炎症性肠病(IBD)，在Ⅰ期临床试验中，该药物展现出良好的安全性和耐受性，目前Ⅱ期临床研究正在进行中[27-28]。
除此之外，Biomica公司研发的复合菌药物BMC128含有4种来自人类肠道的天然菌株，它能够通过多种生物学过程增强免疫治疗效果并促进机体抗肿瘤免疫活性，从而抑制肿瘤的生长，目前研究人员正在进行该药物的Ⅰ期临床试验，进一步评估BMC128与Nivolumab联合治疗非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer, NSCLC)、黑色素瘤和肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)的安全性和耐受性[27]。MRM Health公司基于CORAL平台开发了一种复合菌LBP，该药物包含了经过合理搭配的9株肠道共生菌，在动物模型中，它能够改善门静脉高压、胰岛素信号传导、非酒精性脂肪肝活动指数以及预防肝纤维化的发展，除此之外该药物还可以改善血管内皮功能、重塑肠道菌群[39]。
虽然FMT疗法已经有诸多临床试验，但科学家始终无法掌握其明确的作用机制，因此具有一定的风险，包括不可预料的副作用、疗效不稳定和监管困难等。相比之下，成分明确的细菌组合体构成的复合菌LBP更加安全、可控，作用机制更加明确，人们更容易接受。
2.2 工程菌LBP的研发现状随着合成生物学的不断发展，研究人员利用合成生物学技术，在多种微生物底盘细胞中设计不同的基因线路，使构建完成的菌株具备人们所需要的特殊功能，工程菌药物已在多种疾病的临床试验中有所报道，表 2总结了工程菌LBP研发项目的进展情况。
| Drug name/No. | Disease | Engineered microbe | Clinical progress | References |
| MucoCept-CVN | AIDS | Lactobacillus jensenii | Preclinical | [40] |
| AG013 | Oral mucositis | Lactococcus lactis | Phaes Ⅱb | [27] |
| ADXS-HOT | Non-smallcelllungcancer | Listeria monocytogenes | Phase Ⅰ | [41] |
| ADXS-HPV | HPV related cancer | Listeria monocytogenes | Phase Ⅰ/Ⅱ | [41] |
| ADXS-PA | Prostate cancer | Listeria monocytogenes | Phase Ⅱ | [41] |
| SYNB1020 | Hyperammonemia | Escherichia coli Nissle1917 | Clinical termination | [42] |
| SYNB1618 | Phenylketonuria | Escherichia coli Nissle1917 | Phase Ⅰ/Ⅱa | [14] |
| SYNB1934 | Phenylketonuria | Escherichia coli Nissle1917 | Phase Ⅰ | [43] |
| SYNB8802 | Enteric hyperoxaluria | Escherichia coli Nissle1917 | Phase Ⅰ | [27] |
| SYNB1891 | Solid tumour | Escherichia coli Nissle1917 | Phase Ⅰ | [27] |
| VXM01 | Glioblastoma | Salmonella enterica subsp. enterica Ty21a | Phase Ⅱ | [27] |
| ATZ-04 | Rash related cancer treatment | Staphylococcus epidermidis | Phase Ⅰ | [27] |
| APS001F | Solid tumour | Bifidobacterium longum | Phase Ⅰ | [27] |
部分代谢疾病，如苯丙酮尿症等，是由于患者体内缺少某种代谢所需的酶或酶活存在缺陷引起的，这导致了细胞的正常代谢通路受阻，有毒物质因为无法代谢而积聚在细胞内[44-45]。许多研究表明特定的酶或包含特定途径的工程益生菌能够缓解生物体的代谢紊乱[14, 42]，其机理如图 1所示[46]。工程菌可以合成代谢所必需的酶从而恢复代谢，并且可以抑制有毒产物的合成或将其代谢成无毒产物，进而治疗此类代谢疾病。
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| 图 1 工程菌LBP治疗酶缺乏引起的代谢紊乱疾病的治疗机制[46] Fig. 1 The therapeutic mechanism of engineering LBPs in the treatment of metabolic disorders caused by enzyme deficiency[46]. The lack of E2 results in the accumulation of intermediate B and the insufficient supply of intermediate C. The engineered LBPs harboring E2 and/or E3 can be used to resume metabolism and eliminate the accumulation of the intermediate B. |
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苯丙酮尿症(phenylketonuria, PKU)是一种常染色体隐形遗传病，是一种罕见的先天性代谢疾病，患者因为体内缺乏苯丙氨酸羟化酶，因此无法将必需氨基酸苯丙氨酸(phenylalanine, Phe)转化为酪氨酸[46-47]，血液中Phe浓度异常升高可能导致严重的健康问题[48]。微生物或者植物中存在的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase, PAL)能够将Phe转化为氨和反式肉桂酸，可作为PKU治疗的潜在酶[49-50]。通过口服摄入的工程菌LBP可以在肠道内发挥作用，对人体通过食物代谢生成的Phe进行靶向递送和转化消除，减少其入血，缓解病情。基于此，笔者团队目前正在承担北京市自然科学基金“苯丙酮尿症益生菌活体生物药的研究与评价”项目，在前期对于苯丙酮尿症发病机制的探索研究的基础上，本团队对不同来源的PAL进行酶活评价和改造，筛选得到具有优势酶活的PAL酶序列(暂未公开披露)，并以益生性乳酸菌为底盘，基于合成生物学技术，构建表达PAL酶的工程菌株。通过以Phe为底物进行工程菌体催化的体外实验，我们证实了改造后的基因工程菌株具备降解Phe的能力，该项目为开发治疗苯丙酮尿症的LBP药物提供了强有力的技术支撑(尚未发表)。美国Synlogic公司的研究人员通过将编码苯丙氨酸解氨酶和l-氨基酸脱氨酶的基因插入到大肠杆菌(Escherichia coli) Nissle 1917 (缩写为“ECN”)的基因组中，构建了一株名为SYNB1618的工程菌[14]，该菌在厌氧诱导启动子Pfnrs的调控下，用染色体整合的2个苯丙氨酸内运蛋白基因pheP和3个苯丙氨酸解氨酶基因stlA进行细菌工程化[51-52]，为了降低厌氧过程对菌群密度的影响，Ptac启动子控制2个额外的stlA基因，在动物试验中，SYNB1618可显著降低Pahenu2/enu2小鼠的血浆Phe浓度且防止健康的非人类灵长类动物(NHPs)食蟹猴血浆中Phe浓度的激增。Ⅰ/Ⅱa期的临床试验结果显示，SYNB1618安全、耐受性良好，所有的参与者在末次注射后的4 d内清除了细菌，在健康志愿者和PKU患者的胃肠道中，SYNB1618能够消耗Phe并将其转化为无毒代谢物[14, 53]。SYNB1934是从SYNB1618演化出的改良菌株，具有更强的降解Phe的能力。Ⅰ期临床试验的结果显示，SYNB1934能够剂量依赖性地提高血浆中Phe的降解产物反式肉桂酸(trans-cinnamic acid, TCA)的水平。基于对Phe降解生物标志物的测量，SYNB1934的活性是SYNB1618的2倍[27, 43]。
高氨血症是一种代谢紊乱疾病，其特征是血液中氨含量过高[54]，该病的诱因是体内缺少参与尿素循环的酶以及转运蛋白，导致无法将游离氨代谢为尿素[55]。现有的治疗方法是使用乳果糖和抗生素，但其效率不高且具有许多副作用[56]。研究发现，口服益生菌瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus) NS8菌株可以缓解高氨血症大鼠的认知能力下降和焦虑的行为，这表明了利用肠道菌群减少肠道中氨的含量有望作为高氨血症的有效治疗途径[57]。除此之外，Kurtz等[42]以ECN为底盘生物构建了工程菌SYNB1020，其能够有效地将氨转化为l-精氨酸，该菌株中编码负调节因子的基因ThyA和ArgR被删除，以激活参与精氨酸生物合成和运输的几个基因的转录，编码抗反馈性N-乙酰谷氨酸合成酶的基因ArgA215被整合到基因组中以增加精氨酸的生物合成，在spfash高氨血症小鼠模型中，施用SYNB1020可降低血氨水平并将存活率提高至50%。不幸的是，该菌株在Ⅰb/Ⅱa期临床研究中降低血氨的效果并不理想，主要原因是研究人员选择的适应症为急性高血氨症，工程菌LBP无法在0.5 h内迅速发挥作用，因而没有达到预期效果，但该工程菌的治疗机制是合理的。这也给LBP的研发人员一个启示，在药物的临床试验中，选择适当的适应症尤为重要。
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，病因是由于机体胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，会导致多种并发症，例如心血管疾病、阿尔茨海默病、中风和神经损伤等[58]，目前它分为Ⅰ型糖尿病(type 1 diabetes, T1D)和Ⅱ型糖尿病(type 2 diabetes, T2D)[59]。目前，使用胰岛素和降血糖药物以及基于细胞因子的疗法是糖尿病的主要治疗方法[60-61]，与这些治疗方法相比，工程菌药物的副作用更小，且能够减轻因注射引起的疼痛。Takiishi等[62]设计了一种人类肠道菌株乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)来治疗T1D，修饰的乳酸乳球菌其能够分泌完整的胰岛素原自身抗原和具有生物活性的免疫调节细胞因子白细胞介素10 (interleukin-10, IL-10)。研究人员对非肥胖糖尿病(non obese diabetes, NOD)小鼠进行了该重组乳酸乳球菌和低剂量非特异性免疫调节剂抗CD3的联合治疗。结果表明，与对照组相比，59%的实验体NOD小鼠血糖水平恢复正常。Robert等[63]构建了一株工程化乳酸乳球菌，用其来产生T1D自身抗原GAD 65370-575和细胞因子IL-10，与短程低剂量抗CD3相结合，即使在严重高血糖的情况下，也可以稳定NOD小鼠的胰岛炎症。除此之外，Duan等[64]设计了一种重组菌株格氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)，其分泌的GLP-1-(1-37)可以降低血糖水平。GLP-1(1-37)能够在体内和体外通过将成人肠上皮细胞转化为功能性胰岛素产生细胞来诱导胰岛素合成[65]。编码GLP-1(1-37)的基因与USP45-LEISS分泌标记(SEC)以及多组氨酸(HIS)标签融合，由肠激酶位点分隔。在启动子PslpA控制下的这个表达盒被插入L. gasseri的染色体中。体外结果表明，GLP-1(1-37)可以将大鼠的肠上皮细胞转化为胰岛素分泌细胞，当将重组L. gasseri喂给糖尿病模型的大鼠时，在肠上肠中会产生大量分泌胰岛素的细胞。虽然工程菌治疗糖尿病在动物模型上取得了很大进展，但迄今为止临床试验报道很少。
2.2.2 抗感染LBP治疗剂的开发细菌感染在全世界范围内是导致人类发病和死亡的主要原因之一[66]，使用抗生素是预防和治疗细菌感染的主要疗法。然而，过度使用抗生素会导致抗生素耐药性，这是极大的公共卫生隐患[67]。近年来，通过工程菌来治疗细菌感染引起了人们的广泛关注。
Saeidi等[68]和Gupta等[69]构建了一种工程化大肠杆菌TOP10菌株，该菌引入了由铜绿假单胞菌群体感应分子N-酰基高丝氨酸内酯(acyl-homoserine lactones, AHL)诱导的启动子PLasI，以驱动基因回路的表达。如图 2所示，在该系统中，组成型的tetR启动子启动转录，生成的转录因子LasR与AHL 3OC12HSL结合并激活了杀伤和裂解开关，导致大肠杆菌底盘内产生Pyocin S5蛋白和E7裂解蛋白。E7裂解蛋白负责裂解大肠杆菌，使产生的Pyocin S5释放到工程菌外并特异性杀死铜绿假单胞菌，体外研究结果表明，该工程化的大肠杆菌可以显著抑制高达99%的浮游铜绿假单胞菌的生长。
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| 图 2 工程菌特异性杀死铜绿假单胞菌的基因回路设计 Fig. 2 Design of gene circuit in Escherichia coli for specific killing of Pseudomonas aeruginosa. |
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在上述基础上，研究人员又对其进行了进一步的改进，以ECN作为底盘细胞，并在动物模型中进行了预防铜绿假单胞菌肠道感染的实验，与之前的工程菌株改造系统相比，引入了额外的抗生物膜蛋白分散素B来破坏成熟的生物膜，研究结果表明，在铜绿假单胞菌感染的秀丽隐杆线虫模型中，治疗组的存活时间增加了2倍以上；在铜绿假单胞菌感染的小鼠模型中，治疗组铜绿假单胞菌水平比对照组降低了77%[70]。
Holowko等[71]和Duan等[72]同样以大肠杆菌设计了一种工程菌株，使其与群体感应进行串扰，从而防止霍乱弧菌产生毒素，该工程菌可提高幼年期小鼠模型的存活率并减少毒素的形成。
2.2.3 IBD的LBP治疗剂开发IBD是一种病因尚不明确的慢性、非特异性的肠道炎症性疾病，主要包括CD和UC。近年来，随着人们生活环境、饮食习惯的改变以及诊断水平的提高，全球IBD的发病率增长迅速，医疗系统压力增大，形势严峻[18, 73]。肠道微生物的多样性和稳定性是IBD的重要影响因素，基于微生物开发IBD治疗剂具有发展潜力。许多研究人员正在开发用于治疗IBD的工程菌株，目前大部分研究仍处于临床前阶段。
TGF-β1是一种重要的肠上皮细胞生长因子，许多研究证实其是IBD治疗的潜在靶点[74-75]。Hamady等[76]通过同源重组将编码TGF-β1基因的序列克隆到卵形拟杆菌(Bacteroides ovatus)木聚糖操纵子中木聚糖酶启动子的下游，构建了一种工程菌BO-TGF，该工程菌在木聚糖的诱导下可以合成并递送TGF-β，从而加速受损结肠上皮的愈合，减少炎症细胞浸润和促炎细胞因子的表达，并促进富含黏蛋白的杯状细胞的产生，该工程菌显著改善了小鼠结肠炎的临床症状。
啮齿动物线虫(Acanthocheilonema viteae, AvCys)中的胱抑素是治疗IBD的有效候选物[77]，Whelan等[78]通过对大肠杆菌ECN进行基因改造构建了一种工程菌EcN-AvCys，该工程菌可以改善猪组织和人类细胞培养物中的肠上皮屏障功能，并显著抑制小鼠结肠炎模型和断奶后仔猪的肠道炎症。
Elafin是一种在健康肠黏膜中表达的天然蛋白酶抑制剂，在体外和动物模型中具有多效抗炎的特性，研究表明，在IBD患者中，Elafin的黏膜表达减少。Motta等[79]和Bermúdez- Humarán等[80]构建了一种表达Elafin的重组Lactococcus lactis (LAB)菌株。在急性和慢性结肠炎小鼠模型中，通过口服摄入该工程化LAB有助于恢复肠道稳态，降低肠道通透性以及炎症上皮细胞释放的细胞因子和趋化因子，从而预防炎症性肠病的发生。
3 总结与展望活体生物药(LBP)在生物技术的推动下应运而生，成为了一种极具临床应用前景的新型药物。目前，针对某些疾病治疗的药物显现出了一些弊端，包括疗效不理想、易出现超敏反应和耐药性、长期服药造成的副作用以及价格昂贵等等。面对这样的情况，LBP为药物的开发提供了一种新的思路，其特异性、靶向性、安全性等优势赋予了它在多种类型疾病中广阔的应用前景。为了进一步促进活体生物药的开发，充分发挥其优势，需要注意和改进的方面包括以下几点。
(1) 单菌LBP的成分单一、药效明确，但它由自然界筛选而来，开发具有一定的偶然性；复合菌LBP的药效和菌株的组成、菌株特性以及多菌株之间的相互作用密切相关，因此复合菌LBP的药效模型和稳定性的评价比单菌药物更复杂，且多种天然菌株的组合使它的开发具有比单菌LBP更高的偶然性。一般情况下，复合菌药物的疗效要比单菌药物更好，而单菌药物的药效剂量模型比复合菌药物更加简单清晰，因此更容易控制药效。天然菌株LBP一般都是通过消化道给药，因此它们在治疗消化道疾病上具有突出的优势。随着人们对基因工程编辑药物的认识更加全面和客观，相信工程菌药物将会越来越受到人们的青睐，虽然人们对于转基因的安全性一直心存疑虑，但面对一些严重疾病的治疗剂选择，例如肿瘤治疗上，病人的抗风险能力更高，依从性和接受度更好。且工程菌药物拥有独特的优势，例如靶向性更好，可以增加目标部位的药物积累并最大限度地减少脱靶效应；给药的剂量低，产生的毒副作用也很小，最重要的是它可以通过人为改造，使其具有人们想要的特定功能，能够“因病制宜”，因此它的应用范围更广泛。
(2) 工程菌在治疗由酶缺乏引起的代谢疾病时，通常会在其系统中引入新的酶基因，因此，应仔细评估外来引入酶的特异性和活性，以避免导致其他未预期的代谢紊乱。在构建工程菌株时，可以将稳定的、定量的菌株功能生物标志物(例如由工程菌株直接产生的代谢物或蛋白质)纳入菌株设计，这些生物标志物可以阐明工程菌的药代动力学和药效学，促进从临床前模型到临床研究的转化。
(3) 工程菌疗法的安全性至关重要，应采用生物遏制策略，例如在工程菌中使用营养缺陷型或杀伤开关；或是在工程菌的质粒中插入毒素基因以防止基因易位；在工程菌中设计一种质粒复制所必需的特定蛋白质也可以防止工程菌的DNA在特定菌株之外的菌株中扩增。研究人员还应该对活体生物药进行严格的安全评估，包括形态学检查、生理生化鉴定、药敏实验以及毒性试验，着重关注其对患者可能造成的短期或长期副作用以及潜在的脆弱性、致病性等。
(4) LBP疗法的药效稳定性至关重要。由于活体生物药是由活的微生物制成的这一特殊性，其药效可能受多种因素影响，包括药物剂量、运输储存条件、给药的基质类型、封装技术以及给药方式等。因此，需要进一步研究以明晰生产工艺、药物基质和储存条件等对菌株活力的影响。此外，应在不同的环境、饮食方式和给药方案下对LBP进行剂量-药效反应评估。以上药效评估是工程菌作为药物主体进行开发的过程中的必要步骤，构成药物开发的时间成本以及资金投入成本，目的是有效地提高活体生物药的药效稳定性，这是药物临床研究申请审批中的关键质量控制点。此外，应对LBP销售部门和消费者进行科学培训，在完善的药物使用指南的指导下，保证其对活体生物有一个全面准确的认知，在销售和使用过程中维持活菌数目，以最大限度地保证药效。
(5) 与其他的化学药品和生物制品相比，从临床反应来看，活体生物药的不良反应率较低，安全性较好。其安全风险主要来自以下3个方面：一是可能会引起消化道的不良反应，例如恶心、呕吐、腹痛、腹泻等；二是活体生物药的一些代谢产物可能会引起毒性反应；三是活体生物药作为一种活的细菌可能会引起感染。因此，研究人员在临床试验中应充分考虑到这些不良反应以及突发事件，并提前制定好应急方案，做好药物预警。
未来随着各种技术之间的交叉与相互渗透，活体生物药必将克服目前阻碍其发展的种种壁垒，造福于更多患者，从而进一步促进微生物学、合成生物学等生命学科的发展与应用。
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