2023, Vol. 39中国科学院微生物研究所、中国微生物学会主办
文章信息
- 董雅君, 崔世修, 刘延峰, 李江华, 堵国成, 吕雪芹, 刘龙
- DONG Yajun, CUI Shixiu, LIU Yanfeng, LI Jianghua, DU Guocheng, LÜ Xueqin, LIU Long
- 功能膜微域在七烯甲萘醌合成过程中的作用解析
- Functional analysis of functional membrane microdomains in the biosynthesis of menaquinone-7
- 生物工程学报, 2023, 39(6): 2215-2230
- Chinese Journal of Biotechnology, 2023, 39(6): 2215-2230
- 10.13345/j.cjb.230111
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文章历史
- Received: February 16, 2023
- Accepted: March 31, 2023
- Published: April 4, 2023
引用本文
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2. 江南大学 未来食品中心, 江苏 无锡 214122
2. Science Center for Future Foods, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China
七烯甲萘醌(menaquione-7, MK-7)是维生素K2的一种亚型，由2-甲基-(1, 4)-萘醌核和C3位侧链上7个异戊二烯基团构成[1](图 1A)，主要贮存在细胞膜中，在维持骨骼[2]、心脑血管健康[3]等方面具有良好的作用。目前MK-7主要通过发酵食品提取、化学合成和微生物发酵3种方法进行制备，其中，通过微生物发酵法对于实现MK-7的高效合成具有重要意义[4]。在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中存在完整的MK-7合成途径，可以分为糖酵解-磷酸戊糖、分支酸和甲基-4-磷酸赤藓糖醇(methylerythritol-4-phosphate, MEP)，以及典型的甲萘醌合成4个模块[5]。其中，骨架结构(1, 4)-2-羟基-2-萘甲酸(1, 4-dihydroxy-2- naphtooic acid, DHNA)由甲萘醌模块负责合成，以分支酸(chorismic acid, CHA)为底物，经由(1, 4)-二羟基-2-萘酰辅酶A水解酶[(1, 4)-dihydroxy-2-naphthoyl-CoA hydrolase, YuxO]、(1, 4)-二羟基-2-萘酰辅酶A合酶[(1, 4)-dihydroxy-2-naphthoyl-CoA synthase, MenB]等7种不同的酶参与催化[6]；侧链结构七异戊二烯基焦磷酸(heptaprenyl diphosphate, HDP)由MEP途径负责合成，以1-脱氧-d-木糖-5磷酸(1-deoxyxylulose- 5-phosphate, DXP)为底物，经由七异戊二烯基焦磷酸合酶(heptaprenyl diphosphate synthase component Ι/II, HepS/HepT)、法呢基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase, IspA)和异戊烯基焦磷酸异构酶(isopentenyl diphosphate isomerase, Fni)等11种不同的酶参与催化[7]；随后HDP在1, 4-二羟基-2-萘甲酸辛二烯酯转移酶[(1, 4)-dihydroxy-2-naphthoate heptaprenyltransferase, MenA]的催化下转移到骨架结构的C3位[8]，最终通过去甲基甲萘醌甲基转移酶(demethylmenaquinone methyltransferase, MenH)形成MK-7[9](图 1B)。Ma等[11]在枯草芽孢杆菌168中增加部分限速酶的表达量并进行不同组合，最终使MK-7产量达到50 mg/L。Cui等[12]通过增强前体供应和构建Phr60-Rap60-Spo0A群体响应调控系统，使碳流量更多进入MK-7合成途径，最终成功获取一株高产MK-7的菌株，摇瓶水平MK-7产量达到360 mg/L。
区室化可以将代谢途径中亚细胞定位不同的酶聚集于一个区域，以增加底物或酶的局部浓度，实现更快的反应速率和更高的生产率[13]。在真核生物中，可以通过脂筏[14]、线粒体[15]和内质网[16]等实现区室化。例如，Deloache等[17]将紫色杆菌素前体(prodeoxyviolacein, PDV)合成的途径酶VioB和VioE与标准过氧化物酶体基质蛋白1型信号肽(peroxisome target signal type 1, PTS1)标签融合，使酶在过氧化物酶体中表达，显著提高了PDV产量；Avalos等[18]在酵母线粒体中表达Ehrlich途径的相关酶，提高了局部酶的浓度，显著提高了异丁醇的产量。在细菌中，功能膜微域(functional membrane microdomains, FMMs)等结构域的存在亦可使质膜区室化。由脚手架蛋白和聚异戊二烯类物质构成的FMMs参与多种不同类型的细胞生命活动[19]。其中，脚手架蛋白是FMMs的标记蛋白，可以募集蛋白、脂质等物质至FMMs中，并促进这些物质间的相互作用和寡聚化[20-21]；聚异戊二烯化合物的存在使FMMs具有高度致密性和疏水性，有助于相关蛋白在FMMs中集聚[22]。Lv等[23]将N-乙酰氨基葡萄糖(N-acetylglucosamine, GlcNAc)合成所需的途径酶氨基葡萄糖-6-磷酸乙酰转移酶(GlcNAc-6-phosphate N-acetyltransferase, GNA1)、GlcN-6-磷酸合酶(GlcN-6-phosphate synthase, Glms)、磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase, Pgi)和卤酸脱卤酶样磷酸酶(haloacid dehalogenase-like phosphatases, YqaB)与脚手架蛋白融合表达，使4种酶聚集在FMMs中，通过集聚效应和底物通道效应提高酶的催化效率，最终促进了GlcNAc的高效合成。
MK-7的合成同细胞膜有关，FMMs在MK-7的合成过程中可能存在不可或缺的作用。本研究以枯草芽孢杆菌为研究对象，探讨膜上聚异戊二烯化合物MK-7和FMMs之间的相关性，并通过FMMs实现MK-7合成途径中关键酶的区室化。首先，通过可视化观察MK-7和FMMs的分布特征，明确了二者的相关性；其次，通过分析FMMs的完整性破坏前后，细胞膜上MK-7含量和膜有序度的变化，明确MK-7是构成FMMs关键聚异戊二烯类化合物的一种；最后，通过FloA蛋白将MK-7合成途径中的关键酶锚定至FMMs中，获得了一株高产MK-7的菌株BS3AT，摇瓶水平MK-7产量达到300.3 mg/L，3 L发酵罐中MK-7产量达到464.2 mg/L。结果表明，在枯草芽孢杆菌中通过FMMs实现MK-7合成途径中关键酶的区室化，可以有效提高MK-7的产量，这为MK-7的高效合成提供了一种新的思路。
1 材料与方法 1.1 菌株和质粒本研究所使用的菌株、质粒如表 1所示。
| Name | Description | Reference |
| Strains | ||
| E. coli JM109 | For plasmid construction | Lab stock |
| BS168 | Bacillus subtilis 168 | Lab stock |
| BS168C | BS168 derivate, ΔfloA ΔfloT ΔyisP ΔsqhC | |
| BS3 | BS168 derivate, Pveg-kinA-ΔPAS-A ΔkinB ΔspoIIA Δspo0IIE, P43-menF P43-menB Phbs-menE P43-entC ΔdhbB Phbs-tkt P43-ppsA ΔptsG Phbs-aroGfbr: : lox72 P43-aroK Phbs-ispA P43-hepS/T Phbs-kdpG P43-dxr P43-dxs P43-fni Pmena-menA: : lacA Pmena-menA: : thrC Pmena-menA: : dacA | Lab stock |
| BS3C | BS3 derivate, ΔfloA ΔfloT ΔyisP ΔsqhC | This work |
| BS3FA | BS3 derivate, : : P43-floA (integrated site is between yvoA and nagBA) | This work |
| BS3FT | BS3 derivate, : : P43-floT (integrated site is between yvoA and nagBA) | This work |
| BS3AF | BS3 derivate, : : P43-floA-fni (integrated site is between yvoA and nagBA) | This work |
| BS3F | BS3 derivate, : : P43-fni (integrated site is between yvoA and nagBA) | This work |
| BS3AI | BS3 derivate, : : P43-floA-ispA (integrated site is between yvoA and nagBA) | This work |
| BS3I | BS3 derivate, : : P43-ispA (integrated site is between yvoA and nagBA) | This work |
| BS3AT | BS3 derivate, : : P43-floA-hepT (integrated site is between yvoA and nagBA) | This work |
| BS3T | BS3 derivate, : : P43-hepT (integrated site is between yvoA and nagBA) | This work |
| BS3AO | BS3 derivate, : : P43-floA-yuxO (integrated site is between yvoA and nagBA) | This work |
| BS3O | BS3 derivate, : : P43-yuxO (integrated site is between yvoA and nagBA) | This work |
| Plasmids | ||
| P7C6 | Pmd18-T containing lox71-Cmr-lox66 cassette | Lab stock |
| P7S6 | Pmd18-T containing lox71-Spec-lox66 cassette | Lab stock |
| P7Z6 | Pmd18-T containing lox71-Zeo-lox66 cassette | Lab stock |
| pP43NMK | Amp, Kan, E. coli-B. subtilis shuttle vector | Lab stock |
| pHT01 | Amp, Cm, E. coli-B. subtilis shuttle vector | Lab stock |
| pHT01-floA-eGFP | floA-eGFP | This work |
| pHT01-floT-eGFP | floT-eGFP | This work |
| pHT01-menH-eGFP | menH-eGFP | This work |
| pHT01-menA-eGFP | menA-eGFP | This work |
| pHT01-menB-eGFP | menB-eGFP | This work |
| pHT01-ispA-eGFP | ispA-eGFP | This work |
| pHT01-fni-eGFP | fni-eGFP | This work |
| pHT01-yuxO-eGFP | yuxO-eGFP | This work |
| pHT01-hepS-eGFP | hepS-eGFP | This work |
| pHT01-hepT-eGFP | hepT-eGFP | This work |
LB (Luria Broth)培养基：10 g/L蛋白胨，10 g/L NaCl，5 g/L酵母粉，121 ℃灭菌20 min。LB固体培养基中添加2%的琼脂粉。
发酵培养基：50 g/L葡萄糖、50 g/L甘油、50 g/L大豆蛋白胨、0.06 g/L磷酸二氢钾，115 ℃灭菌20 min。
实验所用抗生素：卡那霉素50 µg/L、博来霉素20 µg/L、壮观霉素100 g/L、氯霉素30 µg/L。
1.3 仪器和设备本研究中所使用的主要仪器：PCR扩增仪(伯乐有限公司)、核酸电泳仪(六一电泳仪厂)、超声波细胞破碎仪(伯乐有限公司)、分光光度计(赛默飞有限公司)、超速离心机(赛默飞有限公司)、激光共聚焦显微镜(徕卡显微系统公司)、荧光显微镜(尼康公司)、HPLC-1260 (安捷伦公司)、3 L迪必尔发酵罐(NBS有限公司)。
1.4 质粒和菌株构建通过一步克隆法构建本研究所用质粒，所用引物如表 2所示。以pHT01-floA-eGFP质粒构建为例：以BS168的基因组作为模板，以FloA-1F和FloA-1R为引物扩增得到floA基因片段，以eGFP-1F和eGFP-1F为引物扩增得到eGFP基因片段；以pHT01质粒为模板，以Z-1F和Z-1R为引物扩增得到载体基因片段。参照一步克隆说明书中的质粒构建方法，获得质粒pHT01-floA-eGFP。
| Primer name | Primer sequence (5′→3′) | Size (bp) |
| Z-1F | GGATGAACTATACAAATAATCTAGAGTCGACGTCCCCGG | 39 |
| Z-1R | GTGTACATTTCACCTCCTTTAAATTACTTTCATTATGAGTT | 41 |
| eGFP-1F | GGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCATGGGTAAGGGAGAAGAACTTTTCACT | 48 |
| eGFP-1R | GTCGACTCTAGATTATTTGTATAGTTCATCCATGCCATGTGTAATCC | 47 |
| FloA-1F | TGAAATGTACACATGGATCCGTCAACACTTATGATTCTGG | 40 |
| FloA-1R | TACCCATGCTGCCGCCACCGCCGCTTCCTGATTTGCGGTCTTCATCCGAAGG | 52 |
| FloA-1F | AGGAGGTGAAATGTACACATGACAATGCCGATTATAATGATCATCGGA | 48 |
| FloA-1R | GCCACCGCCGCTTCCTTACTCTGATTTTTGGATCGTTTTGGCTTCT | 46 |
| MenH-1F | AGGAGGTGAAATGTACACATGCAGGACTCAAAAGAACAGCG | 41 |
| MenH-1R | GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCTTTCCATCCGATATGCGTGGCAG | 44 |
| MenA-1F | GCCAGTGAATTCGAGCTCATCAAAAATTCCCTTCCCGTTTTTTCGA | 59 |
| MenA-1R | TTACCCATGCTGCCGCCACCGCCGCTTCCTCGGAAATAGCTGATCAATAATCCGATCGA | 59 |
| MenB-1F | AGGAGGTGAAATGTACACATGGCTGAATGGAAAACAAAACGGA | 43 |
| MenB-1R | GCCGCTTCCCGGAAAACGAGGGAACTGTCC | 43 |
| IspA-1F | AGGAGGTGAAATGTACACGTGACAAATAAATTAACGAGCTTTCTGGCG | 48 |
| IspA-1R | ACCGCCGCTTCCGTGATCTCTTGCCGCAATTAAATCAC | 48 |
| Fni-1F | AGGAGGTGAAATGTACACGTGACTCGAGCAGAACGAAAAAGAC | 43 |
| Fni-1R | GCCGCTTCCTCGCACACTATAGCTTGATGTATTGACC | 37 |
| YuxO-1F | GGAGGTGAAATGTACACATGGATATGAAGCACACATTGCTTGAAG | 45 |
| YuxO-1R | GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCTTTCTTGATGACAGCCAGCGTGC | 45 |
| HepS-1F | GGAGGTGAAATGTACACTTGCAAGACATCTACGGAACTTTAGCC | 52 |
| HepS-1R | CCATGCTGCCGCCACCGCCGCTTCCCCCTTCTTCCACTTTCTGATGATAGGT | 52 |
| HepT-1F | AGGAGGTGAAATGTACACATGTTAAATATCATTCGTTTACTGGCGGAG | 48 |
| HepT-1R | CCGCCGCTTCCAAATTTTCTTTTACCGATATATTTTGCGATGGCT | 48 |
| QC-yisP-U-1F | TGATGCCTGATGCGAAAGTCTTTT | 53 |
| QC-yisP-U-1R | ATCCGCTCAAAACACCCGGCCTTGATTGAG | 53 |
| QC-yisP-S-1F | AGGCCGGGTGTTTTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAA | 53 |
| QC-yisP-S-1R | AGACTTGAAGAAGCATAACGCCAGGGTTTTCCCAGTC | 53 |
| QC-yisP-D-1F | GGAAAACCCTGGCGTTATGCTTCTTCAAGTCTAGTATGTTTTTTCCTAATTGT | 53 |
| QC-yisP-D-1R | ACTGGACAGAAAACAATTAGATCAGCTTTTAGA | 53 |
| QC-FloA-U-1F | CAGATCACATTTATATGGCGCCTGG | 58 |
| QC-FloA-U-1R | GTGTGAAATTGTTATCCGCTCATAACTTCTCCTCGTTTCTATTTAAATTTCTCTCACG | 58 |
| QC-FloA-S-1F | AGAAACGAGGAGAAGTTATGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAA | 58 |
| QC-FloA-S-1R | CTCCCTTCTTAGAGAGATAACGCCAGGGTTTTCCCAGT | 58 |
| QC-FloA-D-1F | AAACCCTGGCGTTATCTCTCTAAGAAGGGAGAACGCTGATG | 58 |
| QC-FloA-D-1R | ACATTTAAATTTACTTCTTACCCGCCGAA | 58 |
| QC-FloT-U-1F | TTGGCTGCCTGAAATAAAATCATGCG | 58 |
| QC-FloT-U-1R | CCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCATCAAATTCCTCCTTTTATGTTAAATGGGTTCAT | 58 |
| QC-FloT-C-1F | AAAAGGAGGAATTTGATGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC | 58 |
| QC-FloT-C-1R | GTTCTGCCCTTTCCTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTC | 58 |
| QC-FloT-D-1F | GAAAACCCTGGCGTTAGGAAAGGGCAGAACCGTATGG | 58 |
| QC-FloT-D-1R | GGTGTCAAAGCAGGTCTTACTACAGG | 58 |
| QC-sqhC-U-1F | GGATTTGTTTGACGAGCTGAAAAGC | 51 |
| QC-sqhC-U-1R | GTGTGAAATTGTTATCCGCTCATGAAACGTGAATCTTATCAAGCGGAG | 51 |
| QC-sqhC-C-1F | GCTTGATAAGATTCACGTTTCATGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC | 51 |
| QC-sqhC-C-1R | GAGTTGAGCGTGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCA | 51 |
| QC-sqhC-D-1F | AAAACCCTGGCGTTACACGCTCAACTCCTTCAGAAGC | 51 |
| QC-sqhC-D-1R | CCGCTTTCAGCTCTTTATTTGGCAG | 51 |
| U-1F | AAACCGATTATTTTGAATGTAACGTATATACCAATGAA | 54 |
| U-1R | GTGTGAAATTGTTATCCGCTCATGAATATCAATAAACAATCGCCTATTCCGATT | 54 |
| C-1F | ATAGGCGATTGTTTATTGATATTCATGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAAC | 54 |
| C-1R | GGTAAGAGAGGAATGTACACTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTC | 54 |
| P43-1F | GGAAAACCCTGGCGTTAGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATGGTACCG | 54 |
| P43-FloA-1R | ATAAGTGTTGACGGATCCATTGATAGGTGGTATGTTTTCGCT | 54 |
| FloA-1F | ACATACCACCTATCAATGGATCCGTCAACACTTATGATTCTG | 54 |
| FloA-1R | TTGAAAGGAACATGCTGACTTTGATTTGCGGTCTTCATCCGAAGG | 54 |
| FloA-D-1F | ACCGCAAATCAAAGTCAGCATGTTCCTTTCAAGGTCTTAAT | 54 |
| D-1R | GTTCGATCCTCAAAATGAACGAAGGC | 54 |
| P43-SPFH-1R | CGGCATTGTCATTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAACT | 45 |
| SPFH-1F | ACATACCACCTATCAATGACAATGCCGATTATAATGATCATCGGA | 45 |
| SPFH-1R | CATGCTGACTTTTTATCAGCCTCTGCTGTTGCGA | 45 |
| SPFH-D-1F | CAGCAGAGGCTGATAAAAAGTCAGCATGTTCCTTTCAAGGTC | 45 |
| FLoA-2R | GCTGCCGCCACCGCCGCTTCCTGATTTGCGGTCTTCATCCGAAGG | 58 |
| Fni-1F | GACCGCAAATCAGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCGTGACTCGAGCAGAACGAAAAAGAC | 58 |
| Fni-1R | CTTGAAAGGAACATGCTGACTTTTATCGCACACTATAGCTTGATGTATTGACC | 53 |
| Fni-D-1F | GCTATAGTGTGCGATAAAAGTCAGCATGTTCCTTTCAAGGTCT | 58 |
| IspA-1F | GCAAATCAGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCGTGACAAATAAATTAACGAGCTTTCTGGCG | 59 |
| IspA-1R | AACATGCTGACTTTTAGTGATCTCTTGCCGCAATTAAATCACA | 59 |
| IspA-D-1F | GCGGCAAGAGATCACTAAAAGTCAGCATGTTCCTTTCAAGGTC | 59 |
| HepT-1F | CGCAAATCAGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCATGTTAAATATCATTCGTTTACTGGCGGAG | 63 |
| HepT-1R | AGACCTTGAAAGGAACATGCTGACTTTTAAAATTTTCTTTTACCGATATATTTTGCGATGGCT | 63 |
| HepT-D-1F | CGGTAAAAGAAAATTTTAAAAGTCAGCATGTTCCTTTCAAGGTCTTAATGACGCGGCT | 63 |
| YuxO-1F | CCGCAAATCAGGAAGCGGCGGTGGCGGCAGCATGGATATGAAGCACACATTGCTTGAAG | 59 |
| YuxO-1R | AAGGAACATGCTGACTTTTATTTCTTGATGACAGCCAGCGTG | 59 |
| YuxO-D-1F | CATCAAGAAATAAAAGTCAGCATGTTCCTTTCAAGGTC | 59 |
| P43-Fni-1R | CTGCTCGAGTCACTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAACTTT | 43 |
| Fni-2F | ACATACCACCTATCAGTGACTCGAGCAGAACGAAAAAGAC | 43 |
| P43-IspA-1F | GCCAGAAAGCTCGTTAATTTATTTGTCACTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAACTTTTAAAT | 64 |
| IspA-2F | ACATACCACCTATCAGTGACAAATAAATTAACGAGCTTTCTGGC | 64 |
| P43-HepT-1R | CGCCAGTAAACGAATGATATTTAACATTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAACT | 60 |
| HepT-2F | ACATACCACCTATCAATGTTAAATATCATTCGTTTACTGGCGGA | 60 |
| P43-YuxO-1R | TGTGTGCTTCATATCCATTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTTGAACT | 59 |
| YuxO-2F | ACATACCACCTATCAATGGATATGAAGCACACATTGCTTGA | 59 |
| The underlined sequences are the linker used in the experiment, and the linker used is the flexible linker. | ||
通过Cre/loxP系统构建本研究所用重组枯草芽孢杆菌，所用引物如表 2所示。以重组工程菌BS3FA的构建为例：以BS168的基因组作为模板，以U-1F和U-1R为引物扩增得到上游同源臂基因片段，以FloA-1F和FloA-1R为引物扩增得到floA基因片段，以D-1F和D-1R为引物扩增得到下游同源臂基因片段；以pP43NMK质粒为模板，以P43-1F和P43-1R为引物扩增得到P43启动子基因片段；以P7C6质粒为模板，以C-1F和C-1R引物对扩增得到lox71-zeo-lox66基因片段。通过重叠延伸PCR融合表达5个片段。通过化学转化的方法将构建好的表达框转入BS3中，通过菌落PCR验证获得重组工程菌BS3FA。
1.5 摇瓶发酵取保藏在甘油管中的重组枯草芽孢杆菌接种至LB固体培养基上进行活化，挑取单菌落接种至2 mL LB液体培养基中，在37 ℃、220 r/min培养条件下振荡培养8 h；取1 mL种子液接种至20 mL发酵培养基中于40 ℃、220 r/min振荡培养6 d。每24 h取样500 µL监测细胞生长情况，以及MK-7含量的检测。每组样品3个平行。
1.6 细胞组分的分离和提取发酵样品：按照上述摇瓶发酵方法，取发酵2 d后的发酵液15 mL用于细胞组分分离。
细胞外：将发酵样品在5 000 r/min离心10 min，分为“上清1”和“沉淀1”。“上清1”用作检测胞外MK-7含量。
全细胞：“沉淀1”用无菌水洗涤3次并用无菌水重悬后，用作检测全细胞MK-7产量。
细胞内：重悬后的“沉淀1”通过超声波细胞破碎仪进行破碎，在10 000 r/min离心40 min，分为“上清2”和“沉淀2”；“上清2”通过超速离心机在140 000 r/min下离心1 h，分为“上清3”和“沉淀3”，“上清3”用作检测细胞内MK-7含量。
细胞膜：“沉淀3”用无菌水重悬后，用作检测细胞膜上MK-7含量。
1.7 荧光显微镜观察eGFP样品制备：取保藏在甘油管中的重组枯草芽孢杆菌接种到LB固体培养基上进行活化，挑取单菌落接种到2 mL LB液体培养基中在37 ℃、220 r/min培养条件下振荡培养10 h；5 000 r/min、10 min离心收集菌体，用LB液体培养基清洗3遍，得到荧光观察样品。
罗丹明123样品制备：在发酵36 h后的摇瓶发酵液中加入20 µL的2 mmol/L罗丹明123母液，继续孵育1 h；5 000 r/min、10 min离心收集菌体，用LB液体培养基清洗3遍，得到荧光观察样品。
Di-4-ANEPPDHQ样品制备[23]：取保藏在甘油管中的重组枯草芽孢杆菌接种到LB固体培养基上进行活化，挑取单菌落接种到2 mL LB液体培养基中在37 ℃、220 r/min培养条件下振荡培养10 h；5 000 r/min、10 min离心收集菌体，弃上清，添加1 mL LB培养基(含有5 µmol/L di-4-ANNEPPDHQ)，于冰上孵育10 min，离心弃上清，用预冷的LB培养基洗涤3次。
eGFP和罗丹明123荧光观察：通过使用尼康显微镜C-HGF (100×油镜)观察eGFP和罗丹明123，使用FITC滤光片，通过ImageJ软件进行图像处理和分析。
Di-4-ANEPPDHQ荧光观察：使用激光共聚焦显微镜Leica TCS SP8显微镜(60×油镜)，样品采用488 nm的激发光波长，500−580 nm (有序相)和620−750 nm (无序相)的发射光波长，显微镜设置(偏移值，PMT电压和激光功率)均相同。通过均一化极性数值(generalized polarization value, GP value)来表示定量分析，GP图像根据Owen等[24]提供的ImageJ自定义宏生成。计算公式如下：
|
其中，I500−580和I620−750分别代表500−580 nm和620−750 nm通道中每个像素的荧光强度。Gcor为校准因子，计算公式如下：
|
GPexp是二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶液在相同显微镜设置下中di-4-ANEPPDHQ的GP值，GPthe则是染料在DMSO中的参考值，一般认为GPthe=–0.85。处理后的荧光图像中每个像素强度乘GP值，则可以生成色相饱和度亮度的伪彩色GP图像。
1.8 MK-7的萃取和检测MK-7萃取：按照异丙醇和正己烷1:2 (体积比)的比例配制萃取液。将待测样品和萃取液按照1:4 (体积比)的比例混匀离心后，上层有机相检测MK-7含量。
MK-7检测：检测仪器为配备有紫外检测器的高性能液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)，色谱柱为C18-ODS色谱柱(5 µm, 250 mm×4.6 mm)，流动相为90%的甲醇和10%的二氯甲烷(色谱级)。进样量为10 µL，流速为1 mL/min，柱温40 ℃，检测波长254 nm。MK-7校准曲线在1 mg/L至100 mg/L之间呈线性(R2=0.998)。
1.9 3 L发酵罐发酵3 L发酵罐所用培养基：50 g/L葡萄糖、50 g/L甘油、50 g/L大豆蛋白胨、0.06 g/L磷酸二氢钾，115 ℃灭菌20 min。
取保藏在甘油管中的重组枯草芽孢杆菌接种到LB固体培养基上进行活化，挑取一个单菌落接种到50 mL LB液体培养基中在37 ℃、220 r/min培养条件下振荡培养10 h；将种子液按照4% (体积分数)的接种量接种到含有1.5 L发酵培养基的3 L发酵罐中，培养6 d。
发酵罐条件设置：通气量为1.5 vvm，发酵温度为40 ℃，pH通过50% (体积分数)的氨水维持在7左右，搅拌转速根据溶氧进行调节，溶氧维持在50%，转速在400−600 r/min。
2 结果与分析 2.1 FMMs和MK-7的相关性分析为了明确FMMs与MK-7之间是否具有相关性，该研究对两者的亚细胞定位进行了分析。有研究指出，脚手架蛋白FloA和FloT构成FMMs的骨架结构，可以作为FMMs的标志蛋白[25]。首先，分别将脚手架蛋白FloA和FloT与eGFP进行融合表达，进行荧光显微镜观察。结果显示，FloA-eGFP和FloT-eGFP主要以不连续的点状结构分布于细胞膜上(图 2A、2B)。进一步使用MK-7的特异性染料罗丹明123染料对课题组前期构建的一株高产MK-7菌株BS3进行染色[26]。结果显示，MK-7也以不均匀的点状结构分布在细胞膜上(图 2C)，推测FMMs和MK-7存在相关性。
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| 图 2 FloA、FloT和MK-7的分布特征 Fig. 2 Characteristic of FloA, FloT and MK-7. A: Subcellular localization of FloA. B: Subcellular localization of FloT. C: Subcellular localization of MK-7. Bar=1 µm. A：FloA的亚细胞定位. B：FloT的亚细胞定位. C：MK-7的亚细胞定位. 标尺=1 µm |
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除脚手架蛋白外，聚异戊二烯化合物也参与维持FMMs的完整性。聚异戊二烯化合物的合成需要YisP[27](合成C30萜类化合物)和SqhC[28](聚异戊二烯环化酶)的参与。因此，为了探讨FMMs的完整性对MK-7合成的影响，该研究在BS3菌株中通过Cre/loxP基因编辑方法敲除了基因floA、floT、sqhC和yisP，获得菌株BS3C，检测BS3和BS3C菌株中不同组分的MK-7含量。结果发现，FMMs的完整性被破坏后，MK-7的总产量基本不变。其中，BS3C细胞内MK-7的含量增加了26.8%，细胞膜上MK-7的含量降低了24.8% (图 3B)。这表明在破坏FMMs的完整性后，细胞膜和细胞内MK-7的含量发生明显变化。推测可能原因是FMMs的完整性被破坏后，会影响MK-7进入细胞膜的过程，进而使MK-7在细胞内积累。
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| 图 3 FMMs完整性破坏对MK-7的影响 Fig. 3 Effect of disruption of FMMs integrity on MK-7 content. A: Diagram of gene knockout expression box. B: Changes in MK-7 content in different fractions of strains BS3 and BS3C. A：基因敲除表达框示意图. B：菌株BS3和BS3C不同组分中的MK-7含量 |
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FMMs是一类高度有序的膜结构域，可以通过膜有序度来表征细胞膜上FMMs的变化情况[23]。为了明确FMMs的完整性和MK-7对细胞膜有序度的影响，同样在BS168菌株中通过敲除基因floA、floT、sqhC和yisP，获得菌株BS168C，使用di-4-ANEPPDHQ[29]染料对BS3、BS3C和BS168C进行染色，通过激光共聚焦显微镜采集双通道图像(500−580 nm和620−750 nm)，并通过ImageJ进行GP值分析和图像转化。GP值可指示膜有序度，GP值越高，膜有序度越高。对获得的直方图进行拟合，获得膜有序度定量分析结果。结果发现，BS3的GP峰值为0.48，平均GP值为0.47±0.01；BS3C的GP峰值为0.43，平均GP值为0.43±0.01；BS168C的GP峰值为0.33，平均GP值为0.32±0.01 (图 4A–4C)。其中，BS3的膜有序度高于BS3C，表明FMMs完整性被破坏后影响了MK-7进入细胞膜的过程，导致了BS3C细胞膜上MK-7含量降低。BS3C的膜有序度明显高于BS168C，表明MK-7可以有效提高细胞膜有序度。上述结果表明MK-7是FMMs中的一类重要的聚异戊二烯类化合物。
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| 图 4 BS3、BS3C和BS168C膜有序度的定量分析 Fig. 4 Quantitative analysis of membrane order in BS3, BS3C and BS168C. A: Confocal images of BS3, BS3C and BS168C strains from the green channel (500−580 nm) and red channel (620−750 nm), the merged images from both channels and the GP images. Bar=1 µm. B: GP histograms of BS3, BS3C and BS168C strains show the number of pixels distributed in each GP value. C: Average GP values of BS3, BS3C and BS168C. A：每一行从左到右依次为500−580 nm和620−750 nm波长下拍摄的图像、Merged处理后的图像和GP图像. 标尺=1 µm. B：BS3、BS3C和BS168C不同区域的GP值分布直方图. C：BS3、BS3C和BS168C的平均GP值 |
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为了探究MK-7如何定位至细胞膜甚至FMMs中，该研究选择8个MK-7合成的关键酶：MenH、MenA、MenB、YuxO、HepS、HepT、Fni、IspA，拟对它们的亚细胞定位情况进行分析。其中，Fni、IspA、HepS和HepT参与MK-7侧链合成；MenB和YuxO参与MK-7骨架结构合成；MenA将侧链HDP整合到骨架DHNA中形成DMK，最后通过MenH甲基化形成MK-7。
分别将上述8个关键酶与eGFP融合表达，进行荧光显微镜观察。结果显示，MenH-eGFP、HepS-eGFP和MenB-eGFP均以不连续的点状结构分布在细胞膜上，和FMMs标记蛋白的亚细胞定位极为类似，推测MenH、HepS和MenB主要定位于FMMs中；MenA-eGFP蛋白则是典型的细胞膜定位蛋白；YuxO-eGFP、Fni-eGFP、HepT-eGFP和IspA-eGFP均匀地分布在细胞质中(图 5)。由上述结果可知，负责骨架结构和侧链合成的关键酶在细胞中存在一定的空间距离，可能会降低代谢反应速率，进而影响MK-7的合成。
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| 图 5 MK-7合成途径关键酶的分布特征 Fig. 5 Subcellular localization of pathway enzymes. Bar=1 µm. 标尺=1 µm |
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鉴于FMMs和MK-7的相关性，本研究尝试使用FMMs来进行MK-7合成途径关键酶的区室化。首先以BS3为出发菌株，分别构建过表达FloA、FloT的重组菌株BS3FA和BS3FT，验证过表达不同脚手架蛋白对MK-7产量的影响。结果发现，BS3FA的MK-7产量达到135.3 mg/L，与BS3相比提高了17.8% (图 6A)，同时过表达FloA对细胞生长也有一定的促进作用。BS3FT的产量为94.3 mg/L，与BS3相比降低了18.0%，且2 d后，与其他菌株相比，OD600明显减小(图 6B)，这可能是BS3FT菌株MK-7产量降低的主要原因。因此，选择FloA蛋白进行后续研究。
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| 图 6 过表达脚手架蛋白对MK-7产量的影响 Fig. 6 Effect of overexpression scaffold proteins on MK-7 production. A: MK-7 titer of BS3, BS3FA and BS3FT. B: OD600 of BS3, BS3FA and BS3FT. A：BS3、BS3FA和BS3FT的MK-7产量. B：BS3、BS3FA和BS3FT的细胞生长情况 |
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接下来尝试通过使用FloA蛋白将MK-7合成途径关键酶锚定在FMMs中，以实现MK-7合成途径关键酶的区室化(图 7A)。以B3S为出发菌株，构建得到融合表达FloA-Fni、FloA-IspA、FloA-HepT和FloA-YuxO的重组菌株BS3AF、BS3AI、BS3AT和BS3AO。分别以过表达Fni、IspA、HepT和YuxO的重组菌株BS3F、BS3I、BS3T和BS3O作为对照，验证MK-7合成途径关键酶区室化对MK-7产量的影响。结果发现，除过表达IspA外，重组工程菌的产量与对照相比都得到了明显提高(图 7B–7I)。其中，BS3AT的MK-7产量最高，达到了300.3 mg/L，较对照菌株提高了73.4%。
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| 图 7 MK-7合成途径的区室化 Fig. 7 Compartmentalization of MK-7 synthesis. A: Assembly of pathway enzymes via FloA. B: MK-7 titer of BS3AF and BS3F. C: MK-7 titer of BS3AI and BS3I. D: MK-7 titer of BS3AT and BS3T. E: MK-7 titer of BS3AO and BS3O. F: OD600 of BS3AF and BS3F. G: OD600 of BS3AI and BS3I. H: OD600 of BS3AT and BS3T. I: OD600 of BS3AO and BS3O. A：MK-7合成途径关键酶区室化示意图. B：BS3AF和BS3F的MK-7产量. C：BS3AI和BS3I的MK-7产量. D：BS3AT和BS3T的MK-7产量. E：BS3AO和BS3O的MK-7产量. F：BS3AF和BS3F的细胞生长情况. G：BS3AI和BS3I的细胞生长情况. H：BS3AT和BS3T的细胞生长情况. I：BS3AO和BS3O的细胞生长情况 |
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重组菌株BS3AT通过分批培养的方式在3 L中发酵罐中进行进一步的发酵验证。初始葡萄糖浓度为50 g/L，通过50%氨水维持pH在7左右。OD600在2 d后达到峰值，随着发酵时间的延长，MK-7的增长速率随着细胞裂解而减缓，MK-7产量在发酵6 d后达到了464.2 mg/L (图 8)。在3 L发酵罐和摇瓶中MK-7产量的变化整体趋势一致。该结论进一步证明了通过FMMs实现MK-7合成途径关键酶区室化的有效性。
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| 图 8 BS3AT在3 L发酵罐中的发酵结果 Fig. 8 Fermentation of BS3AT in a 3 L bioreactor. A: MK-7 titer of BS3AT. B: Trend of glucose and OD600 of BS3AT. A：BS3AT的MK-7产量. B：BS3AT中葡萄糖和OD600的变化情况 |
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MK-7作为脂溶性维生素K2的重要亚型，在功能食品等领域有着广泛应用。因此，通过微生物发酵法实现MK-7的高效合成有着重要意义。在模式微生物枯草芽孢杆菌中，许多研究者通过增强前体供应、阻断副产物合成等方法对MK-7的代谢途径进行优化，期望实现MK-7的高效合成[30-31]。相比于其他改造策略，区室化可以使目标代谢通路的酶集中于一个区域，缩短途径酶之间的空间距离，加快代谢反应速率，进而实现目标产物的高效合成[32-34]。因此，通过细胞膜上特殊的结构域FMMs实现枯草芽孢杆菌中MK-7合成途径的区室化可以为MK-7的代谢改造提供一种新的思路。
本研究首先探讨了MK-7和FMMs的相关性。通过可视化分析发现，MK-7和FMMs均以不连续的点状结构分布于细胞膜上，初步推测二者存在相关性。其次FMMs的完整性被破坏导致了细胞膜上MK-7含量和膜有序度的下降。但是在FMMs的完整性被破坏后，MK-7仍可以有效提高膜有序度，证明MK-7是FMMs聚异戊二烯类的关键组分。在此基础上，尝试通过FMMs来实现MK-7的高效合成。
在MK-7合成过程中，关键酶MenH、HepS和MenB定位于FMMs中，Fni、IspA、HepT和YuxO游离在细胞质中，MenA则是典型的细胞膜定位。MK-7合成相关的关键酶在细胞中的空间位置相对较远，这可能会导致MK-7的合成效率较低。因此，接下来通过FloA蛋白分别融合表达关键酶Fni、IspA、HepT和YuxO，使得关键酶定位在FMMs中，缩短关键酶之间的空间距离，实现MK-7合成途径相关关键酶的区室化。通过FloA蛋白将MK-7合成途径关键酶HepT锚定到FMMs后，成功获得一株高产MK-7菌株BS3AT，在摇瓶水平MK-7产量达到300.3 mg/L，相比于对照菌株提高了73.4%，在3 L生物反应器中的产量为464.2 mg/L。
综上所述，基于FMMs的MK-7合成途径关键酶区室化，有效提高了MK-7的产量，为构建高效合成MK-7的微生物细胞工厂提供了新思路。
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