中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 王慧, 吴敬, 陈晟, 夏伟
- WANG Hui, WU Jing, CHEN Sheng, XIA Wei
- 角质酶在生物可降解聚酯聚己二酸/对苯二甲酸丁二醇酯降解中的应用
- Application of cutinase in the degradation of biodegradable polyester poly(butylene adipate-co-terephthalate)
- 生物工程学报, 2023, 39(5): 1987-1997
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(5): 1987-1997
- 10.13345/j.cjb.220819
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文章历史
- Received: October 10, 2022
- Accepted: January 26, 2023
2. 江南大学生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室, 江苏 无锡 214122;
3. 江南大学 教育部食品安全国际合作联合实验室, 江苏 无锡 214122
2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan, University, Wuxi 214122, Jiangsu, China;
3. International Join Laboratory on Food Safety, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
随着塑料制品的大规模生产,其废弃物也在环境中大量积累,其中少数可以被回收再利用,大部分通过焚烧和填埋处理,成为环境污染的重要来源之一[1]。为响应“环保”和“禁塑令”的号召,生物可降解塑料成为人们的最佳选择[2]。
聚己二酸/对苯二甲酸丁二醇酯[poly (butylene adipate-co-terephthalate), PBAT]是脂肪族芳香族共聚酯,由己二酸-丁二醇酯(butylene adipate, BA)和对苯二甲酸-丁二醇酯(butylene terephthalate, BT)缩聚而成(其具体结构式见图 1),不仅保持了芳香族聚酯的良好性能,而且由于其脂肪族成分,同时具有优异的生物降解性[3],属于热塑性生物降解塑料。与其他生物可降解聚酯相比,PBAT具有更好的延展性、断裂伸长率、耐热性和冲击性能,因此更适合广泛应用于食品包装和农业薄膜[4]。据欧洲塑料协会报道,2021年全球生物可降解塑料产量为155.6万t,其中PBAT占29.9% (约为46.46万t),在生物可降解塑料中占比最高[5]。被废弃后的生物可降解塑料只有少数在垃圾堆、土壤、淡水和海水中分解,大多数的则在自然界中废弃堆积对生态环境带来巨大威胁[6-7]。目前研究表明PBAT的生物降解通常在70%湿度和55 ℃的堆肥降解中实现,这些条件在自然环境中不易存在[8-9],缺乏在自然条件下的易降解性[10],PBAT在海水中几乎不可降解,364 d内仅减重3%[11]。开发对环境友好的生物降解技术来帮助加速其降解,可有效缓解环境压力[12]。
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图 1 PBAT化学结构式 Fig. 1 The structure of PBAT. |
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PBAT生物降解主要是通过酶水解酯键将其断裂成己二酸-丁二醇酯和对苯二甲酸-丁二醇酯,继而终被水解成1, 4-丁二醇(1, 4-butanediol, B)、己二酸(adipic acid, A)和对苯二甲酸(terephthalic acid, TPA)单体。目前,文献报道能降解聚酯的酶主要有角质酶、脂肪酶和酯酶。其中角质酶表现出最大的前景。角质酶(EC 3.1.1.74)是一种多功能酶[13],可水解角质层、可溶性酯和不溶性甘油三酯,对各种人工聚酯同样具有水解作用[14]。然而关于角质酶降解PBAT的相关报道很少,只是鉴定或表征一些对PBAT具有水解作用的酶,但降解率普遍较低,在实际应用中效果并不理想[15]。因此,加速PBAT降解提高降解速率已成为亟待解决的问题。
本研究对比了5种不同来源且对聚酯具有较好降解作用的酶对PBAT的降解效果,研究了BT含量对其降解率的影响,并优化了降解体系。结果表明PBAT共聚酯的固态结构和热性能对其生物降解性有重要影响,而这两者取决于在PBAT合成过程中BA和BT的含量[16],BT的含量越高其生物降解性越低,这有助于了解PBAT组分对其生物降解性的影响。
1 材料与方法 1.1 材料和试剂大肠杆菌(Escherichia coli) JM109、BL21(DE3)均保藏于本研究室。聚己二酸/对苯二甲酸丁二醇酯[poly (butylene adipate-co- terephthalate), PBAT]分别购于营口康辉石化有限公司[PBAT(M)]和上海麦克林生化科技有限公司[PBAT(H)];聚丁二酸丁二醇酯[poly (butylene succinate), PBS]、聚对苯二甲酸丁二醇酯(polybutylene terephthalate, PBT)购于上海麦克林生化科技有限公司;对苯二甲酸(terephthalic acid, TPA)购于Sigma-Aldrich (上海)贸易有限公司,为色谱级;蛋白胨、酵母粉购于Oxiod公司;质粒提取试剂盒购于北京Tiangen生化科技有限公司;蛋白质快速凝胶电泳试剂盒(SDS-PAGE)试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司;其他常用试剂均购于上海国药化学试剂有限公司。
1.2 培养基及缓冲液LB液体培养基(L):蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g。
LB固体培养基(L):在LB液体培养基里加入1.5%–2% (质量体积分数)的琼脂粉。
TB发酵培养基(L):蛋白胨10 g,酵母24 g,甘油5 g,K2HPO4·3H2O 16.43 g,KH2PO4 2.31 g。
磷酸盐缓冲液(phosphate buffer, PB):100 mmol/L K2HPO4用100 mmol/L KH2PO4调pH至8.0。
Tris-HCl缓冲液(Tris-HCl buffer):100 mmol/L Tris用盐酸调pH至8.0。
甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(Gly-NaOH buffer):100 mmol/L甘氨酸用100 mmol/L NaOH调pH至8.0。
柠檬酸-磷酸盐缓冲液(mcilvaine buffer):100 mmol/L磷酸氢二钠用100 mmol/L柠檬酸调pH至8.0。
镍柱结合缓冲液(binding buffer):25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),500 mmol/L NaCl。
镍柱洗脱缓冲液(elution buffer):25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),500 mmol/L NaCl,300 mmol/L咪唑。
1.3 重组质粒的构建与转化本研究选择枝叶堆肥(leaf-branch compost)宏基因组来源LCC的突变体ICCG[17-18]、白色高温双歧菌(Thermobifida alba)来源Est119[19-20]、嗜热子囊菌(Thermobifida fusca)来源TfCut[21]、大阪伊德氏杆菌(Ideonella sakaiensis) 201-F6来源Dura-PETase[22]和弯曲高温单胞菌(Thermomonospora curvata)来源Tcur0390[23]这5种聚酯降解酶进行研究。根据NCBI中ICCG氨基酸序列(USU85609)经密码子优化获得编码基因序列,后在苏州金唯智生物科技有限公司全基因合成,用全质粒的超级引物PCR检测(megaprimer PCR of whole plasmids, MEGAWHOP)方法连接至pET-24a(+)载体,构建重组质粒pET-24a(+)-ICCG。将上述PCR产物用Dpn Ⅰ在37 ℃处理2 h,以消除质粒模板,随后经热激转化至E. coli JM109,挑取单菌落测序。转入E. coli BL21(DE3),分别得到重组菌E. coli BL21(DE3)/pET24a(+)-ICCG。其他重组菌均为本实验室前期保藏[24]。
1.4 重组质粒的表达分别将重组表达基因经热激转化至E. coli BL(DE3),挑选单菌落转至液体LB中培养8–10 h;按接种量5%接入TB液体发酵培养基,37 ℃、200 r/min振荡培养2 h,在菌体浓度OD600为0.5–1.0时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)至终浓度0.1 mmol/L,25 ℃、200 r/min进行摇瓶诱导发酵24 h。
1.5 蛋白的分离纯化测量发酵结束后发酵液的菌体浓度OD600,将发酵液离心,E. coli BL21(DE3)/pET24a(+)- ICCG菌株发酵上清即为角质酶ICCG的粗酶液;其余重组菌株收集菌体,用100 mmol/L的磷酸钾缓冲液(pH 8.0)重悬菌体,保证菌体浓度OD600在20–30,高压匀浆破壁机进行破壁至菌液透明且不黏稠,离心收集破壁上清,即为TfCut、Dura-PETase、Tcur0390和Est119的粗酶液。用结合液平衡镍柱,低流速上样,依次用咪唑浓度为15、30、60、90和150 mmol/L的洗脱液除去杂蛋白,然后用洗脱液洗脱下目的蛋白。
1.6 聚酯的降解将PBS (不含BT)、PBAT(M) (BT含量适中)、PBAT(H) (BT含量高)、PBT (酸部分全部为BT)等塑料颗粒分别放入粉碎机内,倒入液氮冷却后打碎,然后过60目筛,收集筛下的颗粒。在反应瓶中分别加入200 mg的聚酯颗粒与2 mg纯化角质酶,在100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH 8.0)中混合至总反应体系为10 mL,并于60 ℃、200 r/min恒温水浴摇床反应48 h,其间使用6 mol/L NaOH每间隔12 h维持一次pH 8.0。
1.7 降解体系的优化最适温度:按1.6中的反应方法,将其置于不同温度(55–80 ℃)的水浴摇床中反应48 h,取样与甲醇稀释后进行HPLC检测,研究其最适温度。
最适缓冲液类型:在最适温度下,降解体系中缓冲体系分别为100 mmol/L、pH 8.0的不同缓冲液类型:PB缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Gly-NaOH缓冲液和mcilvaine缓冲液,将其置于水浴摇床中反应48 h,取样与甲醇稀释后进行HPLC检测,研究其最适缓冲液类型。
最适pH:在最适温度和最适缓冲液类型下,底物浓度为2%,通过HPLC测定100 mmol/L pH 5.0–9.0降解体系中生成的TPA单体的量,研究其最适pH。
最适酶/底物(enzyme to substrate, E/S):在最适温度、最适缓冲液类型和最适pH条件下,通过改变加酶量和底物浓度来研究最适E/S。
1.8 高效液相色谱(HPLC)测定降解终产物 1.8.1 高效液相色谱(HPLC)测定对苯二甲酸含量反应结束后取0.5 mL反应液,离心取上清,加入甲醇稀释后,过0.22 μm滤膜,滤液进行HPLC分析。
色谱条件:Agilent 1200 HPLC色谱仪,Agilent自动进样器,Athena C18-WP,100 Å,4.6 mm×250 mm,5 μm色谱柱,Agilent紫外检测器,检测波长为240 nm,流动相为无水甲醇和1% (质量体积分数)的乙酸水溶液按35%:65%混合,柱温设定为30 ℃,流速为0.5 mL/min。
1.8.2 高效液相色谱(HPLC)测定丁二酸含量反应结束后取0.5 mL反应液,离心取上清,加入水稀释后,过0.22 μm滤膜,滤液进行HPLC分析。
色谱条件:Agilent 1200 HPLC色谱仪,Agilent自动进样器,Aminex HPX-87H,7.8 mm× 300 mm色谱柱,Agilent视差检测器,流动相采用5 mmol/L硫酸,柱温设定为35 ℃,流速为0.6 mL/min。
1.8.3 降解率的计算通过计算产物峰面积与标准品峰面积的百分比进行定量。
PBAT降解率按以下公式计算:PBAT解聚率(%)=A/(B×C)×100。
式中,A是降解体系中释放的TPA的质量;B是用20% NaOH全降解PBAT时,确定的TPA的占比百分数;C是降解体系中PBAT量。
PBS降解率按以下公式计算:PBS解聚率(%)=D×172/118/E×100。
式中,D是产生丁二酸(S)的质量;172是PBS单体丁二酸-丁二醇酯的分子量;118是丁二酸分子量;E是反应体系中PBS的量。
2 结果与分析 2.1 不同来源聚酯降解酶的表达五种聚酯降解酶pET24a(+)-ICCG、pET24a(+)-TfCut、pET24a(+)-PETase、pET24a(+)- Est119、pET24a(+)-Tcur0390发酵表达后,收集菌体,高压匀浆破壁机破壁,离心留上清,即为粗酶液。用镍柱纯化制备纯酶,SDS-PAGE分析结果如图 2所示。角质酶ICCG、Dura-PETase、TfCut、Tcur0390、Est119预测蛋白大小分别为28.8、30.3、28.3、31.2、30.0 kDa,与蛋白条带所处位置基本一致。
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图 2 五种不同来源聚酯降解酶的SDS-PAGE分析 Fig. 2 SDS-PAGE analysis of purified protein. M: Standard molecular weight protein; 1: ICCG; 2: Dura-PETase; 3: TfCut; 4: Tcur0390; 5: Est119. |
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按1.6中所述方法,对比5种不同来源的聚酯降解酶对PBAT(H)的降解,以降解体系中释放的TPA单体为检测对象,降解结果如图 3所示,根据HPLC结果分析,在同一降解条件下,角质酶ICCG对PBAT(H)的降解效果优于其他4种酶,在48 h内降解体系中释放的TPA单体为27.30 mg,所以选择角质酶ICCG对PBAT(H)进行降解。
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图 3 五种不同来源的聚酯降解酶对PBAT(H)的降解 Fig. 3 Degradation of PBAT(H) by polyester degrading enzymes from five different origins. Each test was repeated three times in parallel, and the results were expressed as "x ± s". Bars marked with different letters are significantly different (P < 0.05). |
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从PBAT结构可知,PBAT由硬链段BT和软链段BA组成,而其生物降解性与BT有关[25]。为比较BT含量对其降解的影响,选取了4种不同的材料:不含BT的PBS、BT含量适中的PBAT(M)、BT含量较高的PBAT(H)、全部为BT的PBT。分别用20% NaOH全降解PBAT(M)和PBAT(H),确定两种PBAT中BT的含量,降解结果如图 4A所示,根据HPLC结果分析,PBAT(M)中TPA的平均质量占比为37.95%,即BT (mol): BA (mol)=1:1;PBAT(H)中TPA的平均质量占比为51.04%,即BT (mol): BA (mol)= 2:1。按1.6中所述方法,角质酶ICCG分别对PBS、PBAT(M)、PBAT(H)、PBT进行降解,降解结果如图 4B所示,HPLC结果显示,48 h内的降解速率由高到低排列分别是PBS > PBAT(M) > PBAT(H) > PBT,可见在PBAT中BT含量对PBAT的生物降解性有影响,BT含量越高,PBAT降解率越低,因此本研究选取BT含量较高降解率较低的PBAT(H)作为后续优化降解体系的底物。在图 4B中48 h时降解率没有提升,由于酶在促进PBAT(H)降解过程中产生了对苯二甲酸-丁二醇单酯[mono (4-hydroxybutyl)ester, MHBT]中间体和单体混合物,其中MHBT中间体可竞争性地结合到酶与底物的结合位点,从而抑制底物的进一步降解[26-27],2016年Barth等观察到的角质酶ICCG活性可被聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET)降解的中间产物对苯二甲酸-乙二醇单酯[mono (2-hydroxyethyl)ester, MHET]抑制,并且MHBT与MHET结构类似,所以此实验结果与Barth等的观察结果一致[28]。
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图 4 两种不同PBAT中TPA的质量占比(A)及角质酶ICCG对含有不同TPA含量的底物的降解(B) Fig. 4 Mass proportion of TPA in two different PBAT(A) and the degradation of substrates containing different TPA contents by cutinase ICCG (B). Each test was repeated three times in parallel, and the results were expressed as "x±s". Bars marked with different letters are significantly different (P < 0.05). |
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按1.7中所述方法,测定角质酶ICCG在55–80 ℃对PBAT(H)的降解效果。角质酶ICCG降解PBAT(H)释放的TPA单体在55–75 ℃条件下随温度增加逐步增高,温度超过75 ℃时体系中释放的TPA单体在逐步降低,75 ℃条件下反应液中释放的TPA单体最多,对PBAT(H)的降解效率最高,所以75 ℃为角质酶降解的最适温度(图 5)。
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图 5 反应温度对角质酶ICCG降解PBAT(H)效率的影响 Fig. 5 Effect of reaction temperature on the degradation rate of ICCG on PBAT(H). Each test was repeated three times in parallel, and the results were expressed as "x±s". Bars marked with different letters are significantly different (P < 0.05). |
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按1.7中所述方法,在75 ℃的条件下,分别测定不同缓冲液类型(100 mmol/L、pH 8.0的PB、Tris-HCl、Gly-NaOH和mcilvaine)对降解的影响。根据HPLC结果分析(图 6A),在Tris- HCl缓冲体系下降解释放的单体TPA含量最高,说明在此缓冲液下降解率最高,Tris-HCl缓冲液为最适缓冲液。
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图 6 角质酶ICCG对PBAT(H)降解的最适缓冲液类型(A)和最适pH (B) Fig. 6 The optimal buffer type (A) and pH (B) of cutinase ICCG for PBAT(H) degradation. Each test was repeated three times in parallel, and the results were expressed as "x±s". Bars marked with different letters are significantly different (P < 0.05). |
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按1.7中所述方法测定角质酶ICCG在75 ℃,Tris-HCl缓冲体系中pH在5.0–9.0的范围中对PBAT(H)的降解效率。随着pH的增高,角质酶ICCG降解PBAT(H)释放TPA单体的含量增高,降解效率提高(图 6B),当pH为9.0时,释放的TPA单体量最多,为最适pH。
2.4.4 E/S优化按1.6中反应体系测定角质酶ICCG在75 ℃,pH 9.0,Tris-HCl缓冲体系中对PBAT(H)降解的最适E/S (通过固定底物浓度为2%,改变加酶量的方式来确定最适E/S)。液相结果如图 7A所示,当E/S为0.4%、0.8%和1.0%时48 h降解体系中释放TPA单体的量几乎相同,PBAT(H)的降解速率几乎不变,所以最适E/S为0.4%。在此条件下,进行底物浓度的优化(图 7B),当体系中底物浓度小于1.0%时,PBAT的降解率基本一致;当体系中底物浓度大于1.0%时,PBAT(H)的降解率随着底物浓度的升高逐渐降低,所以本降解体系的最适底物浓度是1.0%,降解率为77.5%。
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图 7 角质酶ICCG对PBAT(H)降解的最适E/S (A)和最适底物浓度(B) Fig. 7 Optimum E/S (A) and substrate concentration (B) of cutinase ICCG for PBAT(H) degradation. Each test was repeated three times in parallel, and the results were expressed as "x±s". Bars marked with different letters are significantly different (P < 0.05). |
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虽然PBAT属于生物可降解材料,但有研究表明其在特定条件下才能达到较好的降解效果,实际应用过程中其降解情况并不理想。据报道,目前对PBAT有降解效果的酶[如来源于肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)的酯酶Cbotu_EstA和Cbotu_EstB[29];来源于高温真菌特异腐质霉(Humicola insolens)的角质酶Hic[30];来源于类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)的酯酶PpEst[31];来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)的脂肪酶B (CALB)[3]等],对PBAT的降解效果并不显著,短时间内仅对PBAT造成极小的重量损失。因此,提高酶对PBAT的降解成为目前急需解决的问题。
本研究通过对比5种不同来源的聚酯降解酶对PBAT进行降解,其中来源于枝叶堆肥(leaf-branch compost)中的角质酶LCC的突变体ICCG是降解效果最优的酶;并且通过角质酶ICCG对4种不同BT含量的材料[PBS、PBAT(M)、PBAT(H)和PBT]分别进行降解,其结果表明48 h内的降解速率由大到小排列分别是PBS > PBAT(M) > PBAT(H) > PBT,表明PBAT的生物降解速率取决于其BT的含量,BT含量越高降解速率越低,这与早前关于芳香族聚酯降解性能评估的相关研究结论相一致[32-33];最后选取了BT含量较高降解率较低的PBAT(H)作为底物,进行角质酶ICCG降解体系的优化,得出最适温度为75 ℃;最适缓冲液类型为Tris-HCl;最适pH 9.0;最适E/S=0.4%;最适底物浓度1.0%;在此最优体系下ICCG对PBAT(H)在48 h的降解率可达77.5%。
本研究为角质酶ICCG对PBAT的降解,以及BT含量对PBAT生物降解性的影响提供了实验证据,有助于实现PBAT在短时间内快速降解的目标,对PBAT生物降解技术的开发和PBAT材料的应用起到了推广作用。
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