传统工业中，l-色氨酸主要通过化学合成法、生物转化法和酶转化法生产^[1]。而如今，微生物直接发酵法生产l-色氨酸因成本低廉、环境友好等优点，已成为工业化生产的主要方法^[2-4]。能用于发酵法生产l-色氨酸的菌株有大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)^[5-6]。其中，大肠杆菌具有生长快、易培养、改造手段丰富等优点，成为发酵法生产l-色氨酸的首选菌株^[7]。然而，受错综复杂的生物代谢途径与反馈调节机制的阻碍，导致E. coli发酵生产l-色氨酸的效率处于较低水平^[8-9]。为此，在过去的几十年中，研究人员发展了丰富的代谢工程策略改造E. coli以获得l-色氨酸高产菌株，如通过过表达抗反馈抑制的aroG^fbr [3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(3‐deoxy‐d‐arabinoheptulosonate‐7‐ phosphate, DAHP)合酶]、trpE^fbrDCBA (l-色氨酸操纵子)，使E. coli生产l-色氨酸产量达到45.0 g/L，生产强度达到1.07 g/(L·h)^[10]。尽管如此，前体物质磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)和赤藓糖-4-磷酸(erythrose-4-phosphate, E4P)的匮乏，限制了l-色氨酸产量进一步提升，为此，通过对合成前体E4P的关键基因tktA (转酮酶Ⅰ)和合成前体PEP的关键基因ppsA (磷酸烯醇式丙酮酸合成酶)进行研究，发现在单独表达tktA或ppsA以及共同表达的情况下，l-色氨酸产量分别提高了1.0%、5.6%和11.9%^[11]。此外，E. coli发酵生产l-色氨酸过程中往往伴随大量副产物的产生，对菌株的生长与l-色氨酸的合成均会带来不利的影响，为此，通过敲除副产物乙酸合成途径相关的多个基因，使菌体浓度和色氨酸的产量分别提高了11.5%和20.6%^[12]。为进一步提高l-色氨酸产量，本团队通过启动子工程调节ppsA、tktA和aroG表达，平衡2个前体PEP与E4P的供给；并通过控制丝氨酸合成途径serA、serB和serC表达，优化丝氨酸供给，使l-色氨酸的产量达到40.1 g/L，有效地提高了l-色氨酸的产量与生产强度；然而糖酸转化率最高仅达到14.2%，进一步通过强化转运蛋白yddG表达，使l-色氨酸的产量和转化率得到进一步提升，但最终糖酸转化率仅为17.1%^[13]。

上述代谢工程方法显著提高了l-色氨酸产量，但莽草酸途径作为芳香族氨基酸的共同途径对生产l-色氨酸的影响往往被人们所忽视。为此，把以前期研究中获得的原始菌株E. coli TRP0作为底盘微生物，借助代谢工程策略解除了色氨酸合成途径中的反馈抑制，并利用模块化工程策略优化莽草酸途径(图 1)，获得工程菌E. coli TRP9，使l-色氨酸产量达到36.08 g/L，糖酸转化率达到18.55%。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒

本研究使用的E. coli JM109用于质粒表达，E. coli TRP及其衍生菌株用于l-色氨酸生产(E. coli TRP为此前研究^[13]中所使用的原始菌株E. coli TRP0，经多轮诱变筛选获得，保藏编号CCTCC M20211388。本研究中将其命名为E. coli TRP)。本研究所使用的菌株和质粒见表 1。

1.1.2 培养基

LB培养基：酵母粉5.0 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L (固体培养基中添加2%的琼脂)。

种子培养基：K₂HPO₄ 24 g/L，KH₂PO₄ 9.6 g/L，酵母粉15 g/L，(NH₄)₂SO₄ 5.0 g/L，MgSO₄ 1.0 g/L，葡萄糖30 g/L，四环素50 mg/L，自然pH。

发酵培养基：葡萄糖7.5 g/L，酵母浸粉(安琪酵母FM902) 3.0 g/L，(NH₄)₂SO₄ 1.6 g/L，柠檬酸2.0 g/L，K₂HPO₄ 5.6 g/L，MgSO₄ 2.0 g/L，微量元素液1 mL/L，使用NaOH调节pH至7.0。

微量元素液配方：FeSO₄·7H₂O 75.6 g/L，CoCl₂·6H₂O 4.0 g/L，CuSO₄·5H₂O 0.6 g/L，ZnSO₄·7H₂O 6.4 g/L，Na₂SO₄ 20 g/L，MnSO₄·H₂O 4.5 g/L，溶于5 mmol/L H₂SO₄中。

1.1.3 主要试剂

PrimeSTAR高保真酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶，购自宝生物工程(大连)有限公司；一步同源重组酶，购自南京巨匠生物科技有限公司；细菌基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司；抗生素，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；乳酸、乙酸、3-脱氢莽草酸(3‐dehydroshikimate, DHS)、莽草酸、分支酸，购自Sigma公司；酵母浸粉(安琪酵母FM902)，购自安琪酵母股份有限公司；酵母粉、蛋白胨，购自Oxoid公司；葡萄糖，购自西王集团有限公司；PCR引物，亦欣生物科技(上海)有限公司；其他试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法 1.2.1 培养方法

固体活化：LB培养基灭菌后，待温度降到45 ℃左右加入四环素。配制好的平板斜面等需放在35 ℃恒温倒置2 d。一代活化：35 ℃培养14–16 h。二代活化：35 ℃培养12–14 h。

种子培养：向培养好的斜面中加入10 mL生理盐水洗下菌苔。摇晃均匀后吸取1 mL菌液移入种子液中(50 mL/500 mL三角瓶)，在36 ℃、200 r/min条件下培养6 h。

摇瓶发酵：发酵培养基中初始葡萄糖浓度提高至40 g/L，并添加80 mg/L苯酚红作为pH指示剂。按照10% (体积分数)的接种量将种子培养液接种于装有45 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中。在36 ℃、200 r/min条件下培养40 h。发酵过程中，以苯酚红为指示剂，每隔4 h添加一次氨水调节pH。

发酵控制：以1.5 vvm初始通气比、400 r/min初始转速将培养好的种子液按10% (体积分数)的接种量接种于5 L发酵罐[T & J-Intelli-FermA, T & J Bio-engineering (Shanghai) Co., Ltd.]中。发酵过程中开启pH自控，流加25%氨水控制pH为7.0；开启温度自控，发酵温度控制为36 ℃；手动调节转速与通气，维持溶氧在20%−30%。接种6 h左右，溶氧骤升，初始葡萄糖耗尽，启动自动补料模式，通过流加800 g/L葡萄糖控制发酵液中葡萄糖浓度在1 g/L以内。当OD₆₀₀达到15−16时，加入0.5 mmol/L异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl- beta-d-thiogalactopyranoside, IPTG)进行诱导。

1.2.2 重组菌株构建

基因敲除与整合采用CRISPR-Cas9技术来完成，质粒构建采用标准分子克隆操作和吉布森组装法^[14-15]。本研究所使用的引物见表 2。基因trpE^fbrDCBA、serA、serB、serC、ppsA和tktA以E. coli TRP基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得。基因aroG^fbr通过PCR定点突变获得。

1.2.3 检测方法

细胞浓度检测：取适量发酵液稀释(稀释至OD₆₀₀在0.2–0.8范围内)，使用紫外分光光度计在波长600 nm下测定OD₆₀₀。

葡萄糖浓度检测：取适量发酵液经12 000 r/min，离心10 min，取上清液，控制样品中葡萄糖浓度稀释至0–2 g/L以内，采用SBA-40E生物传感分析仪测定(深圳西尔曼科技有限公司)。

l-色氨酸浓度检测：使用Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm, Agilent)。流动相配比为0.3 g/L KH₂PO₄ (水溶液)与甲醇按9:1 (体积比)混合；紫外检测器检测波长为278 nm；进样量10 μL；流速1.0 mL/min；柱温39 ℃。

有机酸浓度检测：使用Aminex HPX-87H色谱柱(7.8 mm×300 mm, 5 μm, Bio-Rad)。流动相为5 mmol/L稀硫酸；紫外检测器检测波长为210 nm；进样量10 μL；流速0.6 mL/min；柱温52 ℃。

胞内代谢物检测：将培养的细胞在15 mL的–40 ℃甘油/水(60:40, 体积比)混合物中冷激，并以12 000 r/min，–20 ℃离心3 min。细胞颗粒用5 mL生理盐水(4 ℃)洗涤2次，然后在5 mL 50%甲醇/水混合物(4 ℃)中重悬。悬浮液经液氮冻融5次循环处理，并以12 000 r/min、4 ℃离心10 min。PEP测定采用磷酸烯醇式丙酮酸(PEP) ELISA检测试剂盒(上海科艾博生物技术有限公司)；E4P测定采用赤藓糖-4-磷酸(E4P)酶联免疫分析试剂盒(上海雅吉杨生物科技有限公司)；磷酸核糖焦磷酸(phosphoribosyl pyrophosphate, PRPP)测定采用细菌磷酸核糖焦磷酸(PRPP) ELISA检测试剂盒(上海佰利莱生物科技有限公司)；丝氨酸测定采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)梯度洗脱测定^[16]。

2 结果与分析 2.1 构建合成l-色氨酸底盘微生物

为了获得合成l-色氨酸的底盘微生物，本研究以E. coli TRP (实验室保藏)为底盘菌株，利用CRISPR技术敲除l-色氨酸操纵子阻遏蛋白的编码基因trpR，获得工程菌株E. coli TRP1 (TRP ΔtrpR)。为了消除l-色氨酸弱化子的调控，在E. coli TRP1的基础上，敲除l-色氨酸操纵子的弱化子区域(trpL)，获得工程菌株E. coli TRP2 (TRP1 ΔtrpL)。为了进一步削弱苯丙氨酸对aroG的反馈抑制，通过蛋白质工程改造，将E. coli TRP2的aroG第211位丝氨酸突变为苯丙氨酸^[17]，获得工程菌株E. coli TRP3 (TRP2 ΔaroG: : aroG^fbr)。如图 2A所示，与E. coli TRP相比，菌株E. coli TRP3在5 L发酵罐上生长没有发生变化，在发酵28 h时，OD₆₀₀达到最高60.5；l-色氨酸产量和转化率分别提高了70.8%和58.3%，达到11.80 g/L和8.25%。发酵液中副产物乙酸和乳酸含量分别达到9.63 g/L和12.41 g/L (图 2B)，显著降低了l-色氨酸转化率。

2.2 重构中心代谢路径增加前体DAHP供应

为了降低副产物积累，进一步提高色氨酸的产量与转化率对菌株E. coli TRP3的中心代谢路径进行重构，主要包括3个方面：(1) 敲除副产物合成基因；(2) 在副产物合成基因的位点插入l-色氨酸前体合成基因；(3) 强化表达l-色氨酸合成路径中的关键酶基因aroG^[18]。为了降低副产物乙酸的积累，分别敲除菌株E. coli TRP3中的丙酮酸氧化酶基因poxB^[19-20]、丙酸激酶基因tdcD^{[12, 21]}、磷酸乙酰转移酶基因pta和乙酸激酶基因ackA^[22]，获得突变菌株E. coli TRP3-1 (ΔpoxB)、TRP3-2 (ΔtdcD)、TRP3-3 (Δpta)和TRP3-4 (ΔackA)；为了降低副产物乳酸合成，分别敲除E. coli TRP3中的乳酸脱氢酶基因ldhA^[23]和醌依赖型-乳酸脱氢酶的编码基因dld^[24]，获得突变菌株E. coli TRP3-5 (TRP3 ΔldhA)和TRP3-6 (TRP3 Δdld) (图 3A)。经摇瓶发酵发现，不同基因的敲除，对菌株生长和生产带来不同程度的影响(图 3B)，与E. coli TRP3相比：(1) 敲除poxB，使OD₆₀₀提高了9.1%，而pta和ackA的敲除则使菌株OD₆₀₀分别降低18.3%和37.1%，tdcD、ldhA和dld的敲除对菌株的生长没有显著影响；(2) 敲除poxB和ldhA，使l-色氨酸产量分别提高了4.9%和3.8%，而敲除pta和ackA则使产量分别降低了22.7%和34.6%，敲除tdcD和dld对l-色氨酸产量没有显著影响；(3) 敲除ldhA和poxB，使转化率分别提高了5.1%和3.5%，敲除pta和ackA使转化率分别降低了6.6%和11.9%，而敲除tdcD和dld对转化率没有明显影响。上述结果表明，敲除poxB有利于提高细胞生长与产量，敲除ldhA有利于提高转化率，敲除基因pta和ackA不利于提高菌株生长、产量和转化率，而敲除tdcD和dld几乎不影响l-色氨酸生产。

为了提高前体PEP和E4P的供应，在菌株E. coli TRP3中将ppsA (编码PEP合酶)^[25]整合到poxB的基因座上，获得菌株E. coli TRP4 (TRP3 ΔpoxB: : ppsA)，其在摇瓶水平中l-色氨酸产量提高至2.05 g/L，转化率达到6.55%，较菌株E. coli TRP3-1分别提高5.7%和4.3% (图 3C)。进一步发现菌株E. coli TRP4中胞内PEP含量达到18.60 nmol/g DCW，较E. coli TRP3-1提高了12.5%；而E4P的含量几乎不变，PEP与E4P的比值由E. coli TRP3-1的1.58增加至1.79 (图 3C)。更进一步，将tktA (编码转酮醇酶)^[25]整合到菌株E. coli TRP4的ldhA的基因座上，得到突变菌株E. coli TRP5 (TRP4 ΔldhA: : tktA)，其在摇瓶上l-色氨酸产量提高至2.31 g/L，转化率为7.21% (图 3C)。菌株E. coli TRP5胞内E4P浓度较菌株E. coli TRP4提高了16.3% (10.38 nmol/g DCW提高到12.07 nmol/g DCW)，PEP与E4P比值降低至1.51 (图 3C)。

PEP和E4P缩合形成DAHP，不仅是莽草酸合成路径最为关键的环节，也是l-色氨酸合成路径中的关键限速瓶颈^[18]。在E. coli中，该反应由AroG、AroF和AroH三个同工酶(DAHP合酶)共同催化，其中AroG酶活占总酶活的80%，并且该酶受l-苯丙氨酸的反馈抑制^[26]。为了进一步提高前体DAHP的积累，在E. coli TRP5中过表达aroG^fbr (抗反馈突变体)，获得菌株E. coli TRP6 (TRP5 P_tac-aroG^fbr)。在摇瓶水平上l-色氨酸产量提高至2.82 g/L，转化率达7.89% (图 3D)。在5 L发酵罐中(图 3D)，E. coli TRP6的OD₆₀₀为84.3，比菌株E. coli TRP3提高了39.3%；l-色氨酸的产量和转化率分别达到17.43 g/L和11.20%，较E. coli TRP3分别提高了47.7%和35.8%；而副产物乙酸和乳酸含量分别下降至3.47 g/L和5.41 g/L，比菌株TRP3分别降低了64.0%和56.4% (图 3E)。综上所述，重构中心代谢路径可以削弱副产物积累对菌株生长和生产的抑制，并增加前体供应，能有效地提高菌株的生产性能。然而，在发酵过程中还发现，莽草酸途径至分支酸模块的中间代谢物3-脱氢莽草酸和莽草酸含量分别达到4.52 g/L和2.50 g/L，而分支酸含量仅为0.64 g/L (图 3E)，这一结果表明，莽草酸途径效率较低，无法将前体3-脱氢莽草酸和莽草酸转化为分支酸。

2.3 优化莽草酸途径增加分支酸供应

如图 4A所示，莽草酸途径的关键靶点aroB、aroE和aroL对l-色氨酸合成具有重要影响^[27]。为此，利用3个水平的启动子高(P_J23119)、中(P_J23108)和低(P_J23114)^[28]调控aroB、aroE和aroL表达水平，构建了9株基因工程菌(图 4B)。摇瓶发酵结果(图 4B)表明，与E. coli TRP6相比：(1) 当基因aroB在低(TRP6-1)、中(TRP6-2)、高(TRP6-3)水平表达时，l-色氨酸产量分别提高6.7%、6.0%和3.0%，转化率分别提高6.6%、5.3%和0.1%；(2) 当基因aroE在低(TRP6-4)、中(TRP6-5)、高(TRP6-6)水平表达时，l-色氨酸的产量分别提高9.3%、12.8%和17.2%，转化率分别提高5.5%、8.1%和10.4%；(3) 当基因aroL在低(TRP6-7)、中(TRP6-8)、高(TRP6-9)水平表达时，l-色氨酸的产量分别提高6.7%、20.4%和7.7%，转化率分别提高6.7%、11.8%和5.8%。对上述结果进行总结，发现当基因aroB低水平(TRP6-1)、aroE高水平(TRP6-6)、aroL中水平(TRP6-8)表达时，l-色氨酸产量分别为3.01、3.31和3.40 g/L，转化率为8.41%、8.71%和8.82%。

基于上述结果，在菌株E. coli TRP6中将L-aroB-H-aroE-M-aroL片段组合装配至基因组tdcD的基因座上，得到突变菌株E. coli TRP7 (TRP6 ΔtdcD: : L-aroB-H-aroE-M-aroL)。摇瓶实验表明，菌株E. coli TRP7生长没有发生显著变化，但l-色氨酸产量和转化率比菌株E. coli TRP6分别提高了36.5%和18.1%，达到3.85 g/L和9.32%。在5 L发酵罐中发酵40 h，色氨酸产量和转化率分别达到23.41 g/L和13.41% (图 4C)，比菌株E. coli TRP6分别提高了34.3%和19.7%。而DHS和SA含量分别下降了66.6% (4.52 g/L下降到1.51 g/L)和65.6% (2.50 g/L下降到0.86 g/L，图 4D)。此时分支酸含量从0.64 g/L提高至3.64 g/L (E. coli TRP6，图 4D)。上述结果表明，通过启动子工程优化莽草酸途径，能有效地降低中间代谢物积累，从而提高l-色氨酸合成效率。

2.4 模块优化分支酸至l-色氨酸途径

为了强化分支酸至l-色氨酸的代谢通量(图 5A)，在菌株E. coli TRP7中过量表达l-色氨酸操纵子trpEDCBA (trpE所编码的邻氨基苯甲酸合酶在菌株进行诱变时已发生抗反馈突变^[13])，获得工程菌株E. coli TRP8 (TRP7 P_tac-trpE^fbrDCBA)，其在摇瓶中l-色氨酸产量(5.48 g/L)和转化率(10.65%)比菌株E. coli TRP7分别提高了42.3%和14.3% (图 5B)。为了提高l-色氨酸前体丝氨酸与PRPP供应，通过启动子工程分别对丝氨酸合成路径关键基因serA和PRPP合成关键基因prs的表达水平进行优化，获得6株基因工程菌(图 5B)。发现随着serA表达水平的提高，菌株生长、产量和转化效率不断提升，当使用高强度启动子表达serA时，OD₆₀₀、l-色氨酸产量和转化率分别达到30.15、6.68 g/L和11.56%，比菌株E. coli TRP8分别提高了12.9%、21.9%和8.5%。当基因prs表达水平在中(TRP8-5)和高(TRP8-6)时，l-色氨酸产量提升至5.85 g/L和5.86 g/L，但只有菌株E. coli TRP8-5转化率比E. coli TRP8提高了5.4%。因此，将基因serA和prs分别控制在高、中水平表达时，有利于l-色氨酸的合成。因此，将H-serA-M-prs组合装配至菌株E. coli TRP8基因组中dld基因座上，获得E. coli TRP9 (TRP8 Δdld: : H-serA-M-prs)。在摇瓶中l-色氨酸产量和转化率分别达到7.05 g/L和12.10%，比菌株E. coli TRP8分别提高了28.6%和13.6%，而胞内丝氨酸和PRPP含量较E. coli TRP8分别提高了25.7%和7.2% (图 5C)。5 L发酵罐中发酵40 h，发酵结果如图 5D所示：菌株E. coli TRP9的OD₆₀₀、l-色氨酸产量和转化率分别达到95.6、36.08 g/L和18.55%。与菌株E. coli TRP7相比，分别提高了18.9%、54.1%和38.3%。另外在发酵液中几乎检测不到分支酸的存在。这些结果表明，分支酸至l-色氨酸模块的优化能有效地提高l-色氨酸的生产能力。

3 讨论与展望

l-色氨酸的生物合成涉及糖酵解(Embden-Meyerhof-Parnas pathway, EMP)和戊糖磷酸途径(pentose phosphate pathway, PPP)两条途径，其中EMP途径形成的PEP与PPP途径形成E4P在DAHP合酶的催化下缩合形成DAHP^[29]。有研究表明，流向EMP途径的碳通量要比流向PPP途径的碳通量高一个数量级^[30]，而大肠杆菌中大约只有3%的PEP会用于合成芳香族氨基酸^[31]。错综复杂的生物合成途径为l-色氨酸的生产带来诸多隐患，例如副产物竞争碳流、中间代谢物积累以及合成路径代谢通量不足等。本研究通过代谢产物谱分析以及模块化工程，对这些问题进行了系统性的优化。首先，对底盘菌株E. coli TRP3的发酵液进行检测时，发现大量乙酸和乳酸的积累，为此，敲除了乙酸和乳酸合成相关的6个基因poxB、tdcD、pta、ackA、ldhA和dld。随后将PEP合成酶的编码基因ppsA整合至poxB的基因座，将转酮酶Ⅰ的编码基因tktA整合到ldhA的基因座。发酵结果表明，胞内前体PEP和E4P的含量分别提高12.5%和16.3%，而副产物乙酸和乳酸的含量分别降低64.0%和56.4%；针对副产物3-脱氢莽草酸和莽草酸，通过启动子工程将莽草酸途径至分支酸模块的关键基因aroB、aroE和aroL分别控制在低、高、中水平，能有效地将3-脱氢莽草酸和莽草酸含量分别降低66.6%和65.6%。针对分支酸的含量从0.64 g/L增加至3.64 g/L，通过强化l-色氨酸操纵子的表达，同时优化分支酸至l-色氨酸模块中前体物质丝氨酸和PRPP合成的关键基因serA和prs，获得高产菌株E. coli TRP9，其在5 L发酵罐中发酵40 h，OD₆₀₀、l-色氨酸产量和糖酸转化率分别达到95.6、36.08 g/L和18.55%。

随着合成生物学手段的不断发展，越来越多的代谢工程策略应用于构建l-色氨酸高效生产的细胞工厂。酿酒酵母主要用于l-色氨酸生产的机制与模型的理解和学习^[6]、而谷氨酸棒杆菌与大肠杆菌是常用的l-色氨酸工业生产菌株(表 3)。表 3中谷氨酸棒杆菌生产l-色氨酸产量虽高于大肠杆菌，但生产周期几乎是大肠杆菌的2倍，限制了工业化应用。因此，科研人员的注意力集中于代谢改造大肠杆菌，以获得l-色氨酸高产菌种。在前期研究中，本团队通过平衡PEP与E4P供给、优化丝氨酸供应和强化转运蛋白表达，使l-色氨酸的产量提升至52.1 g/L，转化率达到17.1%^[13]，有效地提高了l-色氨酸的产量，但糖酸转化率仅为理论转化率的75.3%，显著增加了底物成本。为了进一步提高糖酸转化率，相关研究工作主要集中阐释限制糖酸转化率提高的机制、改造葡萄糖转运系统(glucose transport system, PTS)、减少碳流竞争、增加前体供应等方面。大肠杆菌中磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸转移酶-葡萄糖转运系统(PTS系统)消耗了大约50%的l-色氨酸前体物质PEP^[31]，导致进入莽草酸途径的碳通量减少了一半，使l-色氨酸的理论转化率仅为22.7%^[32]。为进一步提高l-色氨酸的糖酸转化率，在对PTS系统中的磷酸载体蛋白(phosphocarrier protein, HPr)进行深入研究的基础上，构建了一系列HPr突变体，可使菌株糖酸转化率提高45.0%^[33]。另一方面，Wu等^[34]利用Red同源重组系统、构建包含两类典型PTS系统突变(ptsHIcrr^–glf-glk⁺和ptsG^–)的l-色氨酸生产菌，使糖酸转化率分别提高了26.5%和17.6%。但是，PTS系统缺陷会严重影响工程菌株的生长能力，为此，研究人员通过引入运动假单胞菌(Zymomonas mobilis)的葡萄糖促扩散蛋白-葡萄糖激酶基因(glf-glk)来替代PTS系统，同时引入青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)的基因Xfpk来提高E4P供应，不仅改善了工程菌株生长性能，还使l-色氨酸的糖酸转化率取得突破性进展，达到22.7%^[35]。而通过降低磷酸乙酰转移酶的亲和力，则可使l-色氨酸转化率提高了18.2%，同时副产物乙酸含量降低了53.5%^[22]；通过共表达前体合成的关键基因ppsA和tktA，使l-色氨酸转化率由14.74%提升至16.44%，提高了11.5%^[11]。尽管如此，l-色氨酸的转化率仍然难以取得实质性突破。在本研究中，通过代谢产物谱分析以及模块化工程解除l-色氨酸生物合成路径中的潜在瓶颈，使工程菌株E. coli TRP9在生产强度与其他高产菌株保持相差不大的情况下，糖酸转化率提高至18.55%，是理论转化率的81.7%。这一数值较此前研究中未进行转运工程改造的菌株(TRP8)提高了30.6%^[13]，较此前研究中的最终菌株(TRP12)提高了8.5%^[13]。

虽然对PTS系统进行代谢改造能有效地提高l-色氨酸的糖酸转化率，但大量研究表明，PTS系统的改造导致菌株生长受到抑制，进而限制了l-色氨酸产量进一步提高^[37]。因此，后续研究中重点关注于底物-产物转运系统的优化，通过基因电路、群体响应开关等代谢工程元件调节微生物生长、生产以及底物-产物转运，构建微生物智能转运系统，以有效地提高l-色氨酸产量和糖酸转化率。