生物工程学报  2023, Vol. 39 Issue (6): 2390-2409 |
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随着全球工业化发展，越来越多的温室气体被排放到大气中，其中有60%的温室气体是二氧化碳(carbon dioxide, CO2)[1]，因此，CO2的资源化利用对于保护环境、节约能源具有重要意义。近年来，热能和电能被广泛用于转化CO2生产化工燃料和化学品，主要包括化合转化法、循环燃烧法和分解法[2]。然而，由于CO2中的碳处于最高氧化态，使得CO2在热力学上非常稳定，并且C=O键能(750 kJ/mol)远高于C–C (336 kJ/mol)、C−O (327 kJ/mol)或C−H (441 kJ/mol)[3]，因此CO2的高效活化通常需要耗费大量能量。解决上述问题的一种理想方式是利用可再生光能去催化CO2转化为燃料和化学品，不仅可以降低温室效应，还能缓解能源危机，因此，利用光驱动CO2资源化利用具有非常重要的意义[4]。
光驱动CO2还原生产化学品是利用光生电子驱动还原力再生，并以此还原CO2生产化学品的反应过程。传统的光化学CO2还原技术很难将CO2还原为复杂的分子，不仅如此，其使用的光催化材料往往需要高温煅烧且制作成本较高。相较于传统光化学催化，生物光催化法不仅显示了环境友好特征，而且降低了成本和操作难度，还提高了产品的多样性。目前，利用生物法光能转化生产化学品的方式主要有2种：(1) 借助植物、藻类以及其他光合生物的光合作用，在自然光系统中利用太阳能将水(H2O)和CO2转换为生物质。例如，在集胞藻(Synechocystis) PCC6803中，基于卡尔文循环(Calvin-Benson-Basshamcycle, CBB循环)设计以CO2为碳源的正丁醇生物合成路径，并通过优化路径酶的表达和增强乙酰辅酶A的利用率，有效提高了正丁醇的产量[5]。虽然借助代谢工程策略调控植物或藻类的代谢过程，可以增强CO2的固定效率、加快积累生物质，但是光能到化学品的转化效率仍然比较低，并且吸收光谱范围受到限制。(2) 通过构建人工光合系统，实现光驱动CO2还原合成化学品。例如，在光合微生物热乙酸醋杆菌(Moorella thermoacetica)细胞表面原位组装CdS纳米颗粒(CdS nanoparticles, CdS NPs)，利用CdS NPs吸收光产生电子，提供还原力，实现在Wood-Ljungdahl (WL)路径中还原CO2为乙酸[6]。自养微生物受益于自身具有的CO2代谢路径，但是其代谢网络繁杂，生长周期较长，难以满足工业化需求。除了自养微生物，异养微生物也可以用来构建人工光合系统。例如，在大肠杆菌(Escherichia coli)中构建CO2固定路径HWLS [(包括甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase, FDH)、甲酰基四氢叶酸环水解酶(formyltetrahydrofolate cyclohydrolase, Fhs)、亚甲基四氢叶酸脱氢酶(methylenetetrahydrofolate dehydrogenase, FchA)、亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase, FolD)、甲醛裂合酶(formaldehyde lyase, FLS)和二羟基丙酮激酶(dihydroxyacetone kinase, DHAK)]，通过表面组装CdS NPs并在膜表面锚定海洋浮游生物SAR86的视紫红质蛋白构建人工光合系统，实现了高效固定CO2生产L-苹果酸[7]。模式异养微生物不仅代谢网络清晰，便于CO2固定系统的构建，而且生长周期比较短，利于进行工业化生产。然而，模式异养微生物也存在鲁棒性较弱、难以承受大的代谢改造负荷等问题。
本文主要围绕CO2资源化利用过程中的关键问题，从酶杂合系统、生物杂合系统以及杂合系统应用3个方面，系统阐述了光驱动CO2还原合成化学品的代谢工程与合成生物学策略，并展望了人工光合系统进一步发展与应用的方向。
1 酶杂合系统驱动CO2还原天然光合作用主要由光系统Ⅰ和光系统Ⅱ构成，两个光系统通过“Z图式”捕获光产生电子，用于固定CO2合成生物质[8]。与天然光合作用不同，光-酶杂合系统最早由氢化酶与菠菜叶绿体杂合进行光驱动产氢开始。随着科技的发展，研究人员逐渐把眼光放在了半导体-酶光合系统上[9]，利用光催化剂吸收光，为CO2还原酶提供额外的还原力，或直接将光生电子转移到CO2还原酶上，激活氧化还原反应，从而实现CO2的高效还原。然而，电子传输效率和半导体毒性是影响酶催化活性和稳定性的关键因素。因此，需要通过提高酶的催化活性和稳定性来增强酶杂合系统驱动CO2还原的效率(图 1)。
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| 图 1 酶杂合系统驱动CO2还原 Fig. 1 CO2 reduction driven by enzyme hybrid system. A：以半导体作为光催化剂，接收光子并将其转化为电子，最终与酶活性位点结合，还原CO2. B：以二维纳米片、三维半导体、染料分子或经过修饰后的半导体作为光催化剂，辅因子介导电子转移到酶活性中心，还原CO2. C：利用金属有机框架或微囊膜等区室化手段保护酶的稳定性[23] A: The semiconductor is used as a photocatalyst to receive photons and then convert them into electrons that can eventually combine with the active site of the enzyme to reduce CO2. B: With two-dimensional nanosheets, three-dimensional semiconductors, dye molecules or modified semiconductors as photocatalysts, electrons are transferred to the active center of the enzyme for reducing CO2, which is mediated by cofactors. C: The stability of enzymes is protected by metal-organic framework or microcapsule[23]. |
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将温室气体CO2转化为有机分子是近年来研究的热点，利用光能高效还原CO2是非常理想的策略。然而，光催化还原CO2的核心是如何将光催化剂的光生电子与CO2还原酶连接。目前，采用的连接方式主要有2种。对于具有直接接受电子受体辅基(例如，[Fe-S]簇和黄素)的酶(图 1A)，其催化活性位点可以直接作为光生电子的受体，参与CO2还原反应[8]；对于大多数氧化还原酶，它们不具有直接接受电子的辅基，则需要借助辅因子转移由光催化剂产生的电子，CO2还原酶再利用辅因子进行反应，从而提高酶催化还原CO2的活性(图 1B)。
1.1.1 直接与酶活性位点结合绿色高效地将CO2还原为化学品是实现绿色可持续发展战略的有效手段之一。然而，由于光催化剂与酶分子之间的非良性连接，导致酶的催化效率偏低。为了减少光催化剂与酶分子之间电子消耗，光生电子与酶直接结合应运而生(图 1A)，其中参与CO2还原的酶主要包括一氧化碳脱氢酶(carbon monoxide dehydrogenase, CODH)和甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase, FDH)[10]。首先，由于CODH内部具有活性位点[Ni4Fe-4S]，光催化剂产生的电子能够与[Ni4Fe-4S]直接结合，从而促使CODH还原CO2。借助聚甲基丙烯酸包裹的银纳米簇(AgNCs)作为光敏剂，并结合厌氧微生物嗜氢碳热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)中的CODH与TiO2组成酶杂合系统，将CO2以20/s的转换数高效还原为CO[11]，量子产率可达到1.5%。与此相似的是，利用CODH与光催化剂CdS纳米晶体进行组装亦能将CO2还原为CO，每个酶分子的平均转换数为1.2/s[12]。其次，除了CODH含有[Fe-S]外，金属结合的FDH也含有[Fe-S]，也可以直接接收电子。通过将含W基的FDH与光催化剂制作成光电化学电池用于转化CO2合成甲酸，甲酸的平均合成速率为0.78 μmol/h，法拉第效率达到了77%[13]。同样，以光电化学电池将PSⅡ和FDH连接，利用光驱动CO2还原为甲酸，法拉第效率为78%[14]。此外，含Mo基的FDH也具有[Fe-S]，可以与光催化剂激发的电子相结合还原CO2。通过将Mo-FDH固定到碳电极上，催化CO2还原为甲酸的法拉第效率达到了99%[15-16]。综上所述，当光(电)催化剂吸收光产生电子时，[Fe-S]簇会与之结合，从而使FDH直接利用光生电子还原CO2产生化学品。目前，仅仅利用光能驱动CO2还原为化学品的效率仍然较低，虽然在电化学技术辅助下，系统的法拉第效率有着明显的提高，但是产生化学品的种类比较单一。未来，将电化学工程与合成生物学融合，进一步推动细胞对电子的摄取能力，利用可再生电子供体供给光电催化反应，从而产生更加多样的高附加值化学品。
1.1.2 辅因子介导电子转移自然界中大部分酶的活性中心往往都深埋在酶分子内部，并且没有[Fe-S]簇，不能直接接收外源电子。在反应过程中，需要加入辅因子来协助电子传递到酶活性中心(图 1B)，已经成为进一步还原CO2不可缺少的部分。通常CO2还原反应需要NADH提供还原力才能正常进行。以生物学理论为基础，结合化学工程技术提高NADH再生效率的方法，主要包括：(1) 以二维纳米材料作为光催化剂，增强NADH再生，同时与CO2还原酶进行耦合，从而提高CO2转化为化学品的效率。例如，基于二维(2D) TaS2纳米片和集成电子介质[Cp*Rh(phen)Cl, M]的功能化结合，构建捕光系统(TaS2-PEG-GR-M)，可以在可见光条件下显著提高NADH的再生效率，促进FDH还原CO2产生甲酸[17]，甲酸的合成速度可达17 mmol/(L·h)。(2) 以三维纳米材料作为光催化剂，提高CO2转化为化学品的效率。例如，通过对纳米半导体进行组装改造形成中空纤维膜，借助中空纤维膜装载酶并与TiO2结合形成UV/TiO2光催化系统，进行NADH再生[18]，经过一系列优化后，最终甲醛的得率达到了6.5%。(3) 构建纳米壳包裹核的半导体材料，通过对其进行修饰，以此来强化NADH再生。例如，以光敏剂2-氨基对苯二甲酸为核-Zr6O8团簇为壳，构建核壳金属有机骨架(metal-organic skeleton, MOFs)，MOFs上的[Cp*Rh(bpy)H2O]2+作为电子转换载体，将电子用于NADH再生[19]，使得电子利用率提高了2.3倍。(4) 利用染料分子作为光敏剂增强CO2转化效率。例如，采用卟啉作为光敏剂与M功能化结合，形成光催化剂[20]，用于还原CO2合成甲酸，催化4 h甲酸的积累量可以达到100 μmol。上述研究策略，有效地增强了NADH再生，提高了CO2还原效率，对CO2的资源化利用具有重要意义。虽然半导体催化剂相对更加稳定，但是半导体往往具有毒性，在一定程度上降低了酶的催化效率。未来还需要继续探索能够低毒或无毒且具有良好生物相容性的光催化剂，用于还原力再生。
1.2 固定化酶增强酶的稳定性酶在最适条件下，能够高效催化目标反应，实现目标产物的快速合成。然而，在酶杂合系统中，由于光催化模块引入了电子空穴、活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)和金属有机配合物等，会对酶产生抑制作用，从而严重影响了酶的催化活性。为了解决上述问题，研究人员利用介孔涂层、仿生微囊膜等固定化酶策略，将光催化模块产生的有害物质与酶催化模块相分隔，提高酶的催化稳定性(图 1C)。
1.2.1 多孔涂层固定化酶酶是人工催化剂设计的灵感来源，当与(光)电极集成时，酶虽然可以以接近100%的选择性转化合成一系列产品，但是酶的稳定性往往不是很强。因此，提高酶的稳定性成为新一轮攻克难点。在酶杂合系统中，光催化过程产生的电子空穴以及活性氧自由基会影响氧化还原酶的催化活性。利用区室化策略将光催化剂与酶进行物理分离，成为保护酶催化活性的有效手段。多孔材料不仅可以实现光催化剂与酶的物理分离，而且还可以维持两者之间的物质和能量传递。目前，采用多孔材料增强酶稳定性的策略(图 1C)，主要包括：(1) 借助金属有机框架(MOF)，保护酶在非原生环境中的反应特性，以此促进CO2的还原。例如，采用铑复合物与分级介孔NU1006金属有机框架相结合进行封装FDH，在MOF中实现了NADH再生，从而促进了FDH将CO2还原为甲酸，在24 h时甲酸产量达到144 mmol/L，平均转换数达到865/h[21]。另外，利用能够固定多酶的MOF材料[如类沸石咪唑骨架-8 (ZIF-8)]固定甲醇脱氢酶和甲醛脱氢酶，并结合光催化剂5, 10, 15, 20-四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)，成功构建了光催化多酶级联系统。该系统利用TCPP催化NADH再生，促进CO2的高效还原，甲醛转化率最高可达77%[22]。(2) 利用TiO2作为掺杂涂层，既可以确保电子传输，还能够有效避免酶的失活。例如，在石墨氮化碳(GCN)表面附着(MH/TiO2)介孔涂层，可以避免乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase, ADH)的失活，使ADH酶活保存率高达76%，并且乙醇的合成效率达到11 mmol/(L·h)[23]。(3) 同轴静电纺丝技术，即在中空纳米纤维的管腔中加入酶，借助静电作用吸附于管腔内，从而增强酶的稳定性。例如，通过在聚氨酯中空纳米纤维管腔中组装甲酸脱氢酶/甲醛脱氢酶/甲醇脱氢酶(消耗NADH)与谷氨酸脱氢酶(产生NADH) (图 2)，实现NADH的供需平衡，促进了CO2还原为甲醇，使得甲醇得率达到了103%[24]，其中，甲酸脱氢酶(FateDH)、甲醛脱氢酶(FaldDH)、甲醇脱氢酶(ADH)和谷氨酸脱氢酶(GDH)的比酶活分别为2.9、2.7、29和19 U/mg。上述研究结果表明，将光催化剂与酶进行区室化分割，有效保护了酶的催化活性、增强了NADH的再生效率，实现了酶杂合系统催化CO2还原，为CO2的资源化利用提供了借鉴。未来可以借助导电“软”聚合物封装酶，从而将电荷精确地连接到酶的末端受体，避免光催化剂与酶的直接接触，为进一步提高酶稳定性提供了一种可行的方法。
在自然光合作用系统中，参与光催化的功能模块被精准地划分在类囊体膜上进行光反应，再通过暗反应利用CBB循环将CO2转化为生物质，保证了酶催化反应之间的高效协同作用，从而保护了酶催化活性免受光诱导空穴和ROS的损害[25-26]。在人工仿生光合系统中，酶的稳定性成为阻碍光能到化学能有效转化的挑战之一。受天然类囊体的启发，构建人工微囊膜不仅可以实现光催化剂和酶的有效连接，而且还可以实现光催化与酶催化两个模块在空间上的有效分割，从而避免空穴和ROS造成的酶催化活性损失(图 1C)。例如，利用铑复合物与噻吩修饰的氮化碳(TPE-C3N4)耦联组成光催化剂，同时模拟叶片类囊体将甲酸脱氢酶(FDH)包裹在金属-有机框架(MOF)中构建人工光合系统。光激发TPE-C3N4产生的电子促进了NADH再生，从而增强了FDH催化的还原反应，最终以1.9 mmol/(L·h)的合成速率将CO2还原为甲酸[27]。同样，基于菠菜类囊体膜，构建能量模块(TEM)，实现了ATP和NADPH再生。此后，采用油包水微滴封装TEM和巴豆酰辅酶A/乙基丙二酰辅酶A/羟丁基酰辅酶A (CETCH)循环，构建微流控人工光合系统将CO2还原为乙醇酸[28]，使CO2转化效率达到了3.5%。综上所述，通过模拟天然类囊体的光合作用进行CO2还原，可以有效避免光诱导空穴和ROS对酶催化模块的损害，从而提高酶稳定性。未来通过开发新的光活性酶，避免酶与光催化剂之间的不相容性，可以提高酶稳定性，进而增强杂合系统的光合效率。
2 生物杂合系统驱动CO2还原与酶杂合系统的无细胞体系不同，生物杂合系统具有更高的稳定性，并且可以自我修复和自我增殖。然而，生物杂合系统也存在一定的不足，例如：大部分生物不能直接利用光能；生物的代谢网络较为繁杂；以CO2为原料生产化学品时，通常还原力和能量的供应不足[29]。因此，生物杂合系统可以通过增强生物捕光能力、优化还原力供应和改善能量再生等策略，利用光能将CO2转变为化学品(图 3)。
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| 图 3 生物杂合系统驱动CO2还原 Fig. 3 CO2 reduction driven by biological hybrid systems. A：利用路径改造、基因编辑、共培养、纳米颗粒沉积和表达捕光蛋白等策略，增强生物光捕获能力. B：通过修饰与改造纳米材料增强电子流，增强还原力再生. C：强化胞内可用辅因子. D：通过设计光驱动质子泵、构建仿生能量马达和优化能量分配系统，实现能量再生[62] A: Enhancing the ability of biological light capture though pathway modification, gene editing, co-culture, nanoparticle deposition and expression of light-trapping proteins. B: Enhancing the regeneration of reduction power by modifying nanomaterials to enhance electron flow. C: Enhancing the availability of intracellular cofactors. D: Energy regeneration by designing light-driven proton pump, constructing biomimetic energy motor and optimizing energy distribution system[62]. |
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植物通过叶绿体中的光合色素进行捕光，经过电子传递链，最终将光能转化为有机物。除了植物和光合微生物之外，大部分生物不具有捕光能力。因此，提高生物捕光能力是实现CO2还原的基础，采用的主要策略有强化光吸收、移植光合系统和细胞光敏化等(图 3A)。
2.1.1 强化光吸收天然光合微生物(如微藻)作为重要的光合固碳微生物，能够利用自身的光系统捕获光能，实现了全球50%以上的CO2还原。虽然微藻是极具潜力的新型微生物光合平台，但是其光能转换效率仍然比较低(3%−9%)[30]，不能很好地满足工业化需求。因此，需要借助代谢改造方法强化微藻光合效率，采用的策略主要包括2种：拓宽藻类吸收光谱和改造藻类捕光天线(图 3A)。首先，利用代谢工程策略调控色素分子合成，从而拓宽光谱吸收范围，提高光子捕获能力，强化光合效率。例如，在无氧光合类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)中，借助细菌叶绿素(bacterial chlorophyll, BChl)合成路径，可以以叶绿素a (chlorophyll a, Chl a)作为前体合成BChl。通过基因编辑技术，在敲除消耗Chl a相关基因的基础上，过表达源自蓝藻(Synechocystis sp.) PCC6803的Chl a特异性酶(ChlG)，实现了Chl a的积累，弥补了600–800 nm的吸收光谱，从而拓展了R. sphaeroides的光谱吸收范围，达到了375−900 nm[31]。其次，通过截断捕光天线，可以使单个细胞避免因过度光吸收而造成光损伤，从而增强光合效率。例如，通过敲除蓝藻Synechocystis sp. PCC6803的cpc基因，截断蓝藻叶绿素的捕光天线，避免了单个细胞对光能的过度吸收，同时增强了系统的整体光吸收能力，工程菌株Synechocystis sp.PCC6803 Δcpc的生物质积累量比野生型提高了57%[32]。同样，在蓝藻(Synechococcus elongatus) PCC7942中过表达内源蛋白NblA也能够达到截断捕光天线的目的，从而也增强了整体的光合作用，最终生物量提高了20%[33]。综上所述，通过代谢工程改造天然光合微生物的捕光系统，可以实现以光为能源、CO2为碳源绿色生物合成生物燃料和高价值化学品。未来降低非光化学猝灭系数(non-photochemical quenching coefficient, NPQ)和开发吸收远红外色素分子将成为提高光合微生物光合效率的关键。
2.1.2 移植光合系统光合微生物虽然可以以CO2为原料合成多种化学品，但是CO2的特异性还原效果仍然不能满足未来的工业化生产需求。相比之下，异养微生物虽然不具备光系统，但是具有较大的工业化潜力。因此，通过将自养微生物的捕光系统移植到异养微生物中，并构建有效的CO2固定路径，可以获得以光为能源、CO2为碳源的人工微生物。近年来，质子泵视紫蛋白(proton pump rhodopsin, PPRs)作为热门的捕光系统，通过将不同特征的PPRs引入非光合作用微生物(图 4A)中[34]，可以赋予宿主微生物捕光能力，从而驱动生物质的积累。例如，基于古细菌(Haloterrigena turkmenica)的视紫红质(dR)，开发了一种新型的、具有更高质子泵活性的视紫红质(R3)。通过在E. coli中引入R3，可以使E. coli细胞膜内外形成质子梯度驱动ATP合酶合成ATP，最终使乙酸的比生产速率提高了1.24倍[35]。上述将能量再生模块与CO2固定路径(例如：CBB循环)相耦联的策略，为提高固碳效率提供了一种有效的方案。除此之外，在异养微生物体内合成完整的叶绿素合成路径，也可以使异养微生物能够进行光合作用。例如，通过在E. coli中构建完整的Chl a生物合成途径，并结合源自紫色光合细菌(Rubrivivax gelatinosus)的环化酶(AcsF)[36]，最终成功地将内源性原卟啉Ⅸ转化为Chl a。上述研究为以工业模式菌株E. coli为底盘，在胞内设计人工CO2固定路径或引入异源CO2固定路径，促使异养微生物向光合自养微生物转变开辟了道路。
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| 图 4 构建生物杂合系统 Fig. 4 Building a hybrid system. A：移植光合系统增强生物捕光能力. B：生物被膜吸附CdS NPs光敏化细胞 A: Enhancing the ability of light harvesting by transplanting photosynthetic systems. B: Adsorbing CdS NPs on biofilm to photosensitize cells. |
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微生物光敏化是微生物细胞与光敏剂以原位沉淀、静电吸附、表面展示、原位矿化等方式连接，使细胞能够利用光能合成化学品。为了实现微生物光敏化，采用的策略主要包括搭建纳米生物杂合体、构建细菌共生系统等。目前，CdS[5, 37-38]、CdTe[39]、Au(NCs)[40]和InP[41]等纳米材料已经用于纳米生物平台的构建。例如，通过在E. coli中融合表达由半胱氨酸(Cys)所组成的、对Cd2+和S2–具有强亲和力的多肽(A7)与CsgA，构建了功能性生物被膜，促进了CdS在E. coli细胞膜上的原位矿化，成功实现了细胞光敏化(图 4B)。在此基础上，光驱动生物杂合系统产生的电子可以促进NADH再生，为FDH还原CO2生产甲酸提供还原力。在实验室条件下，CO2还原为甲酸的合成速率达到了0.11 mmol/(L·h)，相应的量子产率约为0.13%[42]。虽然纳米生物杂合体加速了电子传输，提高了细菌合成效率，但是纳米材料与微生物之间存在不相容性，容易导致细胞毒性[43]。为了解决上述问题，研究人员进一步开发了细菌共生系统。例如，通过共培养沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)与巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)，前者作为光敏剂驱动后者将CO2直接转化为CH4[43]，最终甲烷的合成速率达到了4.7 μmol/(L·h)。综上所述，利用纳米生物杂合体和细菌共生系统，实现了微生物细胞的光敏化，改善了光能驱动CO2还原合成化学品的效率。因此，未来需要继续开发稳定性高且安全性好的光敏剂，进一步提高光合效率。
2.2 优化还原力供应微生物体内的代谢反应需要消耗大量的还原力。此外，微生物在还原CO2时也需要大量的还原力供应，从而容易引起胞内还原力供给不足的问题[44]。因此，通过优化辅因子再生和扩大胞内电子容量(图 3B、3C)，不仅可以克服还原力供应不足的问题，而且还有利于提高CO2固定效率。
2.2.1 优化辅因子再生辅因子再生不仅能够维持细胞稳态，而且参与了目标产物合成，因此强化胞内NADH再生是提高酶/微生物细胞CO2还原效率的关键环节。常用的策略主要有增强单一辅因子的含量和提高非典型辅因子的转化等(图 3B)。首先，将胞内NADH特异性转化为NADPH，可以有效增强集胞藻偏好的NADPH含量，从而提高集胞藻代谢反应中辅因子的供应。例如，通过在Synechococcus elongatus PCC7942中表达源自Lactobacillus bulgaricus ATCC 11842的d-乳酸脱氢酶(LdhD)，将NADH逆转为集胞藻偏好的NADPH，使d-乳酸产量增加了3.6倍[45]。其次，开发非典型辅因子，如烟酰胺单核苷酸(NMN+)，也可以支持多种氧化还原反应。例如，基于酶动力学分析，通过对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(BsGDH)进行改造，将NAD+和NADP+转换为NMN+，在体外实现了以高转换数(约39 000)进行氧化还原反应[46]。在此基础上，利用改造后的E. coli进行识别NMN+，有效改善了胞内代谢流，实现了E. coli的生长。该体系可以有效避免代谢辅因子和底物的损失，为合理利用胞内资源增强CO2固定效率提供了有效手段。综上所述，通过调控微生物细胞对辅因子的偏好性，可以有效增强胞内还原力再生，从而促进化学品的合成。未来可以继续开发更加稳定的人工烟酰胺辅因子代替昂贵且不稳定的NADH，有利于进一步提高光能到化学品转化效率。
2.2.2 胞内电子扩容微生物细胞内的电子容量直接影响NADH的再生效率，进而影响CO2的还原效率。为了使胞内有足够的电子流用于NADH再生，主要采用以下2种策略：通过耦合无机材料直接利用光生电子实现NADH再生；通过抑制无机材料光生电子与空穴的重组，增加电子利用效率，实现还原力的高效供应(图 3C)。一方面，可以利用无机材料吸收光子产生电子并将电子传递到胞内用于再生NADH。例如，通过耦合InP与敲除葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因(zwf1)的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) Δzwf1，构建了S. cerevisiae Δzwf1-InP杂合系统，实现了光生电子增强胞内NADPH再生，有效改善了莽草酸(shikimic acid, SA)合成路径的碳代谢流，使光到SA的转换效率达到了1.6%[47]。在此基础上，未来可以在S. cerevisiae Δzwf1-InP中引入异源CO2固定路径(如还原三羧酸循环或3-羟基丙酸双循环)，有望实现光驱动酵母细胞以CO2为碳源进行化学品的合成。另一方面，抑制光生电子与空穴的重新组合也是一种提高胞内电子容量的有效策略。例如，在氧化铝表面引入孔结构，形成表面缺陷型介孔-Al2O3 (meso-Al2O3)，可以有效滞留光生电子，达到再抑制电子与空穴重组的目的，进而延长光生电子的寿命。通过耦合meso-Al2O3与E. coli，构建生物杂合系统，获得了长寿命的光生电子，提高了胞内NADPH水平[48]，最终使法尼烯生物合成量达到了1 816 mg/L，合成效率提高了1.0倍。在此基础上，未来可以利用光合自养微生物与光伏材料进行耦合，提高CO2到多种化学品的转换效率，最终实现光驱动高附加值化学品的高效合成。
2.3 改善能量再生光驱动CO2转化为化学品需要大量的能量参与反应，而且在此过程中微生物的生长也离不开能量的供应。在工业条件下，高效转换CO2合成化学品需要补充充足的能量，因此限制了工业发酵转化CO2合成化学品的效率。未来解决上述问题，需要开发人工的能量合成系统为工业发酵提供额外的能量供应，采用的策略主要有3种：设计光驱动质子泵、构建仿生能量马达和优化能量分配系统(图 3D)。
2.3.1 设计光驱动质子泵视紫红质作为一种光敏蛋白，广泛存在于海洋微生物中，例如浮游生物和嗜盐菌中，它能够在膜内外产生质子梯度，进而用于ATP合酶合成ATP[49]。视紫红质作为光驱动质子泵已被应用于微生物细胞的能量再生，如蓝藻和大肠杆菌[50]。然而，视紫红质的引入会增加微生物细胞的代谢负担，从而影响了能量的再生效率[51]。为了解决上述问题，采用策略主要有2种：(1) 仿生类囊体驱动ATP合成(图 3D)。例如，通过组装构建以水凝胶PSII微球为核、F0F1-ATP合酶蛋白脂质体为壳的人工光合磷酸化系统，实现了光驱动PSII微球光解水产生质子梯度，并在ATP合酶的驱动下合成ATP[51-52]，使ATP的合成速率达到了1 100 nmol ATP/(mg Chl)。上述研究对于实现异养微生物CO2固定过程的能量自我供给具有重要意义。(2) 人工光合细胞器驱动ATP合成。例如，通过将源自嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)的ATP合酶与光转换器视紫红质PR (源自γ变形杆菌Gamma proteobacterium)和PSⅡ系统(源自菠菜Spinacia oleracea)组装为蛋白脂质体，构建了人工光合细胞器，可以将产生的ATP用于驱动碳固定过程合成草酰乙酸[53]。虽然上述研究实现了胞内能量代谢的自我供应，但仍需要进一步减少胞内的非必要能量代谢。例如，通过阻断代谢副产物的合成，进一步减少能量消耗，增强目的产物的合成。
2.3.2 构建仿生能量马达以生物系统为灵感来源，模仿自然界光合作用，构建可以再生生物能量的超分子系统，即仿生能量马达。目前，开发仿生能源马达的有效策略，主要包括：激活天然能量马达、利用替代电子流AEF路径[54]和设计人工能源马达[29] (图 3D)。首先，ATP合酶作为一种天然的能量马达，通过氧化磷酸化和质子梯度驱动ATP合酶的光合磷酸化可以产生ATP[55]。例如，借助沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris) CGA009基因组代谢模型，模拟分析光合作用、CO2固定过程和氧化还原态质体醌之间的相互作用关系，发现醌的氧化速率与ATP的合成速率呈正相关。因此，可以通过调节醌氧化还原态，增强ATP的合成速率，进一步提高CO2固定效率，从而实现有效利用光能合成生物质[56]。其次，利用AEF途径供给更多的ATP。例如，植物类囊体具有典型的堆积结构，为了促进能量的产生，一方面可以利用人工堆砌类囊体膜协调线性电子流与循环电子流的比例，从而在无净NADPH条件下产生ATP[57]；另一方面，可以通过表达外膜细胞色素刺激质体醌(PQ)将多余的电子导向光系统Ⅰ (PSI)，从而实现循环电子转移(CET)。例如，通过在聚球藻(Synechococcus elongatus) UTEX2973中表达源自地杆菌(Geobacter sp.)的外膜电子转运蛋白(OmcS)，刺激质体醌(plastoquinone, PQ)将多余的电子传递到PSI，从而实现循环电子转移(cyclic electron transfer, CET)，促使胞内ATP、生物量积累和D-乳酸产量分别提高了30%、60%和4倍[58]。最后，设计人工能量马达合成ATP。例如，通过将源自嗜盐菌(Halobacterium salinarum)的视紫红质融合到Au-Ag纳米棒组装的等离子胶囊(CCs)表面，构建了人工能量马达。在光照下，人工能量马达可以产生电化学梯度，进而驱动能量合成[59]，最终ATP的合成速率达到了540 nmol ATP/(h·mg)。综上所述，能量马达通过光驱动产生质子动力势，利用ATP合酶合成ATP。在ATP供应充足的条件下，未来需要提高纳米材料对生物反应的特异性，可以根据目标产物选择合适的生物催化剂，从而促进生物燃料或化学品生产。
2.3.3 优化能量分配系统在微生物细胞内，维持适当的ATP水平对于细胞的生理代谢尤其重要。过度强化消耗ATP的代谢路径，可能会扰乱胞内的能量水平，从而破坏细胞内稳态。为了缓解这种负面影响，需要构建能量分配系统补充额外的ATP[60]，常用的策略主要有增加细胞内能量池和设计动态调控系统。一方面，通过表达产生能量的代谢路径或者减少能量消耗的合成路径，可以达到增加胞内能量池的目的，以此来平衡胞内ATP水平[61]。例如，通过耦合中心代谢路径中产生ATP的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase, PCK)与CBB循环路径中消耗ATP的核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase, RuBisCO)，PCK反应为RuBisCO的CO2固定反应提供了足够的ATP，从而提高了CO2的固定效率，最终使得CO2固定效率提高了110%、苹果酸产量达到了387 μmol/L[62]。另一方面，调节细胞内的能量分配。例如，在沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)中表达改造后的NifD转录因子(源自Azotobacter vinelandii)，构建具有循环光合磷酸化的重组菌株合成ATP，使CO2转化为CH4的效率达到了86%[63]。除此之外，利用光伏材料与视紫红质两个集成系统供应能量(图 5)，也可以实现CO2的高效固定。例如，通过在E. coli中融合表达PbrR与OmpA蛋白，实现了在E. coli膜表面展示CdS NPs，促进了胞内NADH增加。同时，在膜表面锚定海洋浮游生物SAR86的视紫红质蛋白，光驱动产生质子梯度，促进了ATP合成。最终，使L-苹果酸的得率提高到了1.5 mol/mol[7]，达到了理论最高值。综上所述，通过调控胞内能量分配系统，可以缓解细胞的代谢负担，有效增强CO2固定效率。目前，虽然光驱动CO2转化为化学品已经取得了很多进展，但仍然不能满足工业化需求，未来还需要设计能量需求低的人工CO2固定路径，并能与光伏材料协同耦合，提高CO2的资源化利用效率。
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| 图 5 光伏材料与视紫红质集成系统供应能量和还原力 Fig. 5 Integrating photovoltaic materials and rhodopsin to supply energy and reducing power. |
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可再生能源的资源化利用已经成为社会可持续发展的必然要求。光能作为地球上最充足的可再生能源之一，实现光能的高效利用，将会为缓解能源危机开辟新的思路。然而，由于天然光合作用的效率比较低，限制了光能的高效利用。酶杂合系统(如光-酶系统[9])和生物杂合系统(如光-生物杂合系统[64])为转化CO2产生一碳化合物(C1)、生物燃料以及食品等高附加值化学品提供了新路径(图 6)。
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| 图 6 杂合系统应用 Fig. 6 The application of hybrid systems. 包括一碳化合物制备、生物燃料合成和生物食品生产 Including C1 compound production, biofuels biosynthesis and bio-based food production. |
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一碳化合物(C1)主要是指含有1个碳原子的小分子，主要包括CO2、CO、CH4、甲醇、甲酸等。借助酶杂合系统和生物杂合系统，进行光驱动CO2还原，实现了CO2向CH4、甲醇、甲酸等C1的转换。C1作为合成燃料以及其他化学品的重要原料，具有开发性强、回收率高等特点，对环境、经济和社会具有多重意义[65]。对于将CO2转化为CH4，通过以源自Halobacterium的紫色细胞膜为壳、掺杂铅的TiO2为核，构建半人工杂合系统，进行光驱动CO2还原，最终CH4的合成速率达到了56 μmol/h[66]。除此之外，借助镍-铜合金作为连接巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri, M.b)与CdS NPs的二元活性位点，构建生物杂合系统。利用二元活性位点增强了通向M.b的电子流，以12%的量子产率将CO2转化为CH4，CH4产量达到了79 μmol/L[67]。另外，利用一种新型的碳点功能化高分子碳氮化物(CDPCN)作为光催化剂，并与Methanosarcina barkeri耦合构建的生物杂合系统，可以将微塑料与CO2作为原料转化为CH4。在该系统的作用下，微塑料与CO2分别通过丙酮酸路径与CO2还原路径以近100%的特异性合成CH4，CH4产量达到了7.2 mmol/g[68]。对于将CO2转化为甲醇，借助甲烷氧化菌(Methylosinus trichosporium) IMV3011，以CO2和CH4为原料，甲醇产量最高可达到21 μmol/L[69]。对于将CO2转化为甲酸，借助均苯四甲酸二酰亚胺(diimide phthalate, PDI)与氮化碳(C3N4)组成的二维异质结作为光催化剂，以有机铑复合物[Cp*Rh(bpy)H2O]2+作为电子中间体，并与FDH进行耦合，构建酶杂合系统，提高了CO2转化为甲酸的合成速率，达到了1.3 mmol/h[70]。同样，以铑复合物作为电子中间体，利用氨基团(NH2)修饰的MOF (MIL-125-NH2)拓展吸收光谱，并与FDH进行耦合构建光酶系统，促进了光生电子的传递，加快了NADH再生，使CO2高效转化为甲酸的，甲酸合成速率达到了0.40 mmol/(L·h)[71]。
3.2 生物燃料合成生物燃料主要是指生物体利用光合作用产生的有机质，不同于石油、煤炭等不可再生能源，生物燃料是一种可再生燃料。生物乙醇是世界上公认的能够供应市场需求的燃料。自1978年美国启动微藻制生物柴油后，世界各国也相继开展微藻细胞工厂的建设。微藻借助脂肪酸合成路径在胞内积累油脂，最终油脂可以达到细胞干重的30%−70%，从而实现了高效生产生物柴油[72-73]。最近，以内部同心阴极(石墨颗粒)和外部隔室阳极(碳布)构建生物电化学系统(BESs)，通过在阴极富集一氧化碳营养菌(carboxydotrophic)，利用光电将CO2转化为生物燃料，最终乙醇的平均合成效率达到了76 mg/(m·d)[74]。
3.3 生物食品生产随着世界人口的不断增加，全球的粮食需求也越来越大，但是粮食产量受限于植物光合作用的能量转换效率。目前，大多数农作物对光能的能量转换效率只有3%[29]，甚至更低。因此，基于合成生物学原理，开发人工光合作用，提高生物的捕光效率以及能量转换效率，有利于最大化实现太阳光与CO2的资源化利用。最近，通过将光伏系统与两步电解槽系统进行组合，可以将CO2转化为乙酸，并进一步用于产蛋白酵母和产蘑菇真菌的培养，最终太阳能到食物的能量转换效率达到了生物光合作用4倍[75]。此外，通过将CdTe量子点与自养黄色杆菌(Xanthobacter autotrophicus) ATCC 35674进行混合培养，构建无机-生物杂合系统，借助胞内CBB循环固定CO2高效合成生物质，从而促进蛋白质的合成，最终在4 d内蛋白质产量达到了40 mg/L[39]，与植物产蛋白质的效率相当。
4 结论为了实现光驱动CO2还原，研究人员设计、构建、评估与优化了酶杂合系统和生物杂合系统，实现了CO2还原生产高价值化学品、生物燃料及食品等。然而，光驱动CO2还原制备化学品仍然存在许多不足之处：(1) 光能捕获效率低：生物捕光色素(如叶绿素和类胡萝卜素)只能捕获特定波长范围内(420−630 nm)的光[76]；(2) 电子传递效率弱：光生电子与电子空穴的重组，无机与有机界面的存在以及氧化还原介质的降解都会抑制电子传输效率；(3) 杂合系统相容性差：带有毒性的无机半导体与生物细胞耦合会导致生物细胞丧失活性。
因此，未来的研究重点主要聚焦于：(1) 优化生物-非生物界面电子传递模式，生物-非生物界面电子传递模式主要分为介导型和非介导型。在非介导型方面，从电子传递效率出发降低生物与非生物界面电子传输过程的损耗。例如，借助硅与TiO2纳米阵列，构建独立的捕光电极，再以卵形孢子虫(Sporomusa ovata)为生物催化剂，构建人工光合系统。最后，通过优化系统中电解质的pH，增强了电极向S. ovata的传输电子效率，实现了CO2的还原[77-78]。在介导型方面，采用较短的线性分子修饰纳米颗粒缩短纳米颗粒与生物界面距离，或者借助氧化还原介质创建人工电子传递路径从而增强电子转移效率[79]。在光酶系统中，利用NADH、MV2+和铑复合物等介质，辅助光生电子转移到酶活性中心。例如，以CdS量子点(CdS QDs)为核、鱼精蛋白-二氧化钛(PTi)为壳构建人工光合系统，利用铑复合物作为电子传递介质将光生电子转移到甲酸脱氢酶(FDH)的活性中心，使FDH更加有效地进行氧化还原反应，实现了CO2的还原[80]。(2) 开发生物相容性好的无机纳米材料用于组装杂合系统，提高酶的稳定性，从而加强光能到化学品的转化。例如，采用生物相容的钴磷(CoPi)作为光催化剂[81]，在光催化过程中会产生ROS等有害副产物。因此，细胞保护材料的运用也必不可少，例如沸石咪唑盐框架(zeolite imidazole salt frame, ZIF)和海藻酸水凝胶等。(3) 进一步挖掘与优化天然光合系统、设计新型人工光驱动催化系统、开发新型能量与还原力供给系统，实现光能到化学品的高效转化。例如，以设计的新型CO2固定路径HWLS为基础，借助CdS NPs作为光催化剂再生NADH、视紫红质作为能量供给模块再生ATP，有效提高了苹果酸的得率[7]。
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