2023, Vol. 39中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 陈佳乐, 曹秋香, 曹慧, 陈湘定, 邓云
- CHEN Jiale, CAO Qiuxiang, CAO Hui, CHEN Xiangding, DENG Yun
- 荧光转基因斑马鱼Tg (ttn.2: EGFP)的构建
- Construction of fluorescent transgenic zebrafish Tg (ttn.2: EGFP)
- 生物工程学报, 2023, 39(4): 1804-1814
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(4): 1804-1814
- 10.13345/j.cjb.220645
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文章历史
- Received: August 15, 2022
- Accepted: November 22, 2022
引用本文
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肌联蛋白(titin)是人类和所有脊椎动物中已知的最大的单链蛋白质，其分子量为3–4 MDa，表达于心肌和骨骼肌中，与粗肌丝和细肌丝构成肌肉收缩的基本单位——肌小节。Titin跨越半个肌小节，长度约为1 μm，其明带(Ⅰ-带)是一个复杂的分子弹簧，由PEVK基序[富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、缬氨酸(V)和赖氨酸(K)残基的结构基序]、免疫球蛋白(immunoglobulins, Ig)结构域以及可变N2B和N2A元素组成[1]。有研究表明，titin参与肌原纤维的组装和维持，其表达水平的降低可能还会减少肌小节的形成，在肌小节组装和心脏发育中有着关键作用[2-3]。此外，它在肌肉收缩的被动张力和信号传导中起着重要作用[4]，Mártonfalvi等[5]用力钳实验证明了titin结构域的展开与重折叠的动态过程能够产生力。Tsiros等[6]发现titin的N2A区域以钙依赖性方式结合F-肌动蛋白，其中负责结合的是I80，负责钙依赖性的是I83。titin突变与多种肌节疾病有关，包括扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy, DCM)[7]、肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy, HCM)[8]、胫骨肌营养不良(tibial muscular dystrophy, TMD)[9]、肌炎肌营养不良(muscular dystrophy with myositis, MDM)[10]和肢带型肌营养不良2J型(limb girdle muscular dystrophy type 2J, LGMD2J)[11]等。
斑马鱼(Danio rerio, zebrafish)是一种常用的模式动物，具有体外受精、体外发育、早期胚胎透明等诸多优势，常被用来研究脊椎动物组织器官的发育，以及药物高通量筛选等研究。Tol2是一种天然存在且具有转座活性的脊椎动物转座子。Kawakami等[12]通过Southern blotting杂交，发现斑马鱼基因组不包含任何Tol2相关序列，这为Tol2转座子系统在斑马鱼中的广泛应用提供了优良的基础条件。本研究使用ttn.2基因编码区上游启动子序列，构建带有绿色荧光标签的pTol2-ttn.2-EGFP转基因表达载体，通过显微共注射载体和Tol2转座酶的加帽mRNA，筛选肌肉和心脏组织特异表达绿色荧光的斑马鱼嵌合体，待性成熟后与野生型斑马鱼杂交，通过荧光观察、胚胎整体原位杂交(whole-mount in situ hybridization)和反向PCR等方法对转基因斑马鱼进行分析和鉴定，获得稳定表达荧光的转基因品系，为研究肌节疾病和探索药物治疗提供良好的实验模型。
1 材料与方法 1.1 材料斑马鱼(野生型TU品系)购自中国科学院水生生物研究所国家斑马鱼资源中心，按Westerfield[13]的方法饲养于全自动水循环养殖系统中。动物实验已通过湖南师范大学生物医学研究伦理委员会的伦理审批(批准号：2020-394)。大肠杆菌DH5α、普通质粒小提试剂盒、无内毒素质粒小提试剂盒等购自康为世纪生物科技股份有限公司；凝胶回收试剂盒购自TaKaRa公司；高保真试剂盒、转录试剂盒、RNA纯化试剂盒分别为Vazyme、赛默飞世尔科技有限公司、Qiagen公司的产品；各种限制性内切酶为NEB或TaKaRa公司的产品。各试剂均按照产品要求存放和使用。
1.2 pTol2-ttn.2-EGFP转基因表达载体的构建将Tol2kit中的pME-MCS、p3E-EGFPpA、pDestTol2pA2质粒与p5E-ttn.2质粒(由美国梅奥医学中心徐晓雷老师实验室惠赠，测序得知启动子位于9号染色体的ttn.2基因起始密码子上游6‒3 001对应的区域)按照Kwan等[14]报道的方法进行同源重组，转染DH5α感受态细胞，在氨苄培养板上挑选单克隆，提取的质粒DNA通过酶切、测序验证；获得斑马鱼ttn.2启动子驱动EGFP表达的pTol2-ttn.2-EGFP转基因表达载体。
1.3 转座酶mRNA的体外合成pCS-TP[15]质粒携带Tol2转座酶cDNA序列，使用Not Ⅰ限制性内切酶消化后，切胶回收酶切产物，然后使用mMESSAGE mMACHINE SP6转录试剂盒体外转录合成加帽mRNA。
1.4 显微注射转基因表达质粒作为外源DNA，和Tol2转座酶的加帽mRNA一起，各以60–100 ng/µL、300–1 000 ng/µL的质量浓度，约2 nL的总体积注射到1-细胞期的胚胎(约500颗)中。注射后的胚胎置于28 ℃ E3水(5 mmol/L NaCl, 0.17 mmol/L KCl, 0.33 mmol/L CaCl2, 0.33 mmol/L MgSO4)中培养，使用Leica M205 FA荧光体视显微镜检测注射后是否出现绿色荧光信号，筛选具有绿色荧光信号的阳性个体(即嵌合体)。
1.5 形态学观察培养阳性胚胎至性成熟后与野生型斑马鱼杂交，选出可稳定遗传的嵌合体斑马鱼，并将有绿色荧光信号的阳性子代个体继续培养至性成熟，再分别与野生型杂交，直到建立EGFP稳定表达的转基因斑马鱼Tg (ttn.2: EGFP)。
选取绿色荧光信号较强的转基因斑马鱼F1代与野生型杂交，将子代胚胎置于28 ℃的E3水中培养。分别在10 hpf (hours post-fertilization) (尾芽期)、16 hpf (14体节期)、24 hpf (原基-5期)、48 hpf (长-胸鳍期)、72 hpf (突口期)选取稳定表达荧光的斑马鱼胚胎，移至滴加了3%甲基纤维素(methyl cellulose)的凹面载玻片中，在全自动荧光体视显微镜(Leica M205 FA)下进行60–120倍拍照和表达分析。
1.6 探针的制备和胚胎整体原位杂交根据NCBI中斑马鱼序列(XM_021479070)设计ttn.2基因的探针引物，引物序列见表 1。以斑马鱼48 hpf发育时期的cDNA作为模板，用高保真DNA聚合酶和上述引物分别进行扩增，使用有地高辛标记混合物(DIG RNA labeling mix, Roche)的MAXIscript T7试剂盒将PCR产物转录合成地高辛标记的反义RNA探针。整体原位杂交实验按照Thisse等[16]的方法进行：胚胎经过4%多聚甲醛4 ℃固定过夜、25%–100%甲醇梯度脱水及复水、蛋白酶K消化1–45 min (根据胚胎发育时期调整消化时间)，然后经过杂交液(含3 ng/μL反义RNA探针) 65 ℃孵育过夜、50%甲酰胺漂洗后，使用酶连地高辛抗体4 ℃孵育过夜，最后加入新鲜配制的碱性磷酸酶显色液室温避光染色2–6 h。显色后将胚胎置于盛放100%甘油的陶瓷皿中，用全自动荧光体视显微镜和LAS X软件进行60–120倍的图像采集以及ttn.2表达模式的分析。
| Primer name | Nucleotide sequence (5′→3′) | Size (bp) |
| ttn.2-ISH-F | TTGAGGGAGGGAGTGTTGTC | 20 |
| ttn.2-ISH-R | GGTAATACGACTCACTATAGGGTCCTCTCCGTCCTCAATCAC | 42 |
| The sequences underlined are T7 promoter, which is used for in vitro transcription with MAXIscript T7 transcription kit. | ||
选取绿色荧光信号较强的转基因斑马鱼F1代，剪取部分尾鳍置于1.5 mL离心管中，加入100 µL组织裂解液(0.2 mol/L NaCl, 5 mmol/L EDTA, 0.1 mol/L Tris-HCl, 0.2% SDS)和1 µL蛋白酶K (10 mg/mL)，放置于65 ℃恒温箱中裂解过夜；然后用异丙醇和乙醇提取斑马鱼基因组DNA。
将基因组DNA用Hae Ⅲ限制性内切酶消化，80 ℃热失活20 min后采用乙醇沉淀法回收片段，再用T4 DNA连接酶自身环化。10倍稀释连接产物，取1 µL作为巢式PCR (引物序列见表 2)第一轮的模板，扩增Tol2转座子5′端(使用tol2-L-F1和tol2-L-R1为引物)和3′端(使用tol2-R-F1和tol2-R-R1为引物)，将第一轮PCR产物稀释100倍后使用tol2-L-F1和tol2-L-R2引物或者tol2-R-F2和tol2-R-R1引物进行第二轮PCR扩增。反向PCR产物通过1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定出有条带后，再送至生工生物工程(上海)股份有限公司分别以tol2-L-F1、tol2-R-F2引物进行Sanger测序，实验流程如图 1所示。
| Primer name | Nucleotide sequence (5′→3′) | Size (bp) |
| tol2-L-F1 | GATGCGGGAAGAGGTGTATT | 20 |
| tol2-L-R1 | TTTGAGTAGCGTGTACTGGCAT | 22 |
| tol2-L-R2 | AATACTCAAGTACAATTTTA | 20 |
| tol2-R-F1 | GAGTAAAAAGTACTTTTTTTTCT | 23 |
| tol2-R-F2 | CTCAAGTAAAGTAAAAATCCCCAAA | 25 |
| tol2-R-R1 | TTTCCCTTGCTATTACCAAACC | 22 |
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| 图 1 反向PCR示意图 Fig. 1 Diagram of inverse PCR. |
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根据对zebrafish GRCz11基因组序列BLAST结果设计整合位点检测引物F和R，各位点检测引物核苷酸序列见表 3。以基因组DNA为模板，检测引物F (N33-C4-F、N33-C11-F、N34-C1-F)分别与tol2-L-R1扩增整合位点5′端序列，检测引物R (N33-C4-R、N33-C11-R、N34-C1-R)分别与tol2-R-F1扩增3′端序列，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
| Primer name | Nucleotide sequence (5′→3′) | Size (bp) |
| N33-C4-F | AACTGGGTCTAGACGCTTAAGAT | 23 |
| N33-C4-R | ATGCCTTTTTCTTTTCTCTCTGGG | 24 |
| N33-C11-F | GGGGTTAAACTTTCCTTTGGGC | 22 |
| N33-C11-R | TGTCCCAAAAGTCCTCCGTG | 20 |
| N34-C1-F | ACGCAGGGGTCTCAAAATTACC | 22 |
| N34-C1-R | AACCTGGGGAAGTAAAAATGACA | 23 |
将p5E-ttn.2与pME-MCS、p3E-EGFPpA、pDestTol2pA2重组反应后，得到的重组质粒应含有p5E-ttn.2载体的ttn.2启动子序列、p3E-EGFPpA载体的EGFPpA序列，以及pDestTol2pA2载体的骨架，预计大小为8 058 bp。根据质粒的酶切位点分析，Stu Ⅰ限制性内切酶只在ttn.2启动子序列和EGFPpA序列中各有一个酶切位点，即在重组质粒上有2个酶切位点，适合鉴定重组载体。从琼脂糖凝胶电泳图(图 2A)可以看出，重组质粒经过Stu Ⅰ酶切后有2条条带，片段大小约为7 kb和1 kb，与预期一致。测序分析结果也表明，本研究成功地构建了pTol2-ttn.2-EGFP转基因表达载体(图 2B、2C)。
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| 图 2 pTol2-ttn.2-EGFP载体的鉴定 Fig. 2 Identification of pTol2-ttn.2-EGFP vector. A: Digestion of plasmids with Stu Ⅰ. M: DNA marker (GeneRuler DNA Ladder Mix). B: Map of pTol2-ttn.2-EGFP plasmid. C: Result of sequencing; the initiation codon of the EGFP gene is shown in black box. |
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将已构建成功的转基因表达载体pTol2-ttn.2-EGFP和Tol2转座酶的加帽mRNA共注射到1-细胞期的斑马鱼胚胎中，培养一段时间后在荧光显微镜下可以观察到部分胚胎具有绿色荧光信号(图 3A)。显微注射48 h后，成功存活了300颗胚胎，其中有247颗(82.3%)检测到肌肉组织中有绿色荧光。随后，挑选发育正常且具有荧光的阳性胚胎，培养至性成熟后与野生型斑马鱼杂交。40条阳性鱼中有5条(12.5%)与野生型杂交的后代能够检测到绿色荧光信号，这5条阳性斑马鱼即为可遗传的转基因斑马鱼(嵌合体)。图 3B、3C显示其中一条嵌合体后代胚胎(48 hpf)荧光信号的位置，可以明显观察到斑马鱼全身肌肉、心脏组织部位均有荧光，尤其体节部位肌肉组织中的荧光较强，心脏组织相对较弱。
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| 图 3 斑马鱼肌肉组织中的绿色荧光信号 Fig. 3 Green fluorescence signal in the muscle tissues of zebrafish. A: F0 embryos after injection. B–C: Left lateral view of whole body of F2 transgenic zebrafish Tg (ttn.2: EGFP) at 48 hpf. B is the fluorescence diagram, and C is the superposition of fluorescence and white light. The white arrowheads indicate the heart, and the white arrows indicate the muscle. D: Wild-type and Tg (ttn.2: EGFP) adult zebrafish. In the figure, the greens indicate transgenic zebrafish. |
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5条嵌合体斑马鱼与野生型杂交获得阳性后代比例均大于50%，最高可达74%，但同一条嵌合体的杂交后代的荧光强度不一致。本研究选取荧光信号比较一致且相对较强的后代进行培养，经过多代杂交并扩大培养，建立稳定的Tg (ttn.2: EGFP)转基因品系。对每一代后代进行观察，发现转基因斑马鱼成鱼均具有活力且可育，在形态和行为上与野生型没有明显的差异，发育和生长速度基本一致。此外，在转基因斑马鱼中发现2条F1斑马鱼及其后代都高强度表达EGFP，以至于肉眼可以明显观察到背部的绿色(图 3D)。
2.3 绿色荧光蛋白EGFP与斑马鱼内源性ttn.2的表达一致对比转基因斑马鱼Tg (ttn.2: EGFP)胚胎的绿色荧光蛋白EGFP与野生型斑马鱼胚胎内源性ttn.2基因的表达，结果显示，早期胚胎(10 hpf)在胚轴有荧光蛋白表达，原位杂交也观察到ttn.2在整个胚轴有表达(图 4A、4F)。随着胚胎的发育(16–72 hpf)，躯干和尾部逐渐出现了体节，体节内的细胞也陆续发育为生肌节，此时荧光的表达逐渐增强。在斑马鱼胚胎16–72 hpf (图 4G、4J)时期内，均能看到ttn.2在躯干和尾部的表达，V形分节明显，分节距离也随着发育逐渐增大。
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| 图 4 EGFP和内源ttn.2 mRNA在斑马鱼胚胎中的表达 Fig. 4 Expression of EGFP and endogenous ttn.2 mRNA in zebrafish embryos. A–E: EGFP patterns in the Tg (ttn.2: EGFP) fish from 10 to 72 hpf. F–J: Endogenous expression patterns in wild-type of the ttn.2 gene from 10 to 72 hpf revealed by whole-mount in situ hybridization. The black and white arrows indicate the heart. Embryos are viewed from left lateral. |
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在心脏中，荧光信号最早可在16 hpf胚胎的前侧板中胚层(anterior lateral plate mesoderm, ALPM)观察到，但原位杂交只显示ttn.2有极少量的表达(图 4B、4G)。随着胚胎发育到24 hpf，ALPM部分细胞随后迁移到中线融合形成心锥，此时心脏部位的荧光开始变得强烈，ttn.2在心脏处也表达明显(图 4C、4H)。随后，心锥管腔延长发育成线性心管，开始出现了搏动，最后环化形成心脏，这期间EGFP均有表达，但荧光弱于躯干和尾部(图 4D、4E)；原位杂交也能观察到ttn.2基因相似的表达模式(图 4I、4J)。
由上述结果可知，斑马鱼内源性ttn.2的表达主要在肌肉和心肌中表达，与骨骼肌和心脏生理功能相关，转基因斑马鱼Tg (ttn.2: EGFP)的绿色荧光蛋白EGFP同样也在肌肉和心脏中表达，它们的时空表达模式始终一致。因此，Tg (ttn.2: EGFP)转基因斑马鱼模型可以通过荧光检测，分析内源性ttn.2在肌肉和心肌中的表达水平，且可以分析药物或生理病理条件下骨骼肌和心脏形态的改变。
2.4 反向PCR鉴定整合位点及PCR验证将F1代基因组DNA的反向PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图 5。No. 7品系5′端和3′端都只有一条亮带，可能为单个转座子插入品系；No. 33和No. 34品系的5′端和3′端都至少有2条条带，可能有多个转座子插入。切胶回收较亮的条带，送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行Sanger测序。
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| 图 5 反向PCR琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 5 Agarose gel electrophoresis of inverse PCR. Red number is the successfully sequenced. M: DNA marker (generuler 100 bp plus DNA ladder). |
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根据BLAST against zebrafish GRCz11 (genomic sequence)分析各个品系的测序结果(表 4)，No. 7品系没有检测到斑马鱼基因组序列，只有质粒的序列，这可能是由于反向PCR使用的是四碱基的限制性内切酶(Hae Ⅲ)，只扩增了载体两端Tol2及其中间序列，扩增的基因组DNA片段较少，难以识别整合位点，造成了反向PCR失败。其余2个品系均检测到斑马鱼基因组序列，其中No. 33品系的转座子整合到4号和11号染色体，No. 34品系插入1号染色体上；所有品系插入的位置均在基因间区域，并且在Tol2插入的目标位点均生成不同的8 bp重复序列，且没有任何碱基偏好，详细结果见表 5。
| Band description | Max score | Total score | Query cover (%) | E value | Percent identity (%) | Accession length | Accession No. | |
| 1 | Danio rerio strain Tuebingen chromosome 4, GRCz11 Primary Assembly | 464 | 464 | 37 | 1e‒128 | 100.00 | 78 093 715 | NC_007115.7 |
| 2 | Danio rerio strain Tuebingen chromosome 11, GRCz11 Primary Assembly | 1 347 | 1 347 | 77 | 0 | 100.00 | 45 484 837 | NC_007122.7 |
| 3 | Danio rerio strain Tuebingen chromosome 11, GRCz11 Primary Assembly | 1 607 | 1 607 | 72 | 0 | 99.89 | 45 484 837 | NC_007122.7 |
| 4 | Danio rerio strain Tuebingen chromosome 1, GRCz11 Primary Assembly | 1 363 | 1 363 | 93 | 0 | 99.73 | 59 578 282 | NC_007112.7 |
| The band number corresponds to electrophoresis bands of figure 5. | ||||||||
| Line | Target sequence | Chromosome | Putative features | Accession No. |
| 33 | ACATGTTAGAAACCCACA | 4:25 364 227 | Intergenic region, between sfmbt2 and prkcq | NC_007115.7 |
| GTAATATCTCAGAGTTGC | 11:34 540 802 | Intergenic region, between pfkfb4a and zmat3 | NC_007122.7 | |
| 34 | TGCTATTTTCATTTATAA | 1:33 784 242 | Intergenic region, between ENSDARG00000106311 and LOC101886777 | NC_007112.7 |
| The 8 bp sequences underlined are duplicated on integration. | ||||
在整合位点上下游约500 bp的基因组区域设计检测引物，与Tol2序列上的2条引物来验证测序的分析结果。从检测引物的PCR结果(图 6)来看，No. 33品系的整合位点两端都扩增出条带，且是唯一的条带，跟预计片段大小一致，说明反向PCR鉴定出了No. 33的插入位置；No. 34品系只有测序成功的3′端扩增出预计的条带，5′端扩增失败。
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| 图 6 反向PCR的检测结果 Fig. 6 Detection results of inverse PCR. No. 33 inserted in chromosome 4 and chromosome 11. No. 34 inserted in chromosome 1. |
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显微注射外源质粒pTol2-ttn.2-EGFP和Tol2转座酶的加帽mRNA到斑马鱼1-细胞期胚胎中，翻译成功的转座酶蛋白识别并切下转座子DNA，并将切除的DNA整合进入胚胎基因组中。当整合反应发生在生殖系细胞时，就有可能会遗传给后代，并且产生含有新基因的稳定品系[17]。Tol2系统可用于实现长期的转基因表达并且高效转座高达11 kb的转基因载体[18-19]。有研究报道[20-21]转基因注射鱼中有50%–70%可以遗传，而本文中可遗传的只有12.5%，这可能是由于注射的载体及转座酶mRNA浓度过高导致。注射载体比报道使用的终浓度25 ng/µL至少高2倍，并且为了提高遗传效率，转座酶mRNA最高时达到了1 000 ng/μL，是文献报道的10倍。Rezaei等[22]报道了重组Tol2载体和转座酶mRNA的最佳质量浓度分别为50 ng/µL和100 ng/µL，并且胚胎质量和注入载体的数量对转座效率有着重要影响。本研究注射浓度过高导致大部分阳性斑马鱼都出现了不同程度的畸形，难以存活到性成熟，从而导致遗传比例下降。EGFP的高强度表达，使斑马鱼体表呈现肉眼可见的漂亮绿色，可能是由于ttn.2启动子具有与Rezaei等[22]报道的mylpfa启动子相似的强活性导致，但更可能的原因是插入位置的特殊性，因为出现这类F1代斑马鱼的数量较少，后续拟进一步探讨这种品系中Tol2转座子整合导致的位置效应。
在斑马鱼的肌肉和心脏中，转基因斑马鱼Tg (ttn.2: EGFP)的EGFP表达模式始终与内源性ttn.2相一致。斑马鱼中有2个与人类TTN基因高度同源的titin基因(ttn.2和ttn.1)，它们串联于9号染色体上。Seeley等[2]发现斑马鱼2个同源基因ttn.2和ttn.1的表达并不完全相同，ttn.2的2个亚型N2B和N2A在心脏中表达，而ttn.1只有N2B亚型在心脏中表达；此外，他们还发现ttn.2不同亚型的表达模式不一样，比如24 hpf之后的体节不表达N2B亚型，而N2A的mRNA信号位于肌节边缘，发育后期逐渐降低。
Kawakami等[23]发现Tol2是单个拷贝插入的，除了生成8 bp的重复，并不会在目标位点插入多个拷贝，也不会在目标位点周围引起任何的重排或突变，利用反向PCR和接头介导的PCR (linker-mediated PCR)很容易分析转座子的整合位点，BLAST分析发现大约75%的基因可以被定位到基因组上。Ivics等[24]和Sumiyama等[25]分别报道了Tol2转座子没有明显的靶位点特异性和碱基倾向性。基因测序及BLAST分析成功鉴定出No. 33品系和No. 34品系的整合位点，而No. 7品系没有找到基因组的序列，这可能是由于反向PCR使用的是四碱基内切酶(Hae Ⅲ)，扩增的DNA片段较少，难以识别整合位点。然而，鉴定成功的所有品系插入的位置都不在已知基因的内部，而是在2个基因之间的区域，这些就可能会是有功能的未知基因，也有可能是非编码区。Kotani等[26]用5′-RACE (cDNA的5′末端快速扩增)和候选外显子RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction)方法鉴定T2KSAG插入位置时，也发现80%的被捕获序列是以前未注释的转录本。Kawakami等[20]发现了已知基因(如hoxc3a)的一个未被鉴定的非编码外显子。此外，利用Southern blotting杂交检测Tol2插入的最大拷贝数目，能更准确地判断反向PCR是否检测出全部的插入位置，才能筛选获得纯合突变体，为肌肉疾病遗传研究和药物治疗提供很好的动物模型。
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