生物工程学报  2023, Vol. 39 Issue (5): 2015-2026
http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.220945
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
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文章信息

陈阳阳, 高健, 赵夷培, 王浩, 韩旭, 张洁, 顾群, 侯颖, 刘卫东
CHEN Yangyang, GAO Jian, ZHAO Yipei, WANG Hao, HAN Xu, ZHANG Jie, GU Qun, HOU Ying, LIU Weidong
来源于嗜热氢化杆菌的新型对苯二甲酸双(羟乙)酯水解酶的表达纯化与酶学性质
Expression, purification and characterization of a novel bis (hydroxyethyl) terephthalate hydrolase from Hydrogenobacter thermophilus
生物工程学报, 2023, 39(5): 2015-2026
Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(5): 2015-2026
10.13345/j.cjb.220945

文章历史

Received: November 24, 2022
Accepted: January 19, 2023
来源于嗜热氢化杆菌的新型对苯二甲酸双(羟乙)酯水解酶的表达纯化与酶学性质
陈阳阳1,2 , 高健2,3 , 赵夷培2,4 , 王浩2,5 , 韩旭2,3 , 张洁2,3 , 顾群2,3,5 , 侯颖1 , 刘卫东1,2,3,5     
1. 河南科技大学食品与生物工程学院, 河南 洛阳 471000;
2. 中国科学院天津工业生物技术研究所 工业酶国家工程研究中心, 天津 300308;
3. 国家合成生物技术创新中心, 天津 300308;
4. 天津科技大学生物工程学院, 天津 300457;
5. 中国科学院大学, 北京 100049
摘要:石化来源的聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate, PET)被广泛用于矿泉水瓶、食品包装和纺织品等领域,因其在自然界中不易分解,大量使用后的PET废弃物造成了严重的环境污染与资源浪费。使用生物酶法对PET废弃物进行解聚,并对解聚产物进行升级循环利用是进行塑料污染治理的重要方向之一,其中关键的是PET水解酶的解聚效率。对苯二甲酸双(羟乙基)酯(bis (hydroxyethyl) terephthalate, BHET)是PET生物酶解的中间产物,其累积是限制PET水解酶催化效率的一个重要因素,BHET水解酶和PET水解酶的联用能提升PET的整体水解效率。来源于嗜热氢化杆菌(Hydrogenobacter thermophilus)的双烯内酯酶(HtBHETase)对BHET有显著水解效果,将该酶在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行重组表达并纯化后,对其酶学性质进行了研究。结果显示,HtBHETase对短碳链的酯类如对硝基苯酚乙酸酯催化活性较高,HtBHETase以BHET为底物时的最适反应pH值和最适反应温度分别为5.0和55 ℃;该酶有较好的热稳定性,经80 ℃的条件处理1 h仍能保持80%以上活性,显示出了良好的热稳定性,HtBHETase有在PET塑料生物解聚中使用的潜力,本研究为推动生物酶法降解PET提供了新的参考。
关键词对苯二甲酸双(羟乙基)酯    水解酶    表达纯化    酶学性质    
Expression, purification and characterization of a novel bis (hydroxyethyl) terephthalate hydrolase from Hydrogenobacter thermophilus
CHEN Yangyang1,2 , GAO Jian2,3 , ZHAO Yipei2,4 , WANG Hao2,5 , HAN Xu2,3 , ZHANG Jie2,3 , GU Qun2,3,5 , HOU Ying1 , LIU Weidong1,2,3,5     
1. College of Food and Bioengineering, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471000, Henan, China;
2. National Engineering Center for Industrial Enzymes, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China;
3. National Technology Innovation Center of Synthetic Biology, Tianjin 300308, China;
4. College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China;
5. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Abstract: PET (polyethylene terephthalate) is one of the most important petrochemicals that is widely used in mineral water bottles, food and beverage packaging and textile industry. Because of its stability under environmental conditions, the massive amount of PET wastes caused serious environmental pollution. The use of enzymes to depolymerize PET wastes and upcycling is one of the important directions for plastics pollution control, among which the key is the depolymerization efficiency of PET by PET hydrolase. BHET (bis(hydroxyethyl) terephthalate) is the main intermediate of PET hydrolysis, its accumulation can hinder the degradation efficiency of PET hydrolase significantly, and the synergistic use of PET hydrolase and BHET hydrolase can improve the PET hydrolysis efficiency. In this study, a dienolactone hydrolase from Hydrogenobacter thermophilus which can degrade BHET (HtBHETase) was identified. After heterologous expression in Escherichia coli and purification, the enzymatic properties of HtBHETase were studied. HtBHETase shows higher catalytic activity towards esters with short carbon chains such as p-nitrophenol acetate. The optimal pH and temperature of the reaction with BHET were 5.0 and 55 ℃, respectively. HtBHETase exhibited excellent thermostability, and retained over 80% residual activity after treatment at 80 ℃ for 1 hour. These results indicate that HtBHETase has potential in biological PET depolymerization, which may facilitate the enzymatic degradation of PET.
Keywords: bis(hydroxyethyl) terephthalate (BHET)    hydrolase    expression and purification    enzymatic properties    

合成塑料是指以各种石化来源的单体为原料通过加聚或缩合形成的高分子聚合物,聚酯类塑料聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephthalate, PET)因其应用价值成为使用最广泛的塑料之一。PET的全球年消费量已超过6 000万t,仅次于聚乙烯(polyethylene, PE)[1]。PET由对苯二甲酸(terephthalic acid, TPA)和乙二醇(ethylene glycol, EG)通过酯键缩合而成,在自然环境下难以被微生物等降解,大量塑料废弃物对生态环境造成了较严重的影响。PET塑料废弃物的回收利用根据所用方法不同可分为机械回收、化学回收和生物回收,其中机械回收法是目前最常用的回收方式,但回收产物性能降低,且难以去除污染物,导致仅能降级使用;化学法是处理过程需要有机溶剂和较高温度,且易产生副产物,导致成本较高;生物法则因反应条件温和、选择性高且绿色环保等优势成为最有潜力的方式[2-3]

近年来PET等塑料的生物降解获得越来越多的关注,许多PET塑料降解酶被筛选和鉴定出来,如酯酶(esterase)、脂肪酶(lipase)和角质酶(cutinase)[4]等。来自丝状放线菌(Thermobifida fusca)的角质酶TfH (Thermobifida fusca hydrolase)是较早报道的能降解PET塑料的酶[5];以PET塑料为主要能量和唯一碳源的PET降解菌Ideonella sakaiensis 201-F6[6]中有两个塑料解聚相关的酶,IsPETase能将PET解聚成小片段,再经过对苯二甲酸单(羟乙基)酯(monohydroxyethyl terephthalate, MHET)水解酶IsMHETase的作用,最终转化为TPA和EG单体,来源于叶枝堆肥宏基因的角质酶LCC[7]的变体可在10 h内以快速解聚非晶化PET。PET塑料生物法解聚生成的单体经回收后可用于其他产品的再合成,从而使塑料废弃物升级循环利用。近年来,PET水解酶的催化机制、结构功能关系和定向改造等方面研究愈发深入[8],已产生许多具有优异性质的突变体[9-10]。对苯二甲酸双(羟乙基)酯(bis(hydroxyethyl) terephthalate, BHET)和MHET是PET酶法解聚的主要中间体,其积累不但会抑制PET水解酶的降解效率[11-14],更会提高下游分离难度和成本。BHET水解酶可以将BHET分解为MHET和EG,再进一步水解为单体TPA和EG,对后续单体回收以及再合成有极大的帮助。来源于PET塑料降解菌Ideonella sakaiensisIsMHETase[6],来自氧化硫代单胞菌(Comamonas thiooxydans)和氢噬菌(Hydrogenophaga sp.)的MHETase类似酶[15]以及来源于海洋微生物基因组的Mle046等酶[16]均能水解MHET,产生降解单体TPA和EG。将能降解长链PET的PETase和降解短链MHET的MHETase进行组合,可以使PET酶解效率显著提高[15],这将有助于PET废弃物更有效的循环利用[17]

双烯内酯酶(dienolactone hydrolase)属于α/β水解酶家族,在蛋白质结构上与脂肪酶相似,具有保守的Cys/Ser-Asp-His三联体结构,但在底物特异性方面有较大差异,该类酶相比脂肪酶更倾向于水解链长较小的底物,因此这类酶中可能存在能对短链PET降解中间产物有降解效果的酶。在前期对PET降解酶相关工作的基础上,本研究对双烯内酯酶进行了筛选挖掘,来源于嗜热氢杆菌(Hydrogenobacter thermophilus)的HtBHETase能水解BHET,对其表达纯化后进行了酶学性质及热稳定性研究,为后续进行PET酶法解聚回收奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 材料

大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β- d-thiogalactoside, IPTG)购自北京索莱宝科技有限公司;预制聚丙烯酰胺凝胶购自金斯瑞生物科技股份有限公司;BHET (C12H14O6, Mw 254.24 g/mol, cas:959-26-2),TPA (C8H6O4, Mw 166.13 g/mol, cas:100-21-0)购自Sigma公司;对硝基苯酯及其他试剂均为国产分析纯。

1.2 质粒构建

N端带有烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus, TEV)酶切位点的HtBHETase基因序列由华大基因进行合成,并连接到pET-32a载体上,标记为pET-32a-TEV-HtBHETase。

1.3 HtBHETase序列分析

根据已知的HtBHETase氨基酸序列,使用ExPasy在线工具ProtParam (http://web.expasy. org/protparam/)预测了解HtBHETase的基本理化性质,并于NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/)上对其进行序列比对,获得其同源性序列,然后使用MEGA软件以邻接法(neighbor-joining method)构建HtBHETase系统进化树。

1.4 HtBHETase异源表达纯化

将构建好的pET-32a-TEV-HtBHETase质粒转入E. coli BL21(DE3)感受态细胞,使用LB (Luria-Bertani)培养基于37 ℃培养至OD600值为0.6–0.8,随后降温至16 ℃并添加0.3 mmol/L IPTG诱导20 h。离心收集菌体,使用含有25 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl和20 mmol/L咪唑(pH 8.0)的缓冲液重悬细胞后,在4 ℃条件下进行高压破碎。17 000×g高速离心1 h去除细胞碎片,获得的粗酶液使用快速蛋白质液相层析系统(fast protein liquid chromatography, FPLC, GE Healthcare),通过镍离子亲和层析柱(Ni-NTA)进行纯化。向纯化后的酶蛋白中加入少量的TEV酶切掉其载体的组氨酸(6×His)和硫氧还蛋白(thioredoxin, Trx)标签。透析后再经过Ni-NTA亲和层析柱进一步进行纯化,最后获得的目的蛋白经浓缩储存于25 mmol /L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,pH 8.0的缓冲液中。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)分析蛋白质的纯化情况,并用BCA试剂盒测定蛋白质浓度。浓缩后的蛋白质保存于–80 ℃。

1.5 HtBHETase对BHET的水解活性鉴定 1.5.1 水解活性初步鉴定

将商业化的片状BHET研磨成粉末,取100 mL 100 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0),加入1 g琼脂糖,微波加热至完全溶解,加入适量BHET粉末,混匀后倒成厚度约为20 mm的平板,待其凝固后即制成BHET塑料测活平板。在平板上挖出小孔并接入适量酶液,以加入等量缓冲液的孔作为空白对照,于30 ℃恒温放置,观察是否有水解圈产生。

1.5.2 BHET的水解产物分析

以高效液相色谱法确定HtBHETase的BHET水解产物。使用100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)反应缓冲液,配制1 mmol/L的BHET溶液(含20%二甲基亚砜助溶),取990 µL作为反应底物,添加10 µL酶蛋白,400 r/min反应24 h。经0.22 µm滤膜过滤后,使用配备有Welch Ultimate XB-C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 µm)的Agilent1260高效液相色谱系统(high performance liquid chromatography, HPLC)分析。柱温:30 ℃,流动相:19%的乙腈,81%甲酸水(体积比)溶液,流速:0.8 mL/min,进样量:10 µL,检测波长:254 nm。每个反应均进行3次平行实验。

1.6 HtBHETase的酶学性质研究 1.6.1 活性的测定

对硝基苯酚-标准曲线的制作,将27.62 mg对硝基苯酚溶解于100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)缓冲液中,制成2 mmol/L的母液稀释成不同浓度(0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mmol/L),测定OD410值,用缓冲液作为空白,以吸光值为纵坐标,对硝基苯酚浓度为横坐标,制作标准曲线。

活性测定:以含有不同碳链长度的对硝基苯酯异丙醇溶液为底物(100 mmol/L),包括对硝基苯酚乙酸酯(C2)、对硝基苯酚丁酸酯(C4)、对硝基苯酚辛酸酯(C8)、对硝基苯酚癸酸酯(C10)、月桂酸酯(C12),加于缓冲液反应体系中至底物浓度为1 mmol/L。反应体系所用缓冲液为100 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),反应总体积为200 µL,除空白对照加10 µL缓冲液外,样品中平行添加等量HtBHETase,参照文献[18]的方法测定对硝基苯酚含量。酶活力单位(U)定义为此反应体系中1 min产生1 µmol对硝基苯酚所需的酶量(mg)。

1.6.2 最适反应条件及热稳定性的研究

TPA标准曲线的建立:配制0.01 mol/L TPA溶液并稀释为500、100、50、10、5、1 µmol/L,参照1.5.2中高效液相色谱方法测定终产物TPA的含量,经高效液相检测后制作峰面积与浓度之间关系的标准曲线。根据TPA标准曲线计算反应体系中的最终产物浓度,所有反应均进行3次平行实验,实验结果取平均值。

最适反应pH的确定:以不同pH的缓冲液配制底物溶液,使蛋白在pH 4.0、5.0、6.0、7.0 (磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液),pH 7.0、8.0、9.0 (Tris-HCl缓冲液)的反应体系中反应48 h确定其最适反应pH值,反应温度设为50 ℃。

最适反应温度的确定:分别在30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃条件下,磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH 5.0)反应体系中,反应48 h,确定最适反应温度。

热稳定性分析:酶蛋白在不同温度(55、60、65、70、75、80、85 ℃)条件下孵育1 h,然后12 000 r/min离心10 min,反应使用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液,测定上清中残余的酶活力来分析该酶的热稳定性。

2 结果与分析 2.1 HtBHETase蛋白的理化性质及系统进化树

HtBHETase蛋白NCBI登录号为BAI70261.1,该蛋白质的理论分子量为26.4 kDa,等电点为5.21,在NCBI官网上进行BLAST比对得到其同源氨基酸序列并通过MEGA软件进行进化树分析。

进化树分析(图 1)显示,来源于嗜热氢杆菌(Hydrogenobacter thermophilus)的HtBHETase与热发状菌属(Thermocrinis)的WP_079653268.1同源性较近,与酸杆菌属(Acidobacteria)的MBN8724478.1、粘球菌属(Myxococcota)的MCL4686336.1等亲缘关系较远。上述蛋白均归属于双烯内酯酶家族(dienelactone hydrolase family, DLH superfamily),具有典型的α/β水解酶折叠类结构域和保守的催化三联体结构。

图 1 基于邻接法构建的HtBHETase系统进化树 Fig. 1 Phylogenetic tree of HtBHETase constructed based on the neighbor-joining method.
2.2 HtBHETase的重组表达纯化

HtBHETase经诱导表达后,收集菌体进行破碎,离心后即得到粗酶液,之后通过镍离子亲和层析柱进行纯化。收集第1步纯化后较纯的部分,使用TEV酶切下标签,再进行第2步层析纯化使标签与蛋白分离。纯化后的HtBHETase利用SDS-PAGE进行分析(图 2),浓缩后用于后续研究。

图 2 HtBHETase纯化后的SDS-PAGE分析 Fig. 2 SDS-PAGE analysis of purified HtBHETase. S: Unpurified protein; M: Protein molecular weight standards; Pure: The purified protein.

按照Bradford法测定蛋白浓度,并以对硝基苯丁酸酯为底物分别测定粗酶液与纯酶的活力,经计算得到整个纯化过程的回收率为63.3%,纯化倍数为64 (表 1)。

表 1 HtBHETase的纯化结果 Table 1 Purification of HtBHETase
Protein (mg) Specific activity (U/mg) Total activity (U) Rate of recovery (%) Purification fold
Crude extract 2 915.129 0.041 120.686 100.0 1
Pure enzyme 28.860 2.650 76.479 63.3 64
2.3 BHET水解活性初步鉴定结果

将添加了HtBHETase的BHET琼脂平板在30 ℃放置10 h后,使用全自动数码凝胶成像分析系统进行拍摄。如图 3所示,添加HtBHETase (1号)出现了明显的水解圈,其直径约为1.4 cm,可初步确定HtBHETase的BHET水解活性。

图 3 添加HtBHETase后的BHET琼脂平板 Fig. 3 BHET-agar plates after adding HtBHETase. 1:添加HtBHETase. 2:空白对照 1: Adding HtBHETase; 2: Blank control.

BHET的水解过程如图 4所示,过程中产生MHET、EG,最终产生TPA。

图 4 BHET的水解反应示意图 Fig. 4 Schematic illustration of the hydrolysis products of BHET. BHET: Bis(hydroxyethyl) terephthalate; MHET: Monohydroxyethyl terephthalate; TPA: Terephthalic acid.

对高效液相色谱结果(图 5)进行分析,TPA标准品在相同检测条件下的保留时间为9.5 min,因此判断实验组9.5 min附近流出的物质为TPA。对照组未加酶进行反应,因而在18.6 min时流出BHET,而实验组已将BHET消耗完毕,由于MHET未得到纯品,因此使用液相色谱-固相萃取-核磁共振/高分辨质谱联用仪(LC-SPE-NMR/MS)对保留时间在13.9 min的物质进行鉴定,根据质谱结果(图 6)判断为MHET (m/z, 209, [M-H])。

图 5 使用HPLC对BHET降解产物进行鉴定 Fig. 5 Analysis of BHET hydrolysates by HPLC. BHET: Bis(hydroxyethyl) terephthalate; MHET: Monohydroxyethyl terephthalate; TPA: Terephthalic acid.
图 6 MHET的质谱鉴定 Fig. 6 Mass spectrometric identification of MHET.
2.4 HtBHETase的酶学性质研究 2.4.1 酯酶活性表征

以对硝基苯酚乙酸酯(C2)、对硝基苯酚丁酸酯(C4)、对硝基苯酚辛酸酯(C8)、对硝基苯酚癸酸酯(C10)和月桂酸酯(C12)为底物,测定HtBHETase在30 ℃、Tris-HCl (pH 8.0)条件下对不同底物的水解活力,结果如图 7所示。可知HtBHETase对乙酸酯的活力最高,以对硝基苯酚乙酸酯为底物的活力为5.83 U/mg,而以月桂酸酯为底物的活力仅为0.077 U/mg。结果表明,HtBHETase对碳链长度较短的底物催化活性较高,最适反应底物为对硝基苯酚乙酸酯。

图 7 HtBHETase对不同碳链长度的对硝基苯酯的活性表征 Fig. 7 Characterization of HtBHETase activity toward p-nitrophenyl esters with different carbon chain lengths.
2.4.2 最适反应条件及热稳定性分析

50 ℃时,不同pH对HtBHETase的活性影响如图 8所示。在较低pH如4.0时,HtBHETase几乎没有活性,当pH值为5.0时,该酶的活性达到最高。当pH值升高至9.0左右时蛋白仍有一半残余活性。不同缓冲液对酶的活性也有影响,如同样在pH 7.0时,在Tris-HCl缓冲液中该酶的活性比在磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中的略高,这可能是缓冲液中的离子成分的差异造成的。

图 8 pH对HtBHETase催化活性的影响 Fig. 8 Effect of pH on HtBHETase activities.

HtBHETase在不同温度的反应体系中反应48 h得到如图 9的实验结果。随着反应温度的升高,酶的活性逐渐增强,当温度为55 ℃时,酶活性最高。随着温度继续升高,酶的活性迅速降低,当温度为70 ℃时,HtBHETase的活性仅为最高活性的三分之一左右。由此可确定,以BHET为底物,HtBHETase的最适反应pH为5.0,最适反应温度为55 ℃。

图 9 温度对HtBHETase催化活性的影响 Fig. 9 Effect of temperature on HtBHETase activities.

HtBHETase经不同温度(55–85 ℃)热处理1 h后,其活力变化结果如图 10所示。因为55 ℃为酶的最适反应温度,因此以55 ℃处理后的酶活力为100%。由图可知,HtBHETase经55–70 ℃处理1 h仍有90%以上的酶活力。于80 ℃处理1 h后,酶的活力仍能保持约80%。但当处理温度高于80 ℃之后,酶活力迅速降低。于85 ℃处理1 h后酶活力仅为30%,此时的该酶已丧失大部分活性。由此可知HtBHETase在80 ℃以下具有良好的热稳定性。

图 10 HtBHETase的温度稳定性 Fig. 10 Temperature stability of HtBHETase.
3 讨论

近年来已有部分科研人员针对BHET的水解酶进行了相关研究。Qiu等[19]从塑料垃圾中分离出一株可以水解BHET最终产生TPA的菌株,经鉴定确定为肠杆菌属,并克隆表达了胞外分泌的酯酶EstB。此酶可将BHET转化为MHET。酶学性质研究发现其最适pH为8.0,最适温度为40 ℃,但在50 ℃条件下1 h即损失大半活性。Yoshida等[6]在鉴定酶蛋白ISF6_4831的PET水解活性时发现在30 ℃条件下其能继续将BHET完全转化,有利于PET的水解,产物主要为MHET。有研究同时探究了叶和枝堆肥角质酶(LCC)对PET和BHET的活性,发现其对BHET最适反应温度为50 ℃,且能完全降解生成TPA[20-21]

PET酶解过程中温度的提升有助于加快PET的降解速率[22],而PET解聚反应过程中不断产生的TPA则会使体系中的酸性逐渐增强。这些因素都对酶法降解PET提出了更高的要求。耐热、适酸酶蛋白的发掘对进一步推动酶法降解PET具有重要价值。目前,关于BHET水解酶的性质研究还比较少,且不够深入。Qiu等[19]整理了近些年已报道过的一些具有水解BHET能力的酶以及它们的来源与反应条件等信息,如表 2所示。与它们的反应条件相比,HtBHETase显示出突出的酸性环境高活性和良好的热稳定性,这些特性将有利于其在PET酶促降解过程中发挥作用。

表 2 BHET水解酶来源和反应条件[19] Table 2 Source and reaction conditions of BHET hydrolase[19]
Enzyme Accession No. Temperature (℃) pH Strains References
IsPETase GAP3837 3.1 30 7.0 Ideonella sakaiensis 201-F6 [6]
TfH WP_011291330.1 30 7.0 Thermobifida fusca [6, 22]
FsC K02640 30 7.0 Fusarium solani pisi [6]
LCC AEV21261.1 30 7.0 Leaf-branch compost metagenome [6, 20]
HiC ABC06408.1 70 7.0 Humicola insolens [6, 23]
EstB MK681857 40 8.0 Enterobacter sp. HY1 [6, 24]
BsEstB ADH43200.1 40 7.0 Bacillus subtilis 4P3-11 [6]
HtBHETase BAI70261.1 55 5.0 Hydrogenobacter thermophilus This study
4 结论

本研究获得了一个新型的BHET的水解酶HtBHETase,经过重组表达纯化后得到了纯度较高的酶。进行酶学性质研究发现,该酶对短链的酯类如对硝基苯酚乙酸酯的催化活性较高。该酶可以将BHET水解最终产生TPA,最适反应pH为5.0,最适反应温度为55 ℃,并具有良好的耐热性,经80 ℃的条件处理1 h仍能保持80%以上酶活力,耐热性及耐酸性有利于HtBHETase在PET降解回收利用方面的应用。后续将通过对HtBHETase的蛋白质结构的解析来进一步系统揭示其水解BHET的催化机制和构效关系,并以此为依据开展工业方向的适用性改造。

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