生物工程学报  2023, Vol. 39 Issue (6): 2375-2389 |
引用本文
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己二酸又称为肥酸，是一种具有广阔工业应用价值的二元羧酸[1]。作为一种重要的大宗化学品，己二酸已被美国能源部列为12种最有市场价值的生物基化学品[2]。目前，其全球年产量约285万t，产值约47亿美元，且保持年均4.1%的增长[3]。己二酸是尼龙-66生产的关键前体之一。此外，其还在医药、化工和材料等领域中有着广泛的应用[4]。
己二酸的生产方法主要有化学合成法和生物合成法2种。化学合成法现阶段的成熟工艺是将环己酮和环己醇混合后经硝酸氧化生成[2]。然而，基于石化路线生产己二酸是一种非环境友好型的生产方式。在生产过程中释放的N2O等温室气体不可避免会对环境造成污染[1]。因此，开发一种绿色、清洁的生产方式对于己二酸的生产至关重要。随着生物技术的快速发展，利用生物法合成己二酸逐渐引起了人们的广泛关注[5]。目前，己二酸的生物合成法主要有酶转化法和微生物发酵法2种。例如，通过体外酶促反应催化合成己二酸的报道中，以聚酮化合物(polyketides, PKS)为底物体外酶转化可以合成己二酸[6]。但是极低的产量限制了其在工业化生产中的应用。生物发酵法利用代谢工程等技术手段，改造胞内代谢流量、流速和流向，使微生物以廉价碳源为底物合成己二酸，具有一定工业化生产潜力。
目前，发酵法合成己二酸的路径主要有以下3种：逆向β氧化途径[7]、碳链衍生途径[8]和逆己二酸降解(reverse adipate-degradation pathway, RADP)途径[9]。(1) 逆向β氧化途径：Yu等[8]在大肠杆菌(Escherichia coli)中过量表达逆向β氧化途径酶，最终经过发酵获得639 μg/L己二酸，首次实现了大肠杆菌中己二酸的从头合成；(2) 碳链衍生途径：Li等[7]将逆β-氧化途径与ω-氧化途径相结合，并对菌株进行代谢工程改造和发酵优化，在168 h己二酸产量达到2.96 g/L；(3) RADP途径：Deng等[10]在添加有5-羧基-2-烯戊-CoA还原酶(Tfu_1647)的褐色嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)菌株细胞破碎液中检测到少量己二酸的积累。对T. fusca B6突变株进一步研究后发现：该菌株中存在一条天然的RADP。接着通过组学技术对此途径涉及的酶和基因进行挖掘，成功解析了该合成路径[11]。对该菌株进行70 h分批补料发酵后，己二酸的产量可达到2.23 g/L[10]。随后，Zhao等[9]通过将T. fusca菌株的己二酸合成路径引入E. coli BL21(DE3)菌株中，并通过代谢工程改造成功获得了大肠杆菌己二酸高产菌株。最终以葡萄糖和甘油为底物，经96 h的分批补料发酵，己二酸的产量可达68 g/L。
为了实现己二酸的发酵生产，本研究首先在一株产琥珀酸野生型大肠杆菌中引入RADP途径实现己二酸的合成；然后，利用体外代谢路径重构策略，鉴定RADP途径限速酶是Tfu_1647；通过引入不同的核糖体结合位点(ribosome binding site, RBS)组合对路径进行优化，提高了己二酸的合成效率；接着对上游路径中的关键靶点进行改造，在平衡乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A的供应的基础上进一步提高了己二酸的产量；随后在5 L发酵罐中分别从补糖浓度、通气量和诱导剂浓度3个方面对发酵工艺进行优化。最终在5 L发酵罐中，经72 h的分批补料发酵，己二酸的产量达到22.3 g/L，转化率为0.25 g/g，生产强度为0.31 g/(L·h)。
1 材料与方法 1.1 菌种和质粒| Strains | Features | Sources |
| E. coli JM109(DE3) | Wild-type E. coli strain | Storage in laboratory |
| E. coli MG1655 | Wild-type E. coli strain | Storage in laboratory |
| E. coli DH5α | Wild-type E. coli strain | Storage in laboratory |
| E. coli BL21(DE3) | Wild-type E. coli strain | Storage in laboratory |
| E. coli W3110 | Wild-type E. coli strain | Storage in laboratory |
| E. coli FMME N-2 | After ARTP mutagenesis breeding from E. coli FMME-N screened from rumen of camel (CCTCC M2018568[12]) | Storage in laboratory |
| E. coli JL00 | E. coli FMME N-2 containing plasmids pTR-0 and pTE-0, AmpR, CmR | This study |
| E. coli JL01 | E. coli FMME N-2 containing plasmids pTR-0 and pTE-1, AmpR, CmR | This study |
| E. coli JL02 | E. coli FMME N-2 containing plasmids pTR-0 and pTE-2, AmpR, CmR | This study |
| E. coli JL03 | E. coli FMME N-2 containing plasmids pTR-0 and pTE-3, AmpR, CmR | This study |
| E. coli JL04 | E. coli JL01 with genome acs original promoter replaced by pJ23119 | This study |
| E. coli JL05 | E. coli JL01 with genome pank original promoter replaced by pJ23119 | This study |
| E. coli JL06 | E. coli JL01 with genome lpd mutation | This study |
| E. coli JL07 | E. coli JL01 ΔsdhA | This study |
| E. coli JL08 | E. coli JL01 ΔsucD | This study |
| E. coli JL09 | E. coli JL08 with genome acs original promoter replaced by pJ23119 | This study |
| E. coli JL10 | E. coli JL08 with genome pank original promoter replaced by pJ23119 | This study |
| E. coli JL11 | E. coli JL08 with genome lpd mutation | This study |
| E. coli JL12 | E. coli JL08 with genome acs promoter replacement and lpd mutation | This study |
| E. coli JL13 | E. coli JL08 with genome pank promoter replacement and lpd mutation | This study |
| E. coli JL14 | E. coli JL08 with genome acs and pank promoter replacement | This study |
| E. coli JL15 | E. coli JL08 with genome acs, pank promoter replacement and lpd mutation | This study |
| Plasmids | Features | Sources |
| pTrcHisA | pTrc promoter, AmpR, pBR322 ori | Storage in laboratory |
| pTet | pTet promoter, CmR, p15A ori | Storage in laboratory |
| pTR-0 | pTrcHisA, AmpR, pTrcHisA-Tfu_0875-Tfu_2399-Tfu_0067, pBR322 ori | This study |
| pTE-0 | pTet, pTet-Tfu_1647, Tfu_2576-7, CmR, p15A ori | This study |
| pTE-1 | pTet, pTet-Tfu_1647 (H), Tfu_2576-7, CmR, p15A ori | This study |
| pTE-2 | pTet, pTet-Tfu_1647 (M), Tfu_2576-7, CmR, p15A ori | This study |
| pTE-3 | pTet, pTet-Tfu_1647 (L), Tfu_2576-7, CmR, p15A ori | This study |
| pET28a-1 | pET28a, pET28a-Tfu_0875, KanR, f1 ori | This study |
| pET28a-2 | pET28a, pET28a-Tfu_2399, KanR, f1 ori | This study |
| pET28a-3 | pET28a, pET28a-Tfu_0067, KanR, f1 ori | This study |
| pET28a-4 | pET28a, pET28a-Tfu_1647, KanR, f1 ori | This study |
| pET28a-5 | pET28a, pET28a-Tfu_2576-7, KanR, f1 ori | This study |
| pETM6R1-RBSL-GFP | pETM6R1 link to GFP gene with low expression level | This study |
| pETM6R1-RBSM-GFP | pETM6R1 link to GFP gene with medium expression level | This study |
| pETM6R1-RBSH-GFP | pETM6R1 link to GFP gene with high expression level | This study |
| pCas9 | araBAD promoter, KanR, repA101 ori | Storage in laboratory |
| pTargetF | sgRNA, SpeR | Storage in laboratory |
供试验所用的酶制剂均购自宝生物工程(大连)有限公司(大连TaKaRa公司)，其中一步同源重组酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；供试验所用试剂盒和抗生素均购自生工生物工程(上海)股份有限公司；PCR引物由天霖生物科技(无锡)有限公司合成；其他试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.3 培养基LB培养基：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L。
LBG培养基：含20 g/L葡萄糖的LB培养基。
发酵培养基：玉米浆7.5 g/L，K2HPO4 1.4 g/L，KH2PO4 0.6 g/L，(NH4)2SO4 3.3 g/L，20 g/L葡萄糖。
葡萄糖在115 ℃条件下灭菌15 min，其他成分在121 ℃条件下灭菌20 min。
1.4 方法 1.4.1 表达载体的构建采用一步同源重组法来构建重组质粒。采用的acs、lpd、pank、sucD和sdhA基因来源于E. coli MG1655，来自褐色嗜热裂孢菌(T. fusca)的Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0067、Tfu_1647、Tfu_2576-7基因由苏州金唯智生物科技有限公司进行密码子优化和合成。所有PCR引物(表 3)和表达载体的Sanger测序均由天霖生物科技(无锡)有限公司进行。
| Primer names | Primer sequence (5′→3′) | Size (bp) |
| Tfu_0875-F | CAGTGATAGAGAAAAGAATTCAAAGAGGAGAAAATG | 36 |
| Tfu_0875-R | AGCTTGCACGGTCCACTGACTCAGACTCGATAGC | 34 |
| Tfu_2399-F | TACTTACGATCGTTCCTAACTCGTCATTATGCAT | 34 |
| Tfu_2399-R | ATCGCCGAGTTACGATAGTGTTACTCTCACAG | 32 |
| Tfu_0067-F | GAGCTTCTAGATTACTGCATTCCTGTGTACTGTGA | 35 |
| Tfu_0067-R | TCACGCCGGCCATCGATGACGAGAATCCATGCTCGTAC | 38 |
| Tfu_1647-F | GATGATTAATTGTCAAAAGCTTTCAGGCAATTCCGTT | 37 |
| Tfu_1647-R | CACACAGGAAACAGACCATGAATCAGCCCCTGAAT | 35 |
| Tfu_2576-7-F | ATATTCGATCACTCATATGCATTCGCTAACCTGAC | 35 |
| Tfu_2576-7-R | ACGGTTGTTAAGGTGTGTATCTTGCTGCAGCTTG | 34 |
| RBS-FL | ATAGCTCTGGTGTATTGCAATCAATTCATTGACCATCTAAGTA | 43 |
| RBS-FM | CGAGATCTATAAATTTGCGAGTGCTGTATTCCTCCTCTCCCTA | 43 |
| RBS-FH RBS-R |
ATGGCGATTTCTCCCACGCCGTCTCTTGCTCCTCCATTCG TGCCTTAACGGTTCGAAAGAAGTTCGAGACCATCGAGCT |
40 39 |
| acs-F | ATCTGCAGAAAGAACAAGGGCGTTCAACG | 29 |
| acs-R | TACATATGAAAATCATTAGCATTAAGGAGAAA | 32 |
| lpd-F | CCGCCATTTTGTGAAAGCTTAGATCTATAC | 30 |
| lpd-R | AACCTCTAGGAATGAGCTCGCGTAAGTGCGAGTC | 34 |
| pank-F | CTAGGCCTACGCTCGAGTACTTCTTCCATTGCGA | 34 |
| pank-R | CGTTGATCGCCAGGTCATCGCGTAGAAGTTGAA | 33 |
| sucD-F | TGCAGTAAAAGCCGTTGGTGGTGGTTCTA | 29 |
| sucD-R | CGATGTGTGGAATTGTTGGCGGTTCAGAG | 29 |
| sdhA-F | GCTCGAGTACTACTAATTCTGATCCGATC | 29 |
| sdhA-R | GACCTCAATGCTTAGAAGTTCTAAGTAG | 28 |
以质粒pET28a-1–5为模板，用引物对Tfu_0875-F/R、Tfu_2399-F/R和Tfu_0067-F/R分别扩增Tfu_0875、Tfu_2399和Tfu_0067基因，采用标准分子克隆操作构建重组质粒pTR-0。同理，用引物对Tfu_1647-F/R和Tfu_2576-7-F/R分别扩增相应基因，双酶切载体pTet的限制性酶切位点Bgl Ⅱ/Hind Ⅲ并用T4 DNA连接酶连接产生重组质粒pTE-0。
以pET28a-eGFP为模板，用引物对RBS-Fi (i: L, M, H)/RBS-R扩增eGFP基因。经过同源重组连接到载体pETM6R1的Xba Ⅰ/Xho Ⅰ位点，产生质粒pETM6R1-RBSL-GFP、pETM6R1- RBSM-GFP、pETM6R1-RBSH-GFP。
采用CRISPR-Cas9技术[13]对出发菌株E. coli FMME N-2基因组中的基因acs、lpd和pank分别进行改造。采用融合PCR的方法将acs上下游同源臂和带有pJ23119启动子的片段进行连接，获得acs整合框，将其与质粒pTargetF和pCas共同转入菌株E. coli FMME N-2中筛选获得阳性克隆，消除质粒后获得acs基因整合的菌株E. coli JL04。采用相同的方法构建lpd和pank基因改造的菌株E. coli JL05和E. coli JL06。采用上述方法获得sucD和sdhA基因敲除盒，将其与质粒pCas和pTargetF共同转入菌株E. coli FMME N-2中，筛选获得阳性克隆E. coli JL07和E. coli JL08。
1.4.2 培养方法种子培养：平板单菌落接种于液体LB培养基，37 ℃、200 r/min培养10–12 h后形成一级种子；随后按照2%接种量转接至50 mL液体LB培养基中，相同条件培养8 h后形成二级种子。
摇瓶培养：取8 mL的二级种子培养液，接种于80 mL的发酵培养基中，分为两阶段发酵：种子培养条件提供氧气培养12 h后转至无菌厌氧瓶中，添加碳酸镁使pH维持6.2以上；葡萄糖浓度控制在10–20 g/L，72 h后发酵结束。
5 L发酵罐培养：取10% (体积分数)的二级种子液，接种至3 L装液量的发酵罐中，分为两阶段补料分批发酵：有氧阶段初始条件为转速400 r/min，通气量3 vvm，温度37 ℃，氨水控制pH至7.0，待初始葡萄糖消耗完全后，调整补料速率和通气量，同时转速调至200 r/min，添加2 mol/L氨水维持pH为6.5，直至72 h发酵结束。
1.4.3 分析方法气相色谱检测己二酸浓度：取发酵液2 mL，12 000 r/min离心10 min，上清液用2 mL乙酸乙酯萃取，取1 mL有机相用氮气吹干。添加含甲醇、硫酸、三氯甲烷(体积比30:3:1)的混合液5 mL，70 ℃反应1 h，加入200 μL N, O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷混合液(体积比99:1)，65 ℃反应30 min，用氮气吹干后加入1 mL正己烷检测。检测参数如下：载气为氦气，流量1 mL/min，进样量1 μL；柱温50 ℃，维持1 min后，以10 ℃/min速度升高至240 ℃，保持5 min。
2 结果与分析 2.1 己二酸生产菌株的构建为了实现己二酸的高效合成，本研究通过整合糖酵解途径、三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循环和RADP途径，设计了以葡萄糖为底物，利用乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A为前体物质，经路径酶Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0067、Tfu_1647、Tfu_2576-7参与的己二酸合成代谢途径(图 1)。
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| 图 1 己二酸合成途径设计 Fig. 1 Design of adipic acid biosynthesis pathway. |
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充足的前体物质供应对于己二酸高效合成至关重要。分别选取了菌株E. coli DH5α、E. coli JM109(DE3)、E. coli BL21(DE3)、E. coli MG1655、E. coli FMME N-2、E. coli W3110，利用LBG液体培养基进行胞内乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A浓度检测。结果表明，在培养过程中所有菌株的胞内乙酰辅酶A含量基本相近，而菌株E. coli FMME N-2胞内琥珀酰辅酶A含量明显高于其他菌株。因此，选择E. coli FMME N-2菌株作为底盘菌株(图 2)。
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| 图 2 不同Escherichia coli菌株胞内前体物质浓度测定 Fig. 2 Determination of intracellular precursor concentrations in different Escherichia coli strains. A: Succinyl-coenzyme A. B: Acetyl-coenzyme A. |
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为降低单质粒表达多基因的负荷，如图 1所示，将己二酸合成路径上游3个基因和下游3个基因分别插入表达载体pTrcHisA和pTet-1中，获得重组质粒pTrcHisA-0875-2399-0067和pTet-1647-2576-7，同时转化至底盘菌株E. coli FMME N-2中，获得工程菌株E. coli JL00。经72 h的摇瓶发酵实验，菌株E. coli JL00己二酸产量为0.34 g/L，得率为0.08 g/g葡萄糖，而对照菌株E. coli FMME N-2无己二酸积累。上述结果表明，工程菌株可以利用葡萄糖合成己二酸，但是合成效率较低，可能是因为合成路径存在限速酶。
2.2 己二酸的合成路径的优化为提高己二酸合成效率，利用体外代谢重构策略鉴定己二酸合成路径限速瓶颈。本研究选择3-氧代己二酰辅酶A作为代谢分节点，将己二酸合成路径划分为反应体系Ⅰ和Ⅱ，其中每个反应体系的终点均涉及游离辅酶A的释放，可方便反应速率检测(图 3A)。对5种路径酶分别进行表达纯化后，依次对反应体系Ⅰ和Ⅱ进行测试。首先，控制2个反应体系中每种路径酶为2 μmol/L，反应体系Ⅱ的初始反应速率仅为反应体系Ⅰ的8.9% (图 3B)，表明反应体系Ⅱ是己二酸合成的限速瓶颈；其次，为明确反应体系Ⅱ中具体的限速酶，在固定其他条件不变的情况下，依次调整Tfu_2399、Tfu_0067、Tfu_1647和Tfu_2576-7的添加浓度，测定初始反应速率。当Tfu_2399、Tfu_0067、Tfu_1647和Tfu_2576-7的酶浓度提高至5倍时，反应体系Ⅱ初始反应速率分别提高3.1、1.6、5.3和2.2倍，表明Tfu_1647是关键限速酶(图 3C)。
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| 图 3 己二酸合成路径限速瓶颈的鉴定与解除 Fig. 3 Identification and removal of rate-limiting bottlenecks in the biosynthesis pathway of adipic acid. A: Modular design of in vitro reaction system. B: Determination of initial reaction rate of reaction system Ⅰ. C: Determination of initial reaction rate of reaction system Ⅱ. D: Assessment of the strength of different RBS. E: Evaluation of shaking flask fermentation of different strains. |
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为了解除己二酸合成路径限速瓶颈，引入不同强度RBS调节限速酶Tfu_1647的表达量。首先，通过在线RBS Calculator v 2.0选择了15个不同的RBS序列，并利用增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP)荧光密度评估每种RBS序列的强度。结果如图 3D所示，其中，RBS03为高强度，RBS12为中强度，RBS07为低强度。将上述3种RBSs分别替换Tfu_1647中的RBS序列，获得不同强度Tfu_1647的工程菌株，依次命名为E. coli JL01、E. coli JL02、E. coli JL03。经72 h摇瓶发酵后，最优菌株E. coli JL01己二酸的产量和得率分别达到0.87 g/L和0.12 g/g葡萄糖，较对照菌株E. coli JL00分别提高至2.56倍和1.50倍(图 3E)。然而，虽然解除了合成路径中存在的代谢瓶颈，己二酸得率仍然远低于理论得率(0.52 g/g葡萄糖)。因此，需要对上游前体供应路径进行强化，以提高己二酸的合成效率。
2.3 改造中心代谢途径以平衡前体供应RADP途径涉及2种前体物质，分别是乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A。首先，为了增加胞内乙酰辅酶A的浓度，采用3种代谢工程策略：(1) 在基因组水平上，将编码乙酰辅酶A合成酶的acs基因本源启动子替换为强启动子PJ23119，促使副产物乙酸直接转化为乙酰辅酶A，新菌株命名为E. coli JL04；(2) 在基因组水平上，将编码的泛酸激酶的pank基因本源启动子替换为强启动子PJ23119，以促进胞内辅酶A的直接合成，新菌株命名为E. coli JL05；(3) 将编码二氢硫辛酸脱氢酶的lpd基因第354位谷氨酸突变为赖氨酸，以促进丙酮酸向乙酰辅酶A的转化，新菌株命名为E. coli JL06。
为了验证经过代谢改造后菌株的胞内乙酰辅酶A浓度是否增加，从产量、细胞生长和胞内乙酰辅酶A含量3个方面进行了比较分析。(1) 在己二酸产量方面，强化乙酰辅酶A供应的3种策略均有利于己二酸的合成，其中最优菌株是E. coli JL04，己二酸产量和得率分别达到1.23 g/L和0.13 g/g葡萄糖，较对照菌株E. coli JL01分别提高至1.41倍和1.08倍；(2) 在细胞生长方面，强化乙酰辅酶A供应的工程菌株最大OD600均出现轻微减弱，其中己二酸产量最优菌株E. coli JL04的最大OD600为10.6，较对照菌株E. coli JL01下降了31%；(3) 在胞内乙酰辅酶A浓度方面，3种强化策略均有效提升了胞内乙酰辅酶A浓度，其中最优菌株E. coli JL04胞内乙酰辅酶A含量达到0.058 μmol/(L·OD600)，较对照菌株E. coli JL01提高至4.14倍。
琥珀酰辅酶A是TCA循环的中间代谢产物。为了增加胞内琥珀酰辅酶A的浓度，采用了2种代谢工程策略：(1) 敲除编码琥珀酸脱氢酶黄蛋白亚基的sdhA基因，以阻断琥珀酸向富马酸的转化，新菌株命名为E. coli JL07；(2) 敲除编码琥珀酰辅酶A连接酶β亚基的sucD基因，以阻断琥珀酰辅酶A向琥珀酸的转化，新菌株命名为E. coli JL08。摇瓶发酵结果表明，工程菌株E. coli JL07和E. coli JL08的最大OD600均出现较大减弱，较对照菌株分别下降了51%和58%。其中敲除sucD，使得工程菌株E. coli JL08的己二酸的产量和得率分别为1.34 g/L和0.15 g/g葡萄糖，较对照菌株E. coli JL01分别提高至1.54倍和1.25倍，同时，菌株E. coli JL07和E. coli JL08的琥珀酰辅酶A浓度分别是8.9 μmol/(L·OD600)和10.3 μmol/(L·OD600)，较对照菌株E. coli JL01分别提高1.75倍和2.02倍，证明强化琥珀酰辅酶A供应的策略有利于己二酸的积累。
在对照菌株E. coli JL01中，乙酰辅酶A含量[0.014 μmol/(L·OD600)]远低于琥珀酰辅酶A含量[5.1 μmol/(L·OD600)]，2种前体物质浓度相差约360倍。为了平衡双前体的供应，需要增加乙酰辅酶A的供应。本研究在菌株E. coli JL08的基础上，采用单独和组合强化乙酰辅酶A策略，共构建了7种工程大肠杆菌E. coli JL09-15 (表 1)。经摇瓶发酵测试，最优菌株E. coli JL12的己二酸产量和得率分别达到了1.51 g/L和0.18 g/g葡萄糖，较对照菌株E. coli JL01分别提高至1.74倍和1.50倍。菌株E. coli JL12的最大OD600较对照菌株E. coli JL01下降约28%。对2种前体物质浓度进行测定后发现，菌株E. coli JL12的琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A分别为10.1 μmol/(L·OD600)和0.11 μmol/(L·OD600)，两者比值下降至约90倍(图 4)。上述研究结果表明，通过组合优化策略平衡了双前体的供应，有效提高了己二酸的产量和得率。
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| 图 4 平衡前体供应促进己二酸合成 Fig. 4 Adipic acid synthesis promoted by balancing precursor supply. A: Effect of acetyl-CoA enhancement strategy on titer and growth. B: Effect of acetyl-CoA enhancement strategy on intracellular acetyl-CoA. C: Effect of succinyl-CoA enhancement strategy on titer and growth. D: Effect of succinyl-CoA enhancement strategy on intracellular succinyl-CoA. E: Effects of combinatorial strategies on titer and growth. F: Effects of combination strategies on the synthesis of two intracellular precursors. |
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为研究工程菌株发酵罐水平生产己二酸的最优条件，本研究分别从补糖浓度、通气量和诱导剂浓度3个方面对发酵工艺进行优化，以提高己二酸产量。
首先，在补料阶段，比较了控制葡萄糖浓度在4个水平(0–2.5、2.5–5.0、5.0–7.5、7.5–10.0 g/L)对己二酸产量和得率的影响。结果如图 5A、5B所示，在细胞生长方面，随着葡萄糖浓度的升高，细胞最大OD600逐渐增加，分别为32.2、35.6、38.2和42.6；在己二酸合成方面，当葡萄糖浓度控制为2.5–5.0 g/L时，己二酸的产量最高为15.8 g/L，得率为0.22 g/g葡萄糖，较优化前分别提高至1.46倍和2.2倍。
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| 图 5 己二酸的罐上发酵工艺优化 Fig. 5 Fermentation optimization for adipic acid production. A: Effect of glucose concentration on cell growth. B: Effect of glucose concentration on adipic acid production. C: Effect of aeration on cell growth. D: Effect of aeration on adipic acid production. E: Effect of inducer concentrations on cell growth. F: Effect of inducer concentrations on adipic acid production. |
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其次，在补料阶段，评估了设置不同通气量(0、0.5、1.0、1.5 vvm)对己二酸生产的影响。如图 5C和5D所示，在细胞生长方面，随着通气量的升高，细胞最大OD600逐渐增加，分别为35.7、36.6、37.6和43.4；在己二酸合成方面，当通气量0.5 vvm时，己二酸产量达到17.3 g/L，相比于优化前提高了8.9%。然而，当通气量继续上升至1.5 vvm时，己二酸的产量下降至13.7 g/L，较优化前降低了15.3%。因此，本研究选择0.5 vvm作为己二酸发酵生产时的通气量。
最后，研究了诱导剂异丙基β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)的不同浓度(1、3和5 mmol/L)对己二酸发酵生产的影响。如图 5E和5F所示，在细胞生长方面，随着诱导剂浓度的升高，细胞最大OD600逐渐下降，分别为36.6、32.6和31.0；在己二酸合成方面，当诱导剂浓度为3 mmol/L时，己二酸的产量达到22.3 g/L，进一步提升诱导剂浓度到5 mmol/L时，己二酸的产量下降至19.9 g/L。
3 讨论与展望本研究以实验室保藏的E. coli FMME N-2作为底盘菌株，通过生产菌株的构建、合成路径的优化以及前体供应的平衡，成功构建了一株己二酸工程菌株E. coli JL12。该菌株摇瓶发酵后己二酸的产量可达到1.51 g/L。同时，为了测试菌株的实际生产能力，本研究在5 L发酵罐水平分别从补糖浓度、通气量和诱导剂浓度3个方面对己二酸发酵工艺进行优化。最终，经分批补料发酵，工程菌株己二酸的产量达到22.3 g/L，转化率为0.25 g/g，生产强度为0.31 g/(L·h)，具备了一定的应用潜力。
区别于以往研究[9]，本研究在己二酸工程菌株的构建过程中发现己二酸合成路径存在限速瓶颈。为了保证己二酸的高效合成，本研究首次在路径中引入不同强度的RBS，通过调节限速酶的表达量来提高己二酸的产量。经72 h摇瓶发酵后，最优菌株E. coli JL01己二酸的产量和得率分别较对照菌株E. coli JL00提高了2.56倍和1.50倍。此外，前体供应失衡也是影响己二酸产量的重要因素。为此，本研究首次运用组合优化策略平衡前体的供应，采用过表达acs基因、突变lpd基因和敲除sucD基因的方式提高了胞内乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A的含量，满足了己二酸合成的需要。最终，最优菌株E. coli JL12的己二酸产量和得率分别较对照菌株E. coli JL01提高了1.74倍和1.50倍。
目前人工构建的己二酸生物合成路径有3种，分别为逆向β氧化途径[14]、碳链衍生途径[15-16]和逆己二酸降解(RADP)途径[17-20] (表 4)。(1) 逆向β氧化途径是最早用于己二酸生物合成研究的代谢途径[8]，该途径合成己二酸的最大理论得率为0.52 g/g甘油，目前基于该途径对大肠杆菌进行代谢工程改造，己二酸的产量可达2.5 g/L，得率为0.35 g/g甘油[21]；(2) 碳链衍生途径是在逆向β氧化途径的基础上，结合ω-氧化途径用于己二酸的生物合成。碳链衍生途径通过将长链脂肪酸不断缩短的方式生成己二酸，同时释放乙酰辅酶A用于细胞生长。该路径可实现碳原子的有效利用，合成己二酸的最大理论得率为0.81 g/g葡萄糖。目前基于该途径，改造热带假丝酵母可以获得12.1 g/L己二酸，得率为0.16 g/g葡萄糖[22]；(3) 基于中心代谢途径的RADP途径合成己二酸的最大理论得率为0.52 g/g甘油，虽然该途径在理论转化率上并不是最优的，却是目前文献报道合成己二酸最成功的途径。基于该途径改造大肠杆菌，可获得68 g/L己二酸，得率为0.43 g/g甘油[9]。
| Pathways | Strains | Substrates | Cultivation | Titer (g/L) | Yield (g/g) | References |
| Reverse beta oxidation pathway | E. coli | Glucose | Shake flask batch | 0.04 | 0.002 | [22] |
| E. coli | Glycerol | Shake flask batch | 2.50 | 0.350 | [20] | |
| Carbon chain derivation pathway | Candida tropicalis | Glucose | 5 L bioreactor Fed-batch |
12.10 | 0.160 | [21] |
| Reverse adipic acid degradation pathway | T. fusca | Glucose | Shake flask batch | 2.23 | 0.005 | [23] |
| E. coli | Glycerol | 5 L bioreactor Fed-batch |
68.00 | 0.425 | [9] | |
| E. coli | Glucose | 5 L bioreactor Fed-batch |
22.30 | 0.250 | This study |
虽然本研究基于RADP途径对大肠杆菌进行代谢工程改造以及发酵工艺优化，但是现阶段己二酸产量和转化率依然与已报道的文献和理论值存在差距。导致这一结果可能的原因有4个：(1) 路径酶的表达量不足。已报道最高产量的工程菌株采用E. coli BL21(DE3)为底盘菌株，通过T7启动子强化表达己二酸生物合成的路径酶。与之相比，本研究仅通过RBS筛选调节了关键限速酶的表达量，而对路径酶采用表达强度较弱的启动子pTet和pTrc，致使合成路径的表达未得到强化；(2) 关键限速酶的催化活性不足。本研究目前仅鉴定了路径中的关检限速酶，尚未对限速酶进行酶工程改造；(3) 发酵工艺不同。已报道工程菌株采用甘油和葡萄糖双底物发酵工艺，同时所使用的培养基富含大量蛋白胨和酵母粉，可能更有利于己二酸的合成；(4) 菌株上游路径的改造靶点不同。已报道最高产量的工程菌株已完成了对上游路径的改造，阻断了副产物乳酸和丁酸合成代谢途径，减少了碳代谢流的损失。
为了进一步提高己二酸的产量，在后续的研究中可以从以下4个方面进行探索：(1) 提高限速酶的活力：通过酶工程的手段对关键限速酶进行蛋白质改造从而提高酶的催化活性将有利于己二酸的生物合成；(2) 强化己二酸的合成路径：为了进一步提高路径的合成效率，通过启动子工程强化路径酶的表达可使己二酸的产量得以提高；(3) 强化己二酸的外运能力：己二酸外运能力不足是抑制产物高效合成的重要因素之一。通过基因组挖掘技术筛选己二酸的外运蛋白将有助于提高己二酸的产量；(4) 新靶点的挖掘和改造：随着系统生物学在代谢工程领域的广泛应用，通过组学技术对己二酸生产菌株进行分析，从上游路径中筛选出新的改造靶点将有助于提升菌株的整体生产性能。
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表1(Table 1)
