生物工程学报  2023, Vol. 39 Issue (5): 2027-2039
http://dx.doi.org/10.13345/j.cjb.220991
中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
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文章信息

张洁, 单瑞达, 李霞, 曾志雄, 孙登岳
ZHANG Jie, SHAN Ruida, LI Xia, ZENG Zhixiong, SUN Dengyue
来源于糖丝菌双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯水解酶的酶学性质表征及降解特性分析
Enzymatic properties and degradation characterization of a bis(2-hydroxyethyl) terephthalate hydrolase from Saccharothrix sp.
生物工程学报, 2023, 39(5): 2027-2039
Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(5): 2027-2039
10.13345/j.cjb.220991

文章历史

Received: December 10, 2022
Accepted: February 6, 2023
Published: February 17, 2023
来源于糖丝菌双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯水解酶的酶学性质表征及降解特性分析
张洁1 , 单瑞达1 , 李霞1,2 , 曾志雄1 , 孙登岳1,2     
1. 齐鲁工业大学(山东省科学院)生物工程学院, 山东 济南 250000;
2. 齐鲁工业大学(山东省科学院)生物基材料与绿色造纸国家重点实验室, 山东 济南 250000
摘要:聚对苯二甲酸乙二醇酯[poly(ethylene terephthalate), PET]降解酶的发掘是国内外研究的热点。双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯[bis-(2-hydroxyethyl) terephthalic acid, BHET]是PET降解过程的一种中间化合物,会与PET竞争酶的底物结合位点,从而抑制PET进一步降解。因此,探寻新型BHET降解酶,对进一步提高PET的降解效率具有促进作用。本研究通过基因挖掘发现了一种来源于浅黄糖丝菌(Saccharothrix luteola)参与PET降解过程的水解酶基因sle (ID: CP064192.1, 5085270–5086049),其编码的蛋白质可以将BHET水解为单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯[mono-(2-hydroxyethyl) terephthalate, MHET]和对苯二甲酸(terephthalic acid, TPA)。将BHET水解酶(Sle)通过重组质粒在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达,结果表明,在异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)诱导终浓度为0.4 mmol/L,诱导时长为12 h,诱导温度为20 ℃时蛋白的表达量最高。通过镍亲和层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析3步分离纯化,获得了高纯度的Sle重组蛋白;同时对其酶学性质进行了表征,Sle最适温度和pH分别为35 ℃和8.0,在25–35 ℃和pH 7.0–9.0区间内能保持80%以上的残余酶活,且金属离子Co2+能提高酶活力;进一步通过同源序列及Sle复合物结构分析得知,该酶属于二烯酸内酯水解酶(dienelactone hydrolase, DLH)家族,具备该家族典型的催化三联体,预测其催化位点分别为S129、D175和H207,并初步分析了其催化机理。最后,利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)鉴定了该酶能够特异性降解BHET生成MHET和TPA,属于BHET降解酶。本研究为生物酶法高效降解PET塑料提供了新的酶资源。
关键词聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)    双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯(BHET)降解酶    分离纯化    酶学性质    
Enzymatic properties and degradation characterization of a bis(2-hydroxyethyl) terephthalate hydrolase from Saccharothrix sp.
ZHANG Jie1 , SHAN Ruida1 , LI Xia1,2 , ZENG Zhixiong1 , SUN Dengyue1,2     
1. School of Biological Engineering, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Ji'nan 250000, Shandong, China;
2. State Key Laboratory of Bio-based Materials and Green Papermaking, Qilu University of Technology (Shandong Academy of Sciences), Ji'nan 250000, Shandong, China
Abstract: The discovery of new enzymes for poly(ethylene terephthalate) (PET) degradation has been a hot topic of research globally. Bis-(2-hydroxyethyl) terephthalate (BHET) is an intermediate compound in the degradation of PET and competes with PET for the substrate binding site of the PET-degrading enzyme, thereby inhibiting further degradation of PET. Discovery of new BHET degradation enzymes may contribute to improving the degradation efficiency of PET. In this paper, we discovered a hydrolase gene sle (ID: CP064192.1, 5085270–5086049) from Saccharothrix luteola, which can hydrolyze BHET into mono-(2-hydroxyethyl) terephthalate (MHET) and terephthalic acid (TPA). BHET hydrolase (Sle) was heterologously expressed in Escherichia coli using a recombinant plasmid, and the highest protein expression was achieved at a final concentration of 0.4 mmol/L of isopropyl-β-d-thiogalactoside (IPTG), an induction duration of 12 h and an induction temperature of 20 ℃. The recombinant Sle was purified by nickel affinity chromatography, anion exchange chromatography, and gel filtration chromatography, and its enzymatic properties were also characterized. The optimum temperature and pH of Sle were 35 ℃ and 8.0, and more than 80% of the enzyme activity could be maintained in the range of 25–35 ℃ and pH 7.0–9.0 and Co2+ could improve the enzyme activity. Sle belongs to the dienelactone hydrolase (DLH) superfamily and possesses the typical catalytic triad of the family, and the predicted catalytic sites are S129, D175, and H207. Finally, the enzyme was identified as a BHET degrading enzyme by high performance liquid chromatography (HPLC). This study provides a new enzyme resource for the efficient enzymatic degradation of PET plastics.
Keywords: poly(ethylene terephthalate) (PET)    bis-(2-hydroxyethyl) terephthalate (BHET) degrading enzyme    isolation and purification    enzymatic properties    

聚对苯二甲酸乙二醇酯[poly(ethylene terephthalate), PET]是生产生活中最常用的合成聚合物之一,特别在包装和纺织领域[1]。它是以石油为原料,由对苯二甲酸(terephthalic acid, TPA)和乙二醇(ethylene glycol, EG)通过酯化反应生成双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯[bis-(2-hydroxyethyl) terephthalic acid, BHET],BHET进一步缩聚生成的合成PET聚酯[2-3]。因为PET合成方式简单,产品结实耐用并且生产成本较低,因此PET被广泛应用于工业化生产。然而,由于废弃PET自身具有化学惰性和抗自然退化的特点[4],因此,很难自身分解,给全球环境带来严重的威胁[5-7]

目前,PET的常规处理方法具有很大的局限性,其处理产生的污染物会对全球环境带来二次伤害且造成巨大的能源损耗。近年来,随着生物技术的巨大进步,使得微生物酶法降解在治理环境污染方面成了首选的策略[8],微生物酶法降解PET的一大优势就是作用条件简单,降解产物为小分子对环境无害且可重复加工[9]。已有研究表明,从微生物中分离出的聚酯水解酶可以将PET酶解为BHET、单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯[mono-(2-hydroxyethyl) terephthalate, MHET]、EG和TPA等组分,而得到的这些单体可进一步被生产利用,从而实现PET可持续回收利用[10]。因此,在未来使用微生物酶法降解PET必将成为学者研究的新热点[11]

与纤维素酶水解纤维素生成产物纤维素二糖和葡萄糖对纤维素酶活性有抑制作用相类似[12],PET的酶解产物BHET和MHET同样能够竞争性地抑制PET水解酶降解PET的能力[13]。因此,减少这种抑制作用对促进PET的降解具有重要的作用。Qiu等[14]分离了具有BHET降解能力的微生物,克隆并表达了相应的酯酶,并对其酶学性质进行了研究。验证了该BHET水解酶是通过水解BHET一个酯键为MHET,再将MHET水解为单体TPA来降解底物BHET的,进而有效地缓解抑制作用,提高PET水解酶的催化效率。由此可见,利用BHET水解酶与PET水解酶形成双酶催化系统,可以为PET的降解提供了一种有前景的替代方法[14]

在本文中,我们研究了一种来源于浅黄糖丝菌(Saccharothrix luteola)的新的水解酶基因sle。通过对sle基因进行载体构建、诱导表达和分离纯化,表征了其酶学性质。通过同源建模和分子对接技术预测了该酶的催化活性位点,为后续酶工程改造创造了条件。此外,经过高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)分析,证明了Sle是一种BHET水解酶,能够在一定条件下特异性地水解BHET生成MHET和TPA。因此,在未来,这种新型的水解酶将有可能被设计用来降解塑料和在塑料降解酶的基础上促进塑料单体的生成[13, 15]

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒和菌株

大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α和BL21(DE3),均购自南京诺唯赞生物科技有限公司;pET-28a(+)载体由本实验室保存。

1.1.2 主要试剂

质粒小量提取试剂盒、DNA胶纯化回收试剂盒,购自Omega公司;限制性内切酶、T4 DNA连接酶,购自宝生物工程(大连)有限公司;IPTG、卡那霉素,购自生工生物工程(上海)股份有限公司;离子交换柱、凝胶过滤柱,购自GE公司;10 kDa超滤管,购自Millipore公司;MHET、BHET和TPA,购自Sigma公司;其他的试剂均为分析纯试剂,购自国药集团有限公司。

1.1.3 主要缓冲液

裂解缓冲液(lysis buffer):400 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),10% (体积分数)甘油。

清洗缓冲液(wash buffer):400 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),10% (体积分数)甘油,20 mmol/L咪唑。

洗脱缓冲液(elution buffer):400 mmol/L NaCl,50 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),10% (体积分数)甘油,300 mmol/L咪唑。

起始缓冲液:20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)。

分子筛缓冲液:20 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),150 mmol/L NaCl,1 mmol/L DTT。

1.2 方法 1.2.1 Sle表达载体的构建

编码水解酶Sle的序列由金唯智生物科技有限公司优化合成。以该序列为模板设计引物。上游引物:5′-GAGGAGGAGTTCCGGCGC-3′,下游引物:5′-GACCGAGTGCGGACAGGTG-3′。其中上游引物含有BamH Ⅰ酶切位点(GGATCC),下游引物含Hind Ⅲ酶切位点(AAGCTT)。通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增目的片段,PCR扩增体系为50 μL。程序为:98 ℃预变性30 s;98 ℃变性10 s,54 ℃退火15 s,72 ℃延伸5 s,共30个循环;72 ℃再延伸10 min。将得到的目的片段和空载体pET-28a(+)用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ进行双酶切,双酶切产物经胶回收试剂盒纯化回收,酶切后的片段与酶切后的载体,用T4 DNA连接酶连接后,转化至E. coli DH5α中。挑单菌落后提质粒,双酶切验证阳性克隆,最后测序验证并检查有无突变或移码。

1.2.2 重组蛋白的诱导表达及分离纯化

将测序正确的重组质粒转化到E. coli BL21 (DE3)感受态细胞中,划菌接种到终浓度为50 μg/mL卡那霉素的种子液中生长过夜,温度为37 ℃ [16]。将种子液以1%的比例接种到1 000 mL的培养基中,在相同条件下培养。当600 nm光密度达到0.7左右时,冰浴10 min,后加入终浓度为0.4 mmol/L的IPTG进行诱导表达。在20 ℃孵育12 h后,4 000 r/min、4 ℃离心15 min获得细胞[17]。pET-28a(+)-Sle重组细胞用裂解缓冲液进行重悬,加入80 µL 50 mg/mL的溶菌酶,40 µL 1 mol/L的苯甲基磺酰氟(phenyl methane sulfonyl fluoride, PMSF) 和10 µL β-巯基乙醇混匀。孵育20 min,打开高压细胞破碎仪预冷,随后在低温条件下破碎细胞,破碎条件设为750 Pa左右,4 min (视破碎情况调节),直至菌液清澈且不粘稠。4 ℃、13 000 r/min离心1 h去除细胞碎片。用Ni-NTA亲和层析柱纯化带有His标签的目标蛋白,将上清液与裂解缓冲液环境中的Ni-NTA agarose树脂填料进行混合,静音混合器上4 ℃温育1 h左右[18]

随后,将结合有蛋白的填料加入12 mL的一次性层析柱中,再用2个柱体积(column volume, CV)清洗缓冲液清洗杂蛋白,最后用定量的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。收集到的Sle蛋白经过起始缓冲液稀释,得到低盐浓度的蛋白液,离心过膜后,使用阴离子交换柱进行梯度洗脱,取出峰处蛋白用超滤管进行浓缩后,通过分子筛缓冲液进行凝胶过滤层析。最后,将纯化后的蛋白保存在4 ℃直到进一步分析。总蛋白浓度采用BCA检测试剂盒(Solarbio)测定。通过考马斯亮蓝染色,SDS-PAGE分析目标蛋白的浓度和纯度[19]

1.2.3 酶活性测定

利用Palm等[20]报道的利用高效液相色谱法测定酶活性的方法。采用终浓度分别为0.1 mmol/L BHET、0.4 mg/mL酶浓度和100 mmol/L Tris- HCl缓冲液(pH 7.0)的反应体系进行催化,温度35 ℃,反应3 h。3 h后取出放置100 ℃开水中煮沸10 min终止反应。所有实验组进行3个重复,空白组除不加酶外,其余的条件都相同。

1.2.4 Sle最适反应温度和热稳定性

最适温度测定:在25–60 ℃的范围内,测定蛋白的酶活,将最高的酶活设置为100%。

热稳定性测定:将稀释后的Sle酶液置于25–60 ℃条件下保温0.5、1、2 h,再冰浴10 min,离心除去沉淀,按照1.2.3方法进行酶活性测定,以4 ℃的酶活设置为100%。

1.2.5 Sle最适反应pH和pH稳定性

最适反应pH测定:以100 mmol/L的MES (pH 5.5–6.5)、磷酸盐(pH 6.0–8.0)、Tris (pH 7.0–9.0)、HEPES (pH 7.0–9.5)、甘氨酸(pH 8.0–9.5)缓冲溶液取代100 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0),以酶活最高者为100%。

pH稳定性测定:用上述不同pH的缓冲液稀释酶液至合适浓度,在4 ℃下孵育1 h,测定残余酶活,以酶活最高者为100%。

1.2.6 金属离子对Sle酶催化活性影响

在5 mmol/L MgCl2、CuCl2、BaCl2、FeCl3、CoCl2、NiSO4、ZnCl2、AlCl3、MnSO4、CaCl2盐溶液存在的条件下,测试不同金属离子对重组Sle催化活性的影响。酶活性测定在pH 8.0和35 ℃条件下进行。一个不添加任何金属离子的反应被用作实验的阳性对照。

1.2.7 底物选择性分析

将重组蛋白Sle与不同底物如PET、BHET和MHET进行催化反应,以终产物TPA含量来计算酶活,测试Sle对底物的催化选择性。为促进底物的溶解度,反应在含有10%的二甲基亚砜的反应体系中进行,其他条件与上述反应方法一致,酶活最高者为100%。

1.2.8 Sle的催化产物分析

采用岛津HPLC进行的产物分析,将灭活的反应液以12 000 r/min转速离心10 min后,0.22 μm滤膜过滤,进行色谱分析。色谱条件:岛津自动进样器,C18柱,岛津紫外检测器,流速为0.5 mL/min,采用60% (体积分数)的50 mmol/L磷酸二氢钾水溶液和40%的甲醇溶液作为流动相,柱温设定为35 ℃。在240 nm波长处检测TPA、MHET和BHET,并通过标准曲线实现定量,最终以产物MHET和TPA的总量来计算酶活。

1.2.9 同源建模及分子对接

从NCBI数据库中搜索Sle的氨基酸序列,上传至同源建模网站SWISS-MODEL中,得到给定氨基酸序列的蛋白质三维结构预测结果如:1jfr、7W66和7nei,对其进行质量评估,最终选择最佳三维结构作为目标模型[21]。同时从PubChem数据库中下载底物小分子BHET的三维结构,保存为SDF格式,用OpenBabel软件转换为PDB格式。利用Auto-Dock-Vina工具对受体和配体进行pdbqt格式转换、加氢和计算电荷预处理,为后续对接做准备。对接时,首先找到BHET对接位点,将蛋白的活性中心设置为中心坐标,使网格区域将可能活性区域覆盖,构象搜索策略采用拉马克遗传算法,初始种群数目设置为150,对接次数设置为100,能量评定最大次数设置为25 000 000,其余参数选择默认值。最后使用Pymol软件对配体对接方式和关键作用残基结果进行分析。

2 结果与分析 2.1 pET-28a(+)-Sle重组质粒的验证

将挑取的单菌落先利用菌落PCR进行验证,得到了一条0.8 kb左右的条带,与目的基因的大小一致(图 1A);然后利用限制性内切酶BamH Ⅰ和Hind Ⅲ对转化子进行双酶切,由图 1B可知,得到两条大小分别为0.8 kb和5.3 kb的清晰条带,与预期结果一致;且将该转化子送测序公司验证序列正确,Sle重组质粒构建成功。

图 1 菌落PCR (A)和酶切验证(B) Fig. 1 Colony PCR and enzyme digestion of pET-28a(+)-Sle. A: Colony PCR. 1: DNA marker; 2–3: Colony PCR. B: Enzyme digestion of pET-28a(+)-Sle. 1: DNA marker; 4–5: Double enzyme digestion.
2.2 Sle诱导表达条件优化

对Sle重组蛋白的最佳诱导表达条件进行探究,在不同诱导温度(16、20、37 ℃)、不同诱导剂IPTG的浓度(0.2、0.4、0.6 mmol/L),不同诱导时间(10、12、14 h)的条件下表达蛋白,测定上清液中可溶性蛋白的浓度,再稀释上清液为同一蛋白浓度通过Image lab灰度分析SDS-PAGE图,得出目标蛋白的浓度。由图 2可知,在温度20 ℃和0.4 mmol/L的IPTG浓度下诱导12 h的条件下,上清液中目的蛋白浓度最高为0.46 mg/mL。由此可见,高温、高诱导剂浓度和长时间诱导,并不能提高可溶性蛋白的表达量。因为蛋白质分子是三维结构型,在高温条件和高诱导剂条件下,氨基酸链易生成速度过快,导致没有充足的时间进行盘曲折叠,最后形成没有活性的包涵体。因此,合适的诱导剂浓度、中低温度和诱导时间等诱导条件对蛋白质的正确折叠和可溶性表达至关重要。

图 2 不同诱导条件下可溶性蛋白的浓度 Fig. 2 The concentration of soluble Sle under different induction conditions. 1–3: 16 ℃ (0.2 mmol/L, 0.4 mmol/L, 0.6 mmol/L); 4–6: 20 ℃ (0.2 mmol/L, 0.4 mmol/L, 0.6 mmol/L); 7–9: 37 ℃ (0.2 mmol/L, 0.4 mmol/L, 0.6 mmol/L).
2.3 Sle表达菌株的分离纯化

pET-28a(+)-Sle重组蛋白经Ni-NTA亲和色谱柱纯化后SDS-PAGE结果如图 3A所示,由图可见,目标蛋白可以进行可溶性表达,但是也有部分目标蛋白错误地折叠以包涵体的形式存在,目的蛋白溶出条带大小在25 kDa和35 kDa之间有明显表达,与预测值(27.8 kDa)基本一致。之后对蛋白进行了精制,分别利用阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱进行纯化,结果如图 3B3C所示。通过阴离子交换层析纯化,得到了纯度较高的Sle蛋白,后续浓缩的过程中,仍有杂蛋白。因此,在阴离子交换层析纯化的基础上继续利用凝胶过滤层析进行纯化,结果如图 3C所示,经过SDS-PAGE分析,获得了高纯度的目标蛋白,进而以此蛋白进行酶学性质表征测定以及催化实验。

图 3 纯化的Sle的SDS-PAGE凝胶电泳分析 Fig. 3 SDS-PAGE gel electrophoresis analysis of purified Sle. A: Ni column chromatography. 1: Sonication; 2: Supernatant; 3: Sediment; 4: Flow-through; 5: Lysis buffer; 6: Wash buffer; 7: Standard marker; 8–10: Elution buffer. B: Purification of Sle by ion exchange using SOURCE Q column. C: Purification of Sle by gel filtration using a Superdex 200 Increase 10/300 column.
2.4 Sle序列进化树及三维结构催化活性中心形成机制

系统进化树分析显示sle基因编码蛋白质序列与已经报道的来自肠杆菌Enterobacter sp.的BHET水解酶(MK681857.1)的同源性只有15.61%,与链霉菌Streptomyces sp. HB132的水解酶(WP_239580210.1)和糖丝菌Saccharothrix sp.的水解酶(WP_230570991.1)的保守性分别为77.13%和91.92% (图 4A)。

图 4 Sle进化树分析(A)和复合物结构(B)活性中心示意图(C) Fig. 4 Structural analysis of the Sle-substrate complex model. A: Phylogenetic analysis of Sle. B: Sle complex structure model. C: Schematic diagram of the active center, the catalytic triad center (S129, D175, H207) and BHET are colored as green sticks and yellow sticks, respectively.

通过SWISS-MODEL筛选出与Sle的序列同源性为76.08%,全局模型质量估测值(global model quality estimate, GMQE)为0.87和QMEANDisCo全局分数为–0.3的来源于脱叶链霉菌(Streptomyces exfoliatus)的脂肪酶SeL (PDB: 1jfr)的晶体结构,以此为模板进行同源建模后再进行分子对接,对接结果表明配体BHET小分子能够结合到Sle的催化三联体中心上方的一个宽而浅的疏水口袋,对接时的结合能为–28.40 kJ/mol,结合自由能为–12.38 kJ/mol,对接能为–34.95 kJ/mol,Sle的复合物结构如图 4B所示。Sle蛋白结构由9个α螺旋、9个β链和多个环区组成。三维结构分析显示,与其他蛋白酶如脂肪酶具有的“盖子”结构相比,该酶具有典型的α/β-水解酶折叠类结构域和催化三联体,Sle序列中存在G-H-S-M-G基序。活性位点由残基S129、D175和H207组成(图 4C)。

为进一步探索Sle酶对BHET的催化机制,我们对其相互作用进行了分析,BHET上羰基O原子与Sle酶的S129羟基形成一个氢键,键长为2.3 Å,Y91、M130和W154构成氧阴离子口袋,S129作为亲核试剂和H207、D175形成电荷中继网络[22]。此外,Sle水解酶具有保守的分子内二硫键(C240–C256),连接了Sle蛋白C末端和最后一个loop环,距离催化活性中心较远,因此,其不直接影响酶活性,但与酶结构的完整性相关,影响结构的稳定性。通过结构分析,提出了Sle水解酶的催化中心形成机制,这也为进一步酶的定向修饰和应用奠定了良好的基础。

2.5 酶学性质表征 2.5.1 温度对Sle活性和稳定性的影响

以BHET为底物,按上述方法对Sle在25–60 ℃条件下的生化性质进行了表征探究。由图 5A可见,Sle在35 ℃显示最高酶活且能在25–35 ℃保持80%以上的相对酶活,随着温度的升高,酶活性不断下降,当温度达到60 ℃,残余酶活只有23.42%。

图 5 温度对Sle酶活和热稳定性的影响 Fig. 5 Effect of temperature on Sle enzyme activity and thermal stability. A: The effect of temperature on activity of Sle. B: Thermostability of Sle.

此外,该酶在35 ℃以下孵育2 h,残余酶活仍有80%。在25–35 ℃之间保温2 h内,出现热激活现象,残留酶活高于初始酶活,之后酶活随着温度和保温时间的升高而下降。当温度升到55 ℃,只有不到20%的残余酶活(图 5B)。结果表明,Sle应属于中低温的酶。

2.5.2 pH对Sle活性和稳定性的影响

按照1.2.5描述的方法测定Sle重组酶在不同pH缓冲液体系中的残余酶活。由图 6A可见,在碱性环境下,该酶活性普遍较酸性环境高。在同样pH下,比较于磷酸盐、甘氨酸和Tris缓冲液,HEPES更适合Sle的催化反应。极端pH条件(如5.5、9.5)下,MES、HEPES和甘氨酸缓冲液中Sle的酶活性均低于30%。因此,Sle重组蛋白在pH为8.0的HEPES缓冲液中酶活性最高,其最适pH为8.0。

图 6 pH对Sle酶活和催化稳定性的影响 Fig. 6 Effect of pH on the activity and stability of Sle. A: The effect of pH on activity of Sle. B: pH stability of Sle.

在pH 6.0–9.0条件下,4 ℃孵育1 h,测定Sle的残余酶活。由图 6B可见,在pH 7.5–8.5之间,酶可以保留90%以上的活性。在pH 8.0时,Sle最稳定。这也说明,Sle具有良好的pH耐受范围,可为后续的PET双酶降解提供新的选择。

2.6 金属离子对酶活性影响

金属离子通常是酶的潜在抑制剂或激活剂,Sle与各种金属离子在35 ℃下预孵育1 h,测定它们对Sle活性的影响。由图 7可知,在Co2+的存在下,Sle的酶活性有所提高,但提高的数值非常有限。此外,Zn2+和Al3+存在时能够抑制其酶活性,使其分别降低了25%和9%。其他常见金属离子如Mg2+、Cu2+、Ba2+、Fe3+、Ni2+、Mn2+、Ca2+对其酶活性基本无明显影响,这也说明Sle具有良好的稳定性。

图 7 金属离子对Sle活性的影响 Fig. 7 Effect of metal ions on Sle activity.
2.7 Sle底物特异性研究

测定Sle对不同底物PET、BHET和MHET的催化选择性,结果如图 8所示,该酶对BHET的催化活性最高,对PET的催化活性只有BHET的11%。推断可能由于PET是长链大分子,不易进入其底物结合口袋,导致其对PET的催化效果欠佳。BHET和MHET在分子链长短及大小方面相似,但是结果表明,Sle对BHET具有较好的底物特异性,这可能是因为底物结合口袋氨基酸残基对BHET更敏感,导致对BHET降解效果较好,由此可见,该酶属于BHET降解酶。

图 8 Sle的底物选择性 Fig. 8 Substrate selectivity of Sle.
2.8 高效液相(HPLC)检测Sle催化产物

按照1.2.3中描述的催化体系进行反应后,利用HPLC对酶催化产物进行检测分析,结果如图 9所示。底物BHET在反应3 h后,检测到两种主要的代谢产物MHET和TPA,分别在5.316 min和4.691 min出峰。由图 9可知,当空白组不添加酶进行反应时,有部分MHET生成,说明BHET自身就易水解。同样条件下,实验组添加酶液进行反应后,底物BHET可以高效地反应生成MHET和TPA。因此,通过Sle对BHET的降解产物分析,进一步明确了Sle是BHET降解酶,这也为后续研究生物酶法降解PET的新酶挖掘提供了基础。

图 9 HPLC检测BHET降解产物 Fig. 9 Determination of BHET degradation products by HPLC.
3 讨论

废弃PET对全球环境造成了污染,如何正确处理废弃PET已经成为治理环境污染的重要课题。目前,PET的处理方法主要是垃圾填埋法、热处理法和化学回收法,其中热处理法的主要缺点是产生致癌物质二恶英和呋喃,化学回收法虽然不会造成二次污染但是其工作成本高,均不利于环境和经济的可持续发展。因此,生物降解PET技术越来越被社会各界认可,其作用条件温和,降解产物无害且能循环利用。此前的报道也发现一些酶具有水解BHET的能力,如H. insolens中的角质酶HiC[23]Candida antarctica中的脂肪酶CALB[24]Enterobacter中的EstB[14]、细菌中的IsPETase和LCC[25-26]等,与其他BHET水解酶相比,Sle可以在较短时间内将BHET转化为MHET和单体TPA,具有优良的催化能力,能够及时减轻BHET和MHET对PET水解酶的抑制,促进废弃PET的降解。然而该酶不耐受高温,与PET水解酶高温降解条件存在较大的温度差异,因此对酶分子进行改造显得至关重要。首先,结合复合物三维结构针对非保守性氨基酸进行定点突变,筛选出热稳定性提高的酶变种。其次,改造活性中心附近的氨基酸残基,扩大酶分子的底物结合口袋,更有利于底物与酶分子结合,提高降解速率,实现工业化降解废弃PET的途径。

本研究文成功克隆表达了来源于浅黄糖丝菌(S. luteola)中一种具有降解塑料中间体的水解酶Sle,该酶的理论蛋白分子量大小为27.83 kDa。将重组质粒pET-28a(+)-Sle在E. coli BL21(DE3)中进行异源表达,经过Ni亲和色谱、阴离子交换色谱和凝胶过滤色谱3步纯化,得到了高纯度的Sle目的蛋白。根据测得的酶学性质结果显示,Sle对BHET降解的最适温度和最适pH分别为35 ℃和8.0,且在25–35 ℃和pH 7.0–9.0区间内能保持80%以上的酶活,具有较好的pH耐受性。此外,除Co2+能够较小幅度地提高酶活力,Zn2+和Al3+降低酶活力外,其他常见金属离子对酶活力基本无影响,因此,该酶具有良好的稳定性。采用HPLC鉴定了Sle能特异性水解BHET,且其催化产物为MHET和TPA,验证了Sle属于BHET水解酶。根据获得的复合物三维结构,分析得到了Sle的催化活性中心由S129、D175和H207组成,解析了其催化中心形成机制,为后续该酶晶体结构解析及改造应用提供了基础。

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