手性胺是化合物手性中心上连有氨基的一类化合物，广泛存在于自然界各类生命体中(如氨基酸、氨基醇等)，在生命遗传、代谢、生理过程中发挥重要作用。由于具有多样生物活性，手性胺常被作为结构单元，用于医药、农药和其他化工产品的合成。例如，糖尿病治疗药物西他列汀(sitagliptin)、喹诺酮类抗菌药加雷沙星(garenoxacin)、酰胺类除草剂异丙甲草胺(metolachlor)等都含有手性胺结构。开发高效、特异、环保且具有自主知识产权的手性胺合成技术，对我国医药、农药、材料产业发展具有重要意义。

目前，手性胺合成可通过3种方式进行：化学合成、动力学拆分、不对称生物催化合成。一般来说，化学法具有较好的通用性和可放大性，但往往存在反应步骤多、立体选择性受限、催化成本较高及重金属污染等问题；而利用化学或生物催化剂进行动力学拆分，虽能实现单一对映异构体的分离，但无法突破最高50%理论收率的限制。相比之下，利用ω-转氨酶(ω-transaminase, ωTA)底物范围广、立体选择性高的特点，一步不对称合成手性胺，兼具了反应条件温和、转化效率高、产品构型纯的优点，在手性胺合成工业中展现了巨大应用前景。ωTA成功应用于西他列汀的商业化生产，是该领域一个经典案例^[1]。与化学合成相比，该方法将单位生产效率提高了53%，总废弃物降低了19%，生产工艺大幅简化。

随着医药市场对手性胺类药物需求的不断增加以及医药合成工业对高效、绿色生产工艺要求的提升，我国基于ωTA的手性胺生物合成技术研究不断加强。基于incoPat专利数据库信息，2012年及以前ω-转氨酶相关中国专利均由国外机构申请。2013年起，由我国机构申请的ωTA相关中国专利数量迅速增加(图 1)。截至2022年10月，相关公开专利累计超过120项。本文对2013年以来我国机构报道的ωTA相关中国专利进行了系统分析，分别从ωTA资源开发、酶性能的蛋白工程改造、在手性胺合成中应用现状以及催化转化技术工艺等方面进行了总结，以期为ωTA基础理论研究的深入和相关应用技术的推广提供参考。

1 专利数据范围

本文以“ω-转氨酶”为关键词在incoPat专利数据库中对近10年来的中国专利进行检索(申请日时间范围设为“2012.01.01以后”，国别设置为“中国”，检索日为2022.10.14)，共获得165项公开记录，其中以我国机构为申请主体的记录为124项。经过对授权信息去重，剩余记录82项，其中42项专利获得授权，占总申请数的51% (附表S1，国家微生物科学数据中心，登录号：NMDCX0000176)。

2 ωTA资源的应用、开发现状 2.1 ωTA基本性质

ωTA属于5′-磷酸吡哆醛(pyridoxal-5'-phosphate, PLP)依赖型转移酶，可立体特异性催化氨基在氨基供体(如氨基酸、烷胺、芳香胺等)和羰基化合物(如醛、酮、酮酸等)之间的可逆转移。反应以PLP为辅酶，通过双底物乒乓机制进行^[2]。简单而言(图 2)，在ωTA作用下，来自氨基供体的氨基首先转移到PLP的羰基上，形成5′-磷酸吡哆胺(pyridoxamine-5'-phosphate, PMP)及相应的酮基副产物；随后，PMP将氨基转移至氨基受体上，生成目标手性胺，并释放PLP。这种转氨反应不受氨基在供体或受体位置上的限制，适合不同结构手性胺的催化合成。然而对一个具体对象而言，不同来源ωTA在底物识别偏好、催化效率上往往具有较大差异。因此，根据化合物结构和性质特点，选择合适的ωTA催化剂，是实现手性胺高效合成的关键。

2.2 ωTA资源的应用

本文概述专利涉及至少50种不同ωTA (不含重组体、突变体)，其中具有明确序列信息的为47种(附表S2，国家微生物科学数据中心，登录号：NMDCX0000176)。这些转氨酶来自至少47个物种，绝大部分为微生物源(46种)，仅有的一例例外为拟南芥的γ-氨基丁酸转氨酶(CN114574417A^[3])。立体选择性方面，具有R、S型ω-转氨酶约各占一半。在本文概述的82项专利中，至少33项涉及4个被广泛研究的ωTA，即节杆菌(Arthrobacter sp.)来源的AbTA (源蛋白登录号3WWH_A)、土曲霉(Aspergillus terreus)来源的AtTA (源蛋白登录号4CE5_A)、紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)来源的CvTA (源蛋白登录号WP_011135573.1)和河流弧菌(Vibrio fluvialis)来源的VfTA (源蛋白登录号AEA39183.1)。

AbTA是目前被研究较多的一个R型ωTA，最早由日本学者从Arthrobacter sp. KNK168中鉴定^[4]。该酶对氨基供体具有R型立体选择性，可催化多种甲基酮类化合物(尤其是环型或芳香型化合物，如3, 4-二甲氧基苯丙酮、3-羟基苯乙酮)的胺化，在R型手性胺合成中具有重要应用价值^[5-7]。在本文6项相关专利中(附表S2)，AbTA及其突变体被成功应用于多种脂环型和芳香型手性胺的合成。例如，专利CN107686852A^[8]、CN106399418A/B^[9]报道了AbTA突变体在吡咯烷胺类化合物(如莫西沙星中间体)催化合成中的应用，产品纯度(e.e.)达到99%以上；在优化条件下，后者实现了99.8%的高转化效率。此外，专利CN103865964A利用AbTA突变体，也成功实现了从哌啶酮到(R)-哌啶胺的转化，产品纯度(e.e.)可达99%，收率达80%以上^[10]。以上结果表明，AbTA及其衍生体酶在吡咯烷胺、哌啶胺类药物中间体的生物合成中，具有良好应用前景。

AtTA为另一个被广泛关注的R型转氨酶。该酶由Höhne等^[11]通过生物信息学分析方法发现并鉴定。AtTA为同源二聚体，单体由325个氨基酸组成^[12]。该酶对较大结构脂肪族底物(链长至少达到6个碳)具有催化偏好，而相同条件下对芳香型底物的催化效率则明显降低^[13]，表明该酶更适合脂肪型手性胺的生物合成。在本文分析中，AtTA相关专利共18项(附表S2)，全部聚焦于AtTA的蛋白质工程改造，以提升其酶学性能。其中12项(即CN114134128A^[14]、CN112481230A/B^[15]、CN114107241A^[16]、CN114181918A^[17]、CN112359030A^[18]、CN111826362A/B^[19]、CN110144335A/B^[20]、CN109486778A/B^[21]、CN108913671A/B^[22]、CN107058256A/B^[23]、CN105950581A/B^[24]、CN105441404A/B^[25])关注该酶的热稳定性，多个热稳定性明显提升的AtTA突变体被成功构建(半衰期提高了至少207倍，半失活温度最高提高了13.7 ℃)，为该酶的工业化应用奠定了良好基础。此外，通过定点突变和DNA重组技术，多个催化性能明显提升的AtTA衍生体也被构建。它们在多种芳香型手性胺药物中间体{如(R)-2, 3-二氯苯乙胺、(R)-2, 5-二氯苯乙胺、(R)-1-[3-氨基-4-(2, 4, 5-三氟苯基)丁酰基}吡咯-3-酮合成中展现了应用潜力。

CvTA是来自C. violaceum的一个S型ωTA，于2007年由Kaulmann等^[26]鉴定。对蛋白的性质及结构分析表明，该蛋白为一个同源二聚体，单体由459个氨基酸组成。该酶对芳香型氨基供体(如苯甲胺、甲基苄胺、1-氨基茚满)和多种醛酮氨基受体(如乙醛酸、丙酮酸、苯甲醛)都具有良好的催化能力，在37 ℃、pH 8.3条件下表现最佳催化性能^[26-28]。本文分析中，7项专利(附表S2)报道了CvTA的应用研究。通过对该酶36个位点的饱和突变，专利CN108048419A/B^[29]、CN112094830A^[30]成功筛选获得溶剂[如二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)]耐受能力明显提升的突变体，部分突变体(如V379T-R416A-C418S-F89Y)对哌啶酮类底物展现了更高的催化效率，展现出其在该类手性胺工业合成应用中的潜力。此外，CvTA及其突变体在多酶偶联催化合成羟基酪醇、尼龙12单体、1, 2-氨基醇(CN114574417A^[3]、CN110643555A^[31]、CN109321509A/B^[32])及酶固定化技术开发中(CN111117996A^[33])也得到了应用。

VfTA为一个同源二聚体蛋白，也是近年来被广泛研究的S型ωTA，于2003年由韩国学者从V. fluvialis中鉴定^[34-38]。尽管该酶具有高立体选择性以及对芳香型胺(如(S)-甲基苄胺、(S)-1-甲基-3-苯基丙胺、(S)-1-氨基茚满、(S)-苯乙酰甲醇)的高催化活性，其较窄的底物范围在一定程度上限制了该酶的应用。通过对关键活性区的改造，VfTA突变体对脂肪型氨基供体催化能力大幅提升，极大扩展了该酶在手性胺生物合成中的应用范围^[39-40]。在专利CN109321509A/B中^[32]，作者将VfTA与环氧化物水解酶、醇脱氢酶、谷氨酸脱氢酶在大肠杆菌(Escherichia coli)中共表达，通过多酶偶联催化实现了多种1, 2-氨基醇类化合物的合成；在专利CN106399418A/B中^[9]，VfTA被用于莫西沙星侧链的生物合成。

除上述4个被广泛关注的ωTA，多个已被功能鉴定的ωTA也在专利中被应用，包括了来自如柠檬色节杆菌(Arthrobacter citreus)的AcTA^[41]、人苍白杆菌(Ochrobactrum anthropi)的OaTA^[42]、Neosartorya fischeri的NfTA^{[11, 43]}、海王生丝单胞菌(Hyphomonas neptunium)的HnTA^[11]、Gibberella zeae的GzTA^[11]、异物外瓶霉(Exophiala xenobiotica)的ExTA^[44]、Mesorhizobium japonicum的MjTA^[11]、Mycobacterium vanbaalenii的MvTA^[11]中的一些种类(附表S2)。它们在酶固定化技术开发、酶学性质改造及L-2-氨基丁酸、西他列汀前体等手性胺的生物合成中得到了应用。

2.3 ωTA资源的开发

ωTA资源的不断开发是推动其应用的基础，通过活性分析、序列比对、关键功能域及结构分析等手段，人们已鉴定了多种ωTA^[45]。除了上述性质已知、功能明确的ωTA，本文专利也对新型ωTA资源进行了开发。针对自然界中R型ωTA资源丰度远低于S型的客观情况，专利CN104630170A^[46]、CN104630171A^[47]分别从里氏木霉(Trichoderma reesei)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)克隆鉴定了2种新型ωTA (附表S2, TrTA, FoTA)。新酶不仅表现出严格的R型选择性，还在底物谱上表现了宽广的适用范围(可催化多种芳香胺、脂肪胺)，因此具有优良的应用潜力。针对西他列汀生物法合成过程中酶催化剂资源及相关生产技术被国外专利垄断的现状，CN110951706A/B^[48]、CN110904066A/B^[49]、CN111534494A/B^[50]、CN111411094A/B^[51]、CN111518783A/B^[52]、CN111411095A/B^[53]等系列专利利用生物信息学技术，从公开数据库中挖掘了来自Mycolicibacterium goodii (MgTA)、Capronia epimyces (CeTA)、Microbacterium sp.、Sciscionella marina (SmTA)、Sinirhodobacter hungdaonensis (ShTA)、Actinobacteria sp.等的多个立体特异性R型ωTA，并通过突变改造和片段重组，成功将上述新型ωTA用于西他列汀的催化合成。此外，专利CN109402188^[54]也从短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)中鉴定一个新的R型ωTA (BpTA)，该酶表现出了良好的pH稳定性及热稳定性。在S型ωTA方面，王华磊等(CN106520719A/B)从土壤宏基因组中，成功挖掘并表征一种ωTA (ATA-W12)^[55-56]。该酶对哌啶酮类底物有较好催化活性，优化条件下可在8 h内将500 mmol/L N-boc-3-哌啶酮转化为(S)-N-boc-3-氨基哌啶，转化率高达100%，展现出该酶在哌啶胺类药物前体合成中巨大的应用潜力。此外，罗玮等^[57] (CN112680487A)通过序列分析与比对，从泛营养副球菌(Paracoccus pantotrophus)中获得一种对芳香族胺具有高效催化能力的新型ωTA (PpTA)，进一步扩充了S型ωTA工具资源。

3 ωTA的蛋白工程改造

尽管ωTA具有种类多、催化多样性高、特异性强的特点，但由于其在稳定性、底物选择性、催化效率等方面的原因，野生型ωTA常常难以满足手性胺工业化生产需求。利用多种非理性、(半)理性策略对ωTA进行蛋白工程改造，是提升ωTA性能及应用潜力的有效途径^[58]。本文分析中，半数以上的专利(附表S1)报道了对ωTA的蛋白工程改造。除了随机突变、迭代饱和突变、DNA重组等手段，多种生物信息学技术(如序列一致性分析、共进化网络分析、祖先序列重建分析)和计算生物学技术(如分子对接、分子动力学模拟、B-因子结合能量优化分析、二硫键引入分析、蛋白表面电荷互作能分析)也被应用其中。

3.1 基于非理性设计的改造

在蛋白背景信息欠缺的情况下，基于随机突变的改造策略是提高目标酶性能一种有效方法。在L-2-氨基丁酸的合成中(CN105441403A/B^[59])，研究者对3种不同来源的ωTA进行随机突变，成功筛选获得了一系列酶活提高的突变体。其中，一个来源于O. anthropi的双突变体酶(V154G-G229C)，其催化生产L-2-氨基丁酸的能力较野生型酶提高了3.7倍。在对药物中间体(R)-2-(氨乙基)-4-氯苯酚的生物合成中(CN111996222A^[60])，研究者对稳定伯克霍尔德氏菌(Burkholderia stabilis)来源的ωTA进行随机突变及组合突变改造，通过对约20 000个克隆的高通量筛选，也成功获得数个酶稳定性和活性提升的突变体，提高了目标ωTA的应用潜力。

3.2 基于理性、半理性设计的改造

由于随机突变策略对筛选方法及工作强度有着较高要求，多数研究采用了理性、半理性设计策略对ωTA进行改造。例如，在近期L-2-氨基丁酸生物合成技术开发中(CN114540441A^[61])，研究者采用分子对接技术对上述O. anthropi来源ωTA (OaTA)与底物之间的结合关系进行了分析，聚焦到6个改造位点，并利用组合突变快速获得了一个活性提高3.2倍的突变体(L57C-M419I)，有效提升了改造效率。利用类似方法(同源建模结合分子对接)，专利CN113215123A对新近发现的S型ωTA (ATA-W12)的4个目标位点进行单点突变，突变体酶对1-boc-3-哌啶酮和1-boc-3-吡咯烷酮底物的催化活性大幅提升，较野生型酶分别提高了10.4倍和5.5倍，在吡咯烷胺、哌啶胺类药物中间体的生物合成中展现很高的应用价值^[62]。此外，在西他列汀合成技术开发中(表 1)，针对西他列汀前体酮底物结构大、难识别的特点，研究者综合利用同源建模、分子对接、DNA重组、迭代饱和突变等技术，对ωTA底物识别、催化性能进行改造，成功赋予目标酶对西他列汀前体酮(或前体酮类似物)的催化能力，并将该能力提高到785.2 U/g的水平。突变体酶在1 000 mmol/L前体酮底物条件下催化30 h，达到了96.4%的高转化率。该成果在催化浓度和效率上均超过Merck和Codexis公司报道水平(492 mmol/L底物、92%转化率)，对国产化西他列汀生物合成技术具有重要意义。

除了上述底物选择性和催化效率，ωTA稳定性也是其在工业应用中需要考虑的重要性能，对于高效稳定生产及催化剂成本控制都具有重要意义。多项专利报道了对AtTA热稳定性的改造提升(表 2)。基于多种生物信息学及计算生物学分析(如序列一致性分析、共进化网络分析、祖先序列重建分析、分子对接、分子动力学模拟、B-因子结合能量优化分析、二硫键引入分析、蛋白表面电荷互作能分析)并结合定点突变、组合突变、迭代饱和突变等，野生型AtTA的热稳定性及酶活得到明显提高。例如，基于祖先序列重建分析获得的一个多点突变体，其半失活温度较野生型提高了11.1 ℃，半衰期超过1 440 min，为野生型酶的207倍以上。

4 ωTA的应用 4.1 在不对称生物合成中的应用

作为一类酶，ωTA具有广泛的底物选择性。通过选择合适的酶种类，ωTA能够实现对多种不同性质、结构特点手性胺的高效、特异性合成。在本文分析中，具有不同催化性能的ωTA已在多种医药、农药、材料手性胺的不对称生物合成中得到应用，并展现出良好的前景(表 3，图 3)。

西他列汀(商品名Januvia^®)是美国Merck与Codexis公司于2006年推向市场的一种二肽基肽酶-4 (dipeptidyl peptidase-4, DPP-4)抑制剂型降糖药。由于功效显著，西他列汀在Ⅱ型糖尿病防治中被广泛使用，2016年全球销售额超过60亿美元^[93]。该药于2017年被纳入我国国家基本医疗保险药品目录^[94]。利用高效ωTA催化西他列汀前体酮一步转化为西他列汀，是该药合成的关键步骤，相关酶剂及生产工艺被国外公司专利垄断。因此，开发我国具有自主知识产权的ωTA酶剂及生产工艺对突破国外技术壁垒，实现西他列汀合成技术的国产化具有重要意义。西他列汀前体酮具有较大的分子结构，找到能高效识别并催化该结构的ωTA是研究的一大难点。本文统计中，至少9项专利致力于相关技术的研发。专利CN110540975A/B^[64]、CN110951706A/B^[48]、CN110904066A/B^[49]、CN111411094A/B^[51]、CN111534494A/B^[50]、CN111411095A/B^[53]、CN111518783A/B^[52]通过基因挖掘，获得多个具有西他列汀前体酮(或其截短体酮类似物)催化能力的ωTA，并通过定点突变和DNA重组技术，进一步提高了酶活力及溶剂耐受性能。利用重组菌细胞为催化剂，研究者最终在1 mol/L前体酮底物、50% DMSO条件下，实现了97.4%的高转化效率，产品e.e.值高达99%以上。上述研究为西他列汀生物合成技术国产化奠定了坚实基础。除西他列汀外，很多ωTA也被用于喹诺酮类抗菌药物(如西他沙星、莫西沙星、贝西沙星)生物合成中，用来催化各类手性吡咯烷胺中间体的合成。例如，来自江南大学的系列专利(CN109456952A/B^[67]、CN109468297A/B^[68]、CN109486783A/B^[69]、CN109486784A/B^[70])对一个源于B. pumilus W3的ωTA进行蛋白工程改造，获得多个高活性突变体，它们均能有效催化西他沙星中间体(S)-5-苄基-5-氮杂螺[2.4]庚烷-7-胺与5-苄基-5-氮杂螺[2.4]庚烷-7-酮之间的转化，展现出其在西他沙星五元环中间体(S)-5-苄基-5-氮杂螺[2.4]庚烷-7-胺不对称合成中的应用价值。又如，专利CN106399418A/B^[9]、CN107686852A^[8]利用Arthrobacter sp.来源的ωTA，可将不同基团保护的4-(3-氯丙基)-3-吡咯烷酮高效地转化为相应吡咯烷胺。经条件优化，专利CN106399418A/B在约100 g/L的底物(3-(3-氯丙基)-4-羰基吡咯烷-1-甲酸苯甲酯)浓度下利用ωTA催化24 h，实现了99.8%的高转化率，产品纯度(e.e.)达到99.9%^[9]。除上述化合物外，ωTA也被用于催化L-2-氨基丁酸、(R)-2, 3(或2, 5)-二氯苯乙胺、(S)-1-苯丙胺、(R)-2-(氨乙基)-4-氯苯酚、(R)-2-(1-氨基乙基)-4-氟苯胺、(R)-N1, N1-二乙基-1, 4-戊二胺等多种手性胺药物中间体的生物合成。

在农药合成方面，专利CN114134126A报道了除草剂农药中间体(S)-1-甲氧基-2-丙胺的生物合成^[82]。(S)-1-甲氧基-2-丙胺是合成氯乙酰胺类除草剂——异丙甲草胺、二甲噻草胺的手性中间体。研究者通过对20种不同来源ωTA的筛选，成功获得一种来自Bacillus sp. Soil 768 D1的S型ωTA，可将1-甲氧基-2-丙酮高效转化为(S)-1-甲氧基-2-丙胺。利用高酶活突变体，作者以全细胞为催化剂，异丙胺为氨基供体，在700 mmol/L底物浓度(约62 g/L)条件下反应96 h，实现了85.1%的高转化效率，产品纯度(e.e.)达到99.8%。

在材料合成方面，专利CN109824629A将酶法与化学法相结合，利用来自虾蟹壳废弃物提取的N-乙酰-d-葡萄糖为原料，制备获得聚酰胺单体材料——3-氨基-5-(α-氨基乙基)-四氢呋喃^[85]。在上述过程中，对于从中间体3-乙酰氨基-5-乙酰呋喃到3-乙酰氨基-5-(α-氨基乙基)-呋喃的转化，作者利用多种ωTA成功实现了催化。反应产物通过脱乙酰酶脱去酰基，并进一步化学催化加氢，最终获得二元胺产品。该方法利用天然废弃物为原料，通过酶法催化实现了重要中间体的绿色合成，代表了生物基聚酰胺材料合成新的发展方向。

4.2 在动力学拆分中的应用

一般来说，ωTA对氨基供体具有严格的立体选择性。基于这一特点，利用ωTA对手性胺外消旋体进行动力学拆分，也是获得手性胺产品的一条途径。与不对称生物合成相比，ωTA在动力学拆分中的应用较为有限，相关专利报道了其在(R)-3-氨基正丁醇和L-草铵膦合成中的应用(表 3)。(R)-3-氨基正丁醇是合成抗艾滋病药物度鲁特韦的中间体，现有的化学、酶法合成技术中仍存在反应原料贵、反应浓度低、转化不稳定的问题。专利CN110358804A/B通过对8种不同S型ωTA的筛选，获得了4种对3-氨基正丁醇具有高效转化能力的ωTA^[89]。来源于Brucella neotomae的ωTA (BnTA)在100 g/L 3-氨基正丁醇外消旋体条件下，经过16 h反应，实现了99.55%的R型产品纯度(e.e.)，表明(S)-3-氨基正丁醇几乎被完全转化。草铵膦是目前被广泛使用的一类广谱型除草剂，其两种光学异构体(d型和l型)中仅有l型具有植物毒性。专利CN112553285A利用一种Bacillus sp. YM-1来源的R型ωTA，特异性地将d-草铵膦转化为2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸^[88]。通过进一步偶联谷氨酸脱氢酶，将产物转化为L-草铵膦，并在醇脱氢酶的帮助下，实现辅酶与氨基供体(丙酮)的再生。整条路线实现了草铵膦消旋体的原位去消旋化，大幅提高了原料的利用率，最终获得的光学纯度≥85%的L-草铵膦产品，建立了生物酶法拆分合成L-草铵膦的技术路线。

4.3 在酶偶联催化中的应用

在ωTA具体应用中，经常会出现产物(或副产物)积累所带来的反应平衡受限问题，大大降低了目标反应转化效率。通过多酶偶联策略，将ωTA与其他生物酶组合使用，不仅能够有效消除产物(或副产物)积累所带来的抑制效应，促进反应平衡的正向进行，还能进一步拓宽ωTA的合成应用范围，合成多种类型产品。

丙氨酸和异丙胺价格便宜、适用性广，经常作为氨基供体在ωTA催化反应中使用。移除反应生成的丙酮酸或丙酮副产物，是提高反应转化效率的有效途径。很多文献报道了利用乳酸脱氢酶^{[13, 95]}、丙酮酸脱羧酶^[96]、氨基酸氧化酶^[97]、醇脱氢酶^[98]等来实现这一目的。本文分析中，专利CN111454971A使用甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶的组合来移除丙酮酸副产物，并辅以甲酸脱氢酶进行甲酸产物的继续去除和辅酶再生，有效提高了底物酮的转化效率^[99]。此外，专利CN114457125A在利用异丙胺为氨基供体合成(R)-1-[3, 5-双(三氟甲基)苯基]乙胺的过程中，将ωTA与醇脱氢酶偶联^[92]。醇脱氢酶不仅将副产物丙酮转化为丙醇，同时还利用助溶剂(乙醇)为底物进行反应，实现了辅酶NADH的再生，目标反应转化率由82.96%提高到99.9%。

除了手性胺的合成，通过酶联反应，ωTA也被应用到氨基醇、氨基酸、羟基酪醇等物质的合成中。1, 2-氨基醇是一类重要的药物中间体，可用来合成拉洛来静(抗心绞痛药)、美托洛尔(心血管药)、奈必洛尔(心血管药)等。通过构建基因工程大肠杆菌，将环氧化物水解酶、醇脱氢酶、ωTA和谷氨酸脱氢酶在细胞内共表达，研究者(CN109321509A/B)成功利用全细胞一步催化环氧化物底物合成1, 2-氨基醇类化合物^[32]。在100 mmol/L环氧苯乙烷底物浓度下，转化效率可达96.5%。该方法具有较好的通用性，同样适用于环氧丙烷、环氧丁烷等底物的转化。在氨基酸的合成中，专利CN114107408A将甲醇脱氢酶、醛缩酶与ωTA偶联，成功将甲醇、丙酮酸转化为高丝氨酸；继续偶联高丝氨酸激酶和苏氨酸合成酶，还能进一步将高丝氨酸转化为苏氨酸^[91]。上述反应既可在体外体系中进行，也能在细胞内催化。该多酶体系的成功构建，不仅建立了一种新的高丝氨酸和苏氨酸非天然生物合成途径，还实现了将高能密度的甲醇引入氨基酸合成的途径，理论上可实现200%的糖酸摩尔转化率，具有极大的应用前景。此外，含有ωTA的酶联体系也被应用于羟基酪醇(CN114574417A^[3])、尼龙12单体(CN110643555A^[31])的生物合成中。

5 ωTA的固定化应用

在ωTA催化应用中，往往需要添加有机溶剂以帮助底物溶解。有机溶剂的使用容易导致酶催化剂失活，在一定程度上提高了酶剂的使用成本。此外，酶蛋白及其他细胞杂质如果不能从反应体系中有效分离，也会导致产物萃取时严重的乳化现象，增加产品分离纯化难度，降低产品纯度。

为了解决上述问题，已有专利将多种酶固定化技术应用于ωTA。丰亚辉等^[72] (CN110129306A)尝试将ωTA固定在4种不同固定化载体上(环氧树脂、氨基载体树脂、吸附载体树脂、离子交换树脂)，均获得了高效的固定化酶。经环氧树脂固定化后，固定化酶比活为游离酶的91%，可在55 ℃下连续使用15次，批次反应转化率保持在90%以上，展现出优良的稳定性及连续使用性能。专利CN111647634A利用乙二胺对环氧树脂载体进行修饰，获得性能提升的氨基-环氧树脂载体^[100]。用该载体对ATA-W12酶进行固定化处理，酶活回收率达到75%。固定化酶在4 ℃保存30 d后没有明显活性损失，并在重复使用20次后仍然保留了85%的活性，并成功应用于连续流反应体系。对于多酶体系，专利CN110540938A开发了一种有序定向共固定的方法^[101]。该方法将长链醇氧化酶与ωTA用硝酸锌、2-甲基咪唑固定，固定化酶进一步分别固定于微孔滤膜上，并按反应顺序组装到渗透汽化膜组件中，形成有序的共固定酶膜反应器。这种组合方式不仅增强了酶的稳定性，还将反应与分离过程一体化，利于酶联体系的高效运行。

6 总结与展望

经过近10年的发展，我国利用ωTA进行手性胺及其衍生物的生物合成已取得长足发展。无论在新酶资源挖掘、酶性质的蛋白工程改造，还是在生物合成应用、催化工艺技术完善方面均取得一系列具有应用潜力的成果。但与广大的绿色生产需求相比，目前真正实现规模化生产应用的案例仍极为有限。继续开发具有自主知识产权的高效ωTA催化剂及应用技术，仍是需要继续发展的方向。在新型高效酶资源的开发中，蛋白质工程策略已展现出强大的定向改造能力，是获取目标性能ωTA的重要手段。继续加强对酶基础性质、催化特性及结构特征的解析，结合多种生物信息学、计算生物学技术来进行理性、半理性设计改造，将使酶分子改造更加快速、高效。另一方面，近年来基于生物信息学技术的新酶挖掘策略，也逐渐成为开发新型ωTA资源的重要手段。在1997–2019年鉴定的144种ωTA中^[45]，基于序列同源性比对、特征或关键结构域分析等手段鉴定的ωTA为105种，占总数的73%，获得了大量具有R型催化能力或较大分子结构底物催化能力的新酶资源^{[11, 43, 102]}。因此，将上述两种策略结合使用，将能更高效地推动我国自主知识产权ωTA资源的开发。

尽管我国ωTA相关应用报道较多，但大部分集中于资源及催化技术开发，关于生产工艺过程及规模化放大技术的报道仍十分有限，这限制了ωTA生物合成技术的实际推广使用。加强ωTA下游应用技术开发，同样也是未来需要努力的方向。