生物工程学报  2023, Vol. 39 Issue (7): 2624-2633 |
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猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)感染引起的一种可造成新生仔猪高死亡率的重要传染病。该病于20世纪70年代首次发现于欧洲，后传入亚洲，并从2010年起在我国引发多起大规模暴发，造成感染仔猪90%以上死亡[1]，而且还会导致感染母猪的死胎、流产。PED已成为世界上最具破坏性的猪病毒性疾病之一，每年给我国养猪业造成巨额损失。
PEDV是单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科α冠状病毒属。通过系统进化树分析可将PEDV划分为GⅠ和GⅡ两种基因型，两种基因型又各自分为a、b两种基因亚型[2]。经典毒株CV777和DR13属于GⅠa亚型，细胞适应株属于GⅠb亚型[3]。我国现在的流行毒株主要是GⅡ基因型，GⅡ型比GⅠ型致病性更强，而且GⅡb亚型会导致仔猪高死亡率[4]。PEDV包含4个结构蛋白，分别是刺突蛋白(spike, S)、囊膜蛋白(envelope, E)、膜蛋白(membrane, M)和核衣壳蛋白(nucleocapsid, N)。S蛋白是PEDV进入细胞的关键，因此是中和抗体的主要靶点。S蛋白分为S1和S2两个亚基，位于S1亚基C端的受体结合区(receptor-binding domain, RBD)介导了病毒与细胞受体的结合。阻断RBD与受体结合即可有效防止病毒感染，因此RBD也是多个冠状病毒重要的疫苗靶抗原[5-7]。
疫苗接种是防控疫病传播的最主要手段，我国已上市的PED疫苗包括灭活和减毒活疫苗两种。但大部分是基于经典毒株制备，缺乏对当前流行毒株的交叉保护力，导致发病率依然居高不下。而且，疫苗接种主要采用交叉剂型两针免疫策略，即先减毒活疫苗初免再灭活疫苗加强免疫或先灭活疫苗初免再减毒活疫苗加强免疫，从而增加了接种成本和母猪应激风险。美国已获批的PED疫苗除灭活疫苗外，还有一种基于甲病毒技术的RNA颗粒疫苗，该疫苗被证明可促进母猪初乳和常乳中IgG和IgA的生成[8-9]。多种疫苗策略被用于新型PED疫苗的开发，包括亚单位疫苗[10-11]、病毒载体疫苗[12-14]、细菌/真菌载体疫苗[15-17]、核酸疫苗[18-19]和转基因植物疫苗[20-21]。多个新型疫苗展示了良好的保护效力，具有进一步临床应用的潜力。
本研究选择PEDV RBD作为疫苗靶抗原，制备了基于RBD单体和二聚体的mRNA疫苗，并在小鼠和妊娠母猪上评价了候选疫苗的免疫原性，证明单次免疫即可诱导良好的免疫应答，而且与活疫苗配合用作加强免疫，可使妊娠母猪获得高水平中和抗体，为PED mRNA疫苗的进一步临床开发应用奠定了基础。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 病毒和细胞PEDV NB-F71病毒分离自腹泻仔猪，经测序鉴定为流行毒株GⅡa基因型。非洲绿猴肾细胞(Vero)、人胚肾细胞(HEK293T)由本实验室保存。
1.1.2 主要试剂体外转录试剂盒HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit、RNA纯化试剂盒Monarch RNA Cleanup Kit和DNase I酶购自NEB公司；RNA加帽试剂盒Cap 1 Capping System购自近岸蛋白公司；RNA定量试剂盒Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit和转染试剂Lip2000购自Invitrogen公司；小鼠IFN-γ ELISpot试剂盒购自Mabtech公司；可电离脂质(Dlin-MC3-DMA)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、胆固醇和PEG-脂质(PEG2000-DMG)购自上海艾伟拓公司；HRP标记山羊抗兔IgG、HRP标记山羊抗小鼠IgG、HRP标记山羊抗猪IgG购自达科为生物技术有限公司；PED减毒活疫苗购自齐鲁动物保健品公司；PED灭活疫苗购自安徽东方帝维生物制品公司。
1.1.3 实验动物6周龄无特定病原体(specific pathogen free, SPF)级雌性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司。动物实验经中国科学院微生物研究所实验动物伦理委员会批准(批准号：SQIMCAS2022002)。
1.2 实验方法 1.2.1 转录载体的构建对PEDV流行毒株GⅡa (GenBank登录号：MH816969)和GⅡb (GenBank登录号：MF152604)的RBD区编码序列(Phe478–Asp640)进行哺乳动物源密码子优化。分别设计一个RBD单体(RBD-monomer, RBD-M)和一个GⅡa/GⅡb RBD异源二聚体(RBD-dimer, RBD-D)，二聚体两个RBD间隔一个甘氨酸/丝氨酸柔性链接；在单体和二聚体的5′端融合组织纤溶酶原激活因子(tissue plasminogen activator, tPA)信号肽以实现RBD的分泌表达，然后两端分别添加β-珠蛋白(β-globin)的5′非编码区(5′-untranslated region, 5′-UTR)和3′-UTR，3′-UTR后连接长度为110 bp的polyA尾。将设计的两个基因序列交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，并将目标基因序列通过Kpn I和EcoR I双酶切克隆入pBluescript Ⅱ-SK(+)载体，分别获得pBluescript Ⅱ-SK(+)- RBD-M和pBluescript Ⅱ-SK(+)-RBD-D两个质粒。
1.2.2 制备mRNA分别将两个质粒用BamH I单酶切，然后琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收纯化，获得线性化质粒。采用T7 High Yield RNA Synthesis试剂盒对线性化质粒进行体外转录，配制体系时将UTP替换为假尿嘧啶核苷酸，37 ℃反应1 h后，体系中加入1 µL DNase I酶再反应15 min，以去除体系中的线性质粒模板。将反应产物用Monarch RNA Cleanup Kit进行RNA纯化。将转录获得的mRNA继续进行加帽反应，采用Cap 1 Capping System试剂盒在RNA的5′末端添加7-甲基鸟苷帽结构(m7Gppp)，并对加帽RNA进行纯化。所有操作参照试剂盒说明书进行。
1.2.3 制备LNPs将可电离阳离子脂质(Dlin-MC3-DMA)、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearylphosphatidylcholine, DSPC)和PEG-脂质(PEG2000-DMG)以摩尔比50:38.5:10:1.5溶解于乙醇中，与溶于50 mmol/L柠檬酸缓冲液(pH 4.0)的mRNA溶液按照1:3的体积比通过微流体纳米混合器(NanoAssemblr)，组装成脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles, LNPs)。将组装的LNPs进一步用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)透析，超滤浓缩，0.22 μm滤膜过滤除菌，保存于含有2%蔗糖的PBS中。
1.2.4 鉴定LNPs采用透射电镜(JEM-1400, JEDL)和粒径仪对制备的LNPs进行粒径和均一度分析。使用1%终浓度的Triton-100对获得的LNPs进行破乳处理，可使LNPs包裹的mRNA释放到溶液中，采用Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit对溶液中的mRNA进行精确定量。通过计算破乳前后mRNA量的差值，除以总核酸量即得到LNPs包封率。
1.2.5 Western blotting分析将2 µg mRNA和4 µL Lip2000脂质体分别溶于100 µL Opti-MEM培养基并混合，转染汇合度达90%的HEK293T细胞，24 h后收集细胞上清进行SDS-PAGE，转膜到PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭，一抗用PEDV特异兔多抗，二抗用HRP标记羊抗兔IgG抗体，加显色液后用化学发光仪拍照。
1.2.6 小鼠免疫25只雌性BALB/c小鼠随机分为5组，每组5只，其中4组免疫组，一组PBS对照组。将制备的RBD单体和二聚体mRNA候选疫苗分别免疫小鼠(肌肉注射)，采用5 µg和15 µg 2个免疫剂量，共免疫2次，间隔4周，分别于0、2、4、5周采集尾血分离血清，检测抗体水平。免疫后5周，小鼠断颈处死取脾脏，分离脾细胞进行酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assay, ELISpot)鉴定。
1.2.7 妊娠母猪免疫选取辽宁某种猪场妊娠母猪10只，分为2组，每组5只。于产前7周接种PEDV流行毒株减毒活疫苗(LW/L株)，于产前3周分别接种RBD二聚体mRNA候选疫苗(50 µg)或流行毒株灭活疫苗(AJ1102株)。分别于产前3周和1周采血分离血清，检测抗体水平。
1.2.8 间接ELISA用包被液稀释原核表达的PEDV RBD重组蛋白至终浓度2 μg/mL，100 μL/孔，4 ℃，包被过夜；PBST洗涤3次；3% BSA，37 ℃封闭2 h；PBST洗涤3次；加入100 μL/孔梯度稀释的小鼠或猪血清，37 ℃反应1 h；PBST洗涤3次；HRP标记山羊抗鼠IgG或HRP标记羊抗猪IgG作为二抗，100 μL/孔，37 ℃反应1 h；PBST洗涤3次；加入显色液TMB显色10 min，加入终止液终止反应。酶标仪读取450 nm处吸收值。将阳性孔(≥2.1倍阴性平均读值)最大稀释倍数倒数定为ELISA抗体滴度。
1.2.9 中和抗体测定将采集的小鼠或猪血清56 ℃灭活30 min，用无血清DMEM培养基2倍梯度稀释至1:2 048，与含200 TCID50的PEDV NB-F71病毒等体积混合，并在37 ℃孵育1 h。将混合物转移到含有Vero单层细胞的96孔板中，置于二氧化碳培养箱中，37 ℃孵育5 d，观察细胞病变(cytopathic effect, CPE)。记录能抑制50%以上细胞出现CPE的血清最高稀释度，按Reed-Muench法计算中和抗体滴度(NT50)。
1.2.10 IFN-γ ELISpot由南京金斯瑞生物科技有限公司合成覆盖PEDV RBD蛋白序列的重叠15短肽(重叠11个氨基酸)。将分离的小鼠脾细胞用含10%胎牛血清的1640完全培养基稀释至2×105 cell/mL，然后加入预包被有小鼠IFN-γ抗体的96孔ELISpot板中；继续加入0.1 mL重叠短肽(10 µg/mL)，37 ℃孵育36 h。用PBS洗涤5遍。加入0.1 mL生物素化抗鼠IFN-γ抗体(1 µg/mL)，室温孵育2 h。用PBS洗涤5遍。加入0.1 mL链霉亲和素-HRP，室温孵育1 h，PBS洗涤5遍。加入TMB底物溶液显影，至出现明显斑点，用纯水冲洗终止反应。用ELISpot分析仪读取斑点数量，计算每106个细胞的斑点形成细胞数。
2 结果与分析 2.1 PED mRNA候选疫苗的制备和鉴定通过体外转录和封装，制备了两种包载有编码PEDV RBD mRNA的LNPs，分别为RBD单体(RBD-M)和RBD异源二聚体(RBD-D)。为了实现所表达蛋白分泌到细胞外，编码基因5′端融合了tPA信号肽，另外为增加mRNA稳定性，在编码基因两端还增加了帽子结构、UTR和一个长110 bp的polyA尾(图 1)。通过透射电镜检测制备的两种LNPs，可观察到LNPs呈球形颗粒形态(图 2A、2D)；粒径仪分析显示，RBD-M和RBD-D LNPs平均粒径分别为101 nm和106 nm，聚合物分散性指数(polymer dispersity index, PDI)为0.11 (图 2B、2E)。两者包封率均达到90%以上。mRNA转染Vero细胞后可实现RBD单体和二聚体表达并高效分泌至培养基上清液中，分子量比预期略大，应为RBD蛋白糖基化所致(图 2C、2F)。
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| 图 1 PED mRNA候选疫苗设计示意图 Fig. 1 Schematic design of PED mRNA vaccine candidates. |
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| 图 2 PED mRNA候选疫苗的鉴定 Fig. 2 Characterization of PED mRNA vaccine candidates. A, D: Representative transmission negative staining electron microscopy image of PEDV RBD-M and RBD-D mRNA-LNPs. B, E: Particle size of RBD-M and RBD-D mRNA-LNPs were determined by dynamic light scattering. C, F: Analysis of antigen expression by Western blotting. |
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将RBD单体和二聚体mRNA候选疫苗分别采用5 µg和15 µg两个剂量免疫BALB/c小鼠，并检测血清中结合抗体和中和抗体水平(图 3A)。免疫后，观察期内注射部位未出现局部炎症反应或其他不良反应。小鼠免疫后2周即可检测到RBD特异结合抗体(ELISA)和中和抗体(NT50)，免疫后4周抗体水平进一步升高，中和抗体滴度平均值分别达到113.2 (RBD-M, 5 µg)、255.2 (RBD-M, 15 µg)、344.4 (RBD-D, 5 µg)和429.2 (RBD-D, 15 µg)。加强免疫后抗体水平进一步提升，中和抗体滴度平均值分别达到220.2 (RBD-M, 5 µg)、431.4 (RBD-M, 15 µg)、552.8 (RBD-D, 5 µg)和836.0 (RBD-D, 15 µg)。相比RBD-D免疫原，相同剂量RBD-M诱导的抗体水平偏低，而且接种15 µg RBD-M诱导的抗体水平与接种5 µg RBD-D相当(P > 0.05)，提示RBD-D具有更好的免疫原性，需要的接种剂量更低(图 3B、3C)。结合抗体与中和抗体结果具有较好的相关性。另外，结果显示，只需单次免疫RBD-D mRNA候选疫苗即可在小鼠上获得较高水平的中和抗体，提示该候选疫苗有望开发成为一种单针免疫疫苗。为了评价疫苗诱导细胞免疫应答的能力，小鼠加强免疫后1周采集脾脏分离脾细胞，用RBD重叠多肽刺激后检测分泌IFN-γ的细胞数量，从而确认候选疫苗诱导产生的PEDV特异记忆性T淋巴细胞的数量。结果显示，4个免疫组小鼠均产生了PEDV特异细胞免疫应答，RBD-M (5 µg)组偏低，其他3组无显著性差异，不过RBD-D组分泌IFN-γ的细胞数量总体要比RBD-M组更高，结果与抗体反应相似(图 3D)，证明了mRNA候选疫苗可以在小鼠上诱导细胞免疫反应。
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| 图 3 PED mRNA候选疫苗在小鼠体内免疫原性评价 Fig. 3 PED mRNA vaccine candidates testing in BALB/c mice. A: Scheme of prime-boost immunization of BALB/c mice with doses of 5 or 15 µg of RBD-M or RBD-D mRNA vaccine candidates. Blood drops indicate blood sampling time points. B: PEDV-specific binding antibodies were assessed by ELISA. Dotted lines indicate detection limit. C: Neutralizing antibodies against the PEDV NB-F71 strain were measured. Dotted lines indicate detection limit. D: Spleens and splenocytes were collected at weeks 5 for IFN-γ detection by ELISpot after stimulation with PEDV RBD peptide pools. Data are shown as x±s (standard errors of means). P values were analyzed by Student's t test (ns: P > 0.05; *: P < 0.05; ***: P < 0.001). |
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为进一步评价mRNA疫苗在猪上的免疫原性，在妊娠母猪产前7周先免疫减毒活疫苗，4周后分别免疫RBD-D mRNA候选疫苗或灭活疫苗，对两种疫苗诱导的抗体水平进行比较(图 4A)。mRNA疫苗免疫后，观察期内注射部位未出现局部炎症反应或其他不良反应。结果显示，初免后4周，所有母猪可检测到结合抗体，80%的母猪中和抗体转阳，中和抗体平均滴度达到90.4。加强免疫后2周所有母猪中和抗体转阳，加强免疫前后抗体水平存在显著性差异。mRNA和灭活疫苗诱导的中和抗体平均滴度分别达到531.8和464.8，两个免疫组抗体水平无显著性差异(图 4B、4C)，提示mRNA可诱导与灭活疫苗相近的抗体水平。
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| 图 4 PED mRNA候选疫苗在妊娠母猪体内免疫原性评价 Fig. 4 PED mRNA vaccine candidates testing in pregnant sows. A: Flow chart of PED mRNA vaccines immunogenicity evaluation. B: PEDV specific binding antibodies were assessed by ELISA. Dotted lines indicate detection limit. C: Neutralizing antibodies against PEDV NB-F71 strain were measured. Dotted lines indicate detection limit. Data are shown as X±s. P values were analyzed by Student's t test (ns: P > 0.05; **: P < 0.01). |
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PEDV可感染各生长阶段的猪，引起严重肠道疾病，初生仔猪会导致80%?100%的死亡，断奶猪和育肥猪则会持续腹泻5?7 d，母猪会出现死胎、流产。因此控制PEDV感染具有重要意义。尽管减毒活疫苗和灭活疫苗已被广泛使用，但发病率依然居高不下。最主要的原因是已上市的大部分疫苗基于原始经典毒株(GⅠ基因型)开发，对于当前流行毒株(GⅡ基因型)缺乏交叉保护，另外，即使针对流行毒株开发的疫苗，也仅是针对其中一个亚型，而我国的PEDV流行毒株分为GⅡa和GⅡb两个亚型，它们之间也无法实现完全交叉保护[22]。其次，减毒活疫苗可诱导细胞免疫应答，但诱导的抗体水平偏低；灭活疫苗尽管能够诱导较高的抗体水平，但不能诱导细胞免疫应答，因此两种疫苗策略均存在一定的技术局限性。尽管中和抗体在阻止冠状病毒感染方面起到关键作用，细胞免疫在清除病毒感染细胞，延长免疫保护期方面也具有不可或缺的价值，一种优秀的PED疫苗应能够平衡体液和细胞免疫应答，使其相互协助达到最佳免疫保护效果[23]。
mRNA疫苗是近些年兴起的一种新型核酸疫苗，已有针对病毒的mRNA疫苗获批上市，目前还有多个病原的mRNA候选疫苗处于临床试验阶段[24]。相较传统疫苗，它具有多个优势，包括：(1) 易于设计，可随时根据需要调整疫苗mRNA序列以适应病毒变异；(2) mRNA在细胞质中完成靶抗原的翻译，不进入细胞核，因此相比DNA疫苗安全性更佳；(3) 生产过程不涉及病毒，主要通过体外酶促反应获得，对生产环境的生物安全要求不高；(4) 接种后涉及内源性抗原表达，因此可诱导类似活疫苗的强体液和细胞免疫应答[25]。本研究首次将mRNA疫苗研发策略用于PED疫苗的开发，并证明了其良好的免疫效果。
为了增加PED疫苗的交叉保护能力，考虑到国内目前流行毒株为GⅡ基因型[22]，本研究设计了一种RBD异源二聚体mRNA疫苗，它包含当前流行毒株GⅡa和GⅡb的核心抗原，因此有望实现对不同PEDV毒株感染的广谱免疫保护。另外，本研究发现相比RBD单体，RBD二聚体诱导的抗体水平更高、所需免疫剂量更低，而且同等剂量下诱导的细胞免疫应答也更强，分析认为应该是二聚体的分子量更大，免疫原性更强所致。目前PED疫苗接种多采用两针免疫策略，包括同剂型接种和交叉剂型接种，而交叉剂型接种又分为先用减毒活疫苗初免再用灭活疫苗加强，和先用灭活疫苗初免再用减毒活疫苗加强两种方式。本研究发现，经mRNA单次免疫，小鼠中和抗体平均滴度就可以达到300以上，提示PED mRNA疫苗有望开发成为一种单针疫苗，这将大幅降低疫苗接种成本和免疫强度，而且可有效避免母猪产前接种导致的应激、流产现象。另外，其也可以用于加强免疫，以获得更高水平的中和抗体，因此具有良好的实际应用价值。
综上所述，本研究共制备了2种PED mRNA候选疫苗，证明了RBD二聚体mRNA疫苗具有良好的免疫原性，可诱导小鼠产生高滴度中和抗体和针对PEDV特异细胞免疫应答，而且单针免疫即可获得良好的免疫效果。作为加强针免疫母猪，可获得与灭活疫苗相近的中和抗体水平。本研究为PED mRNA疫苗的进一步临床评价奠定了基础。
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